Csökkentett neuroinflammáció és jobb funkcionális helyreállítás a traumás agysérülés után profilaktikus étrend-kiegészítéssel egerekben

Jin Yu

1 Gyógyszerésztudományi Tanszék, Gyógyszerészeti Főiskola, University of South Florida, Tampa, FL 33620, USA; ude.fsu.htlaeh@uynij (J.Y.), ude.fsu.htlaeh@uhzgnoh (H.Z.), ude.fsu.htlaeh@sirehat (S. T.), ude.fsu.htlaeh@ydnomw (W.L.M.)

Hong Zhu

Saeid Taheri

William L. hétfő

Stephen Perry

2 NutriFusion®, LLC, Nápoly, FL 34109, USA; moc.tnilaesnoc@yrreps

Mark S. Kindy

3 Molekuláris orvostudományi, molekuláris farmakológiai, élettani és patológiai és sejtbiológiai és neurológiai osztály, Orvostudományi Főiskola, University of South Florida, Tampa, FL 33620, USA

4 James A. Haley VA Orvosi Központ, Tampa, FL 33612, USA

5 Shriners Kórház Gyermekeknek, Tampa, FL 33612, USA

Társított adatok

Absztrakt

1. Bemutatkozás

A traumás agysérülés (TBI) egy külső hatás következménye, amely olyan utakat vált ki, amelyek hozzájárulnak az agy patológiás változásaihoz, amelyek az agy működésének megváltozásához vezetnek [1]. A TBI súlyos egészségügyi probléma, amelyet évente több mint 1,8 millió amerikai érint [2]. A TBI vagy az agyrázkódás gyakori okai nem korlátozódnak a harccal kapcsolatos sérülésekre, hanem leggyakrabban a gépjárművek ütközésével, elesésével, sporttal és támadással járó eseményekből származnak [3]. TBI akkor fordul elő, amikor hirtelen ütés hatására az agy eltalálja a koponyát. Az eredmény enyhe, közepes vagy súlyos agykárosodás lehet, és a jeleket és tüneteket nehéz felismerni [4,5]. Az agyrázkódás vagy a TBI fenntartása változásokhoz vezethet a kognitív képességekben és az érzelmek, a mobilitás, a beszéd és az érzékszervek irányításában [6]. Nem diagnosztizált és kezeletlen TBI óriási hatással lehet az ember gondolkodására és cselekedetére, valamint mentális egészségére.

A TBI kezelésére a mai napig nincsenek megfelelő kezelések. Bár ennek a káros rendellenességnek a terápiája még mindig megfoghatatlan, a transzlációs kutatásban óriási erőfeszítéseket tettek a TBI-t követő klinikai tünetek megértésére és kezelésére [7,8]. Számos tanulmány érintett étrend-kiegészítőket mind az agyi szindrómák megelőzésére, mind kezelésére [9,10,11]. Az omega-3 többszörösen telítetlen zsírsavak (ω-3 PUFA-k) használatát kiterjedten vizsgálták iszkémiás sérülések, Alzheimer- és Parkinson-kór, valamint TBI esetén [12]. Az ω-3 PUFA-val kiegészített étrend-kiegészítés emberekben kimutathatóan biztonságosnak bizonyult, és profilaktikusan hosszú ideig fogyasztható. Ezenkívül úgy tűnik, hogy a táplálkozás a TBI miatti halál jelentős előrejelzője [13]. Az artériás hipotenzió, a hipoxia és az intrakraniális hipertónia megelőzésével együtt ez a kevés terápiás beavatkozás egyike, amely közvetlenül befolyásolhatja a TBI kimenetelét. TBI után a táplálkozás korai megkezdése ajánlott.

A GrandFusion ® (GF) a gyümölcsök és zöldségek keveréke, amelyet jelentős mértékben vitaminokkal és tápanyagokkal egészítenek ki, amelyek képesek csillapítani az agyi ischaemia sérülésének mértékét és korlátozni a stroke számos paraméterét, például gyulladásos markerek és reaktív oxigénfajok, valamint viselkedésbeli változások [14] . Ezenkívül a GF-keverékek javíthatják az öreg patkányok memóriáját és tanulását, valamint javíthatják az antioxidáns enzimek és a jelátviteli utak által közvetített fizikai aktivitást [15,16]. Korábbi kutatások kimutatták, hogy a GF gyulladáscsökkentő, antioxidáns, neuroprotektív és neurogén tulajdonságokkal rendelkezik [14,15].

A jelenlegi tanulmányban az volt a célunk, hogy meghatározzuk a zöldségekben és gyümölcsökben gazdag profilaktikus étrendek hatását a traumás agysérüléssel (TBI) kapcsolatos kimenetelre. Az egereket gyümölcsökkel és zöldségekkel dúsított táplálékkal etették 2 hónapig, majd TBI-nek vetették alá. A vizsgálat célja annak meghatározása volt, hogy ezen táplálék- és fitokémiai anyagok jelenléte korlátozhatja-e a TBI-t követő sérülés mértékét. Az eredmények arról árulkodtak, hogy ezek a diéták képesek voltak csillapítani a TBI által okozott károkat. A viselkedésbeli változásokat, a gyulladást, az elváltozás mennyiségét és a proapoptotikus markereket megvizsgáltuk az étrendben krónikusan kitett egereknél. Végül bebizonyítottuk, hogy az egerek kiegészítése a fokozott étrenddel korlátozta a sérülés mértékét, csökkentette a gyulladást és megváltoztatta a sérülési folyamat szempontjából kritikus utakat. Ezek az adatok azt sugallják, hogy ezek a profilaktikus étrendek befolyásolhatják a TBI-ben tapasztalható markáns változásokat a folyamat lelassítása és az eredmény javítása érdekében.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatkísérletek

A kísérlet előtt 22-25 g tömegű C57BL/6 egereknek (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) szabad hozzáférést biztosítottak élelemhez és vízhez. Az állatok (100 hím egér) a kísérlet kezdetén 10-12 hetesek voltak, és 12 órás világos/sötét ciklusban tartottuk őket (a fény 7:00 órakor világított). Valamennyi állatot randomizáltuk a különböző csoportokba. A TBI előtt az állatokat 2 hónapig normál étrendben vagy normál étrendben etették

Az NF-216 (GrandFusion – Fruit and Veggie # 1 Blend), az NF-316 (GrandFusion – Fruit # 2 Blend) és az NF-416 (GrandFusion – Vegetable # 3 Blend) 2% -os kiegészítése [14,15, 16]. A kiegészítés összetételét lásd az S1 táblázatban. Az állatokat napi kiegészítéssel, naponta egyszer kaptuk. A GrandFusion kiegészítőket a NutriFusion, LLC készítette (www.nutrifusion.com). Az átlagos táplálékbevitel 3,75 ± 0,07 g/nap/egér, az étrendek átlagos fogyasztása 0,08 ± 0,005 g/nap/egér volt. Minden tanulmány jóváhagyta, hogy a Dél-Karolinai Orvostudományi Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága és a Veteránügyi Orvosi Központ. Ez a tanulmány betartotta a Laboratóriumi Állatvédelmi Hivatal által kidolgozott, a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatót.

2.2. TBI sérülés

2.3. Cathepsin B aktivitásvizsgálat

Az agy katepszin B aktivitását a trauma után 2 órával mértük fluorometrikus vizsgálati készlettel, a gyártó leírása szerint (ab65300; Abcam, Cambridge, MA, USA). Röviden, a szöveteket kétszer mostuk jéghideg foszfáttal pufferolt sóoldatban, majd extraháló pufferben homogenizáltuk, a gyártó leírása szerint. 10 perces jégen végzett inkubálás után az extraktumot 10 000 g-vel 5 percig centrifugáljuk, és 50 μl felülúszót azonos térfogatú 2x reakciópufferrel és 2 μl szubsztráttal keverünk össze 96-lyukú mikrolemezen. A lemezeket sötétben, 37 ° C-on tartottuk 1 órán át, és a fluoreszcenciát FLUOstar Optima lemezolvasóval (BMG LABTECH GmbH, Ortenberg, Németország) rögzítettük. A fehérjekoncentrációt a bicinchonininsav vizsgálati módszerrel határoztuk meg (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). A katepszin B aktivitást három példányban mértük, és fluoreszcens egység/fehérje mg-ban fejeztük ki. Az enzimaktivitás meghatározásához az elemzéshez izoláltuk a trauma régióját.

2.4. Cathepsin B és Bax Western Blot elemzések

Az agy katepszin B, Bax és aktin (kontroll) fehérje szintjét 24 órával az álműtét vagy a TBI után határoztuk meg, mivel a katepszin B és a Bax fehérje szintje a TBI után akkor jelentősen megnőtt [17]. Az agykivonat felülúszó frakciójában a katepszin B, a Bax és az aktin relatív szintjét Western-blot segítségével határoztuk meg (poliklonális antitestek: Cathepsin B, sc-13985; Bax, sc-526; β-aktin, sc-130657; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA), a korábban leírtak szerint [18]. A Western blot-sávok relatív intenzitását denzitometriával értékeltük három példányban, mindegyik minta esetében. A denzitometriás elemzést IQTL (Imagequant TL) szoftver (GE Life Sciences, Piscataway, NJ, USA) alkalmazásával végeztük. A fehérje vizsgálatokhoz a teljes elváltozott területet összegyűjtöttük Western blot elemzés céljából. Kontroll vagy ál-állatokban hasonló régiót gyűjtöttünk be.

2.5. ELISA elemzés

A citokinek kvantitatív elemzéséhez ELISA-t alkalmaztunk a tumor nekrózis-faktor α (TNF-α), interleukin-1 β (IL-1 β) vagy transzformáló növekedési faktor β (TGF-β) szintjének mérésére az agyszövetben [ 19]. A citokineket az egér agyából az alábbiak szerint extraháltuk: a fagyasztott hemibrainokat közvetlenül a felhasználás előtt proteáz inhibitor koktélt (Sigma, St Louis, MO, USA) 1: 1000 hígítású szövethomogenizációs pufferbe helyeztük, és politron segítségével homogenizáltuk. A szövetminták szuszpenzióit alikvot részekben osztottuk el, és folyékony nitrogénben lefagyasztva későbbi mérésekhez. Ezután az Invitrogen ELISA készleteket használtuk a gyártó utasításainak megfelelően (Carlsbad, Kalifornia, USA).

2.6. Rotarod assay

Automatizált rotarod-ot (San Diego Instruments, San Diego, CA, USA) alkalmaztunk az egerek vestibulomotoros működésére gyakorolt hatások felmérésére trauma után [20]. A sérülést megelőző napon az egerek két egymást követő kondicionálási kísérleten estek át meghatározott fordulatszámmal (16 fordulat/perc) 60 másodpercig, majd három további kísérletet végeztek gyorsuló forgási sebességgel. Az utóbbi három vizsgálatban a forgó hengerből való átlagos leesési időt az alapváltozás késedelmeként regisztrálták. Sérülés után az egereknek egymást követő napi teszteket hajtottak végre három kísérletben a forgási sebesség felgyorsításával (a vizsgálatok közötti intervallum 15 perc). Feljegyeztük az átlagos késési késést a rúdról. Azoknak az egereknek, amelyek nem tudták megérteni a forgórudat, 0 másodperces késleltetést kaptak. A kísérletező vak volt az állatok csoportjaival kapcsolatban.

2.7. Huzal lógó teszt

A drótfüggesztő berendezés rozsdamentes acélból készült rúdból (50 cm; 2 mm átmérőjű) állt, amely két függőleges támaszon nyugodott és 37 cm-rel magasodott egy sík felület felett. Ezt a tesztet a kísérleti csoportoktól elvakult kutatók által korábban leírt módon hajtották végre [21].

2.8. Rácsos gyaloglás és lábtörés-teszt

A rácsos járási teszt érzékeny a csökkenő motorvezérlés hiányosságaira [22]. Mindegyik egeret egy rozsdamentes acél rácspadlóra (20 × 40 cm, 4 cm 2 szembőséggel) helyezték, 1 m-rel a padló felett. Egy videofelvételen rögzített 1 perces megfigyelési periódus során a teljes lépések számát megszámolták. 1 percen keresztül rögzítették a lábhiba-hibák számát (amikor az állatok rosszul helyezték el az elülső vagy a hátsó végtagot úgy, hogy az átesett a rácson).

2.9. Henger teszt és a Morris vízi labirintus teszt

A hengerpróbát és a Morris Water Maze teszteket a kísérleti csoportoktól elvakult kutatók által korábban leírt módon hajtották végre [23,24]. A hengerpróbán a 20 perces teszt során összesen 20 mozgást rögzítettek. A végső pontszámot a következő képlet alapján határoztuk meg:

Ez a teszt értékeli az elülső karosszéria aszimmetriáját a súlyeltolódás során a függőleges feltárás során, és magas megbízhatóságot nyújt még tapasztalatlan értékelőknél is. Esetenként a nagy hiányú egerek nem mozogtak elég gyakran ahhoz, hogy megfelelő számú függőleges mozgást érjenek el. Jellemzően ezek az egerek időben felépülnek, amikor a tesztet elvégzik. Az elfogultság elkerülése érdekében ezeket az egereket addig nem értékelték, amíg nem tudták elvégezni a tesztet. Ezeket a teszteket a kutatócsoportoktól elvakult kutatók végezték.

2.10. Agyi elváltozás mennyiségi elemzése

Szövettani elemzés történt a viselkedési vizsgálat utolsó napján (a TBI utáni egerek 35. napja), hogy lehetővé tegye a viselkedés korrelációját a patológiával [17]. Az egereket altattuk és transzkardiálisan perfúzióval sóoldattal és 10% pufferolt formalin-foszfát-oldattal, amely 4% paraformaldehidet (PFA) tartalmazott. Az agyakat eltávolítottuk, 24 órán át PFA-ban rögzítettük, és 30% -os szacharózban védettük. A fagyasztott agyszakaszokat (30 μm) kriosztátra vágtuk és üveglemezekre helyeztük. Minden negyedik szakaszt feldolgoztunk immunhisztokémiai analízishez egy véletlenszerű kezdőponttól kezdve a sérült terület előtt. Harminc mikronos metszeteket festettünk hematoxilinnal és eozinnal (H&E), dehidratáltuk és elemzés céljából felhelyeztük őket. Az elváltozások térfogatát minden szakaszban számítógéppel támogatott képelemző rendszerrel határoztuk meg, amely egy Power Macintosh számítógépből (Apple Inc., Cupertino, CA, USA) áll, amely QuickCapture keretfogó kártyával, Hitachi CCD kamerával (Hitachi Kokusai Electric Inc.) van felszerelve., Tokió, Japán) Olympus mikroszkópra (Olympus, Tokió, Japán) és kameraállványra szerelve. A képeket rögzítettük, és a károsodás teljes területét szakaszonként meghatároztuk a National Institutes of Health (NIH) képelemző szoftverével (1.55 v.; NIH, Bethesda, MD, USA), amelyet egyetlen kezelő vakított a kezelés állapotára a minden mérés.

2.11. Az idegsejtek sűrűségének meghatározása

A sejtszámlálást egy Nikon Eclipse E800 fénymikroszkóppal (Nikon Imaging Japan Inc., Tokió, Japán) végeztük, összekapcsolva a StereoInvestigator szoftvercsomaggal (MicroBrightField, Williston, VT, USA) [17]. A neuronális sűrűséget a hippocampus térfogatára számított festett idegsejtek számaként számítottuk az optikai frakcionáló módszerrel, amint azt korábban leírtuk [25, 26, 27]. A számlálás előtt az összes diát kódolták, hogy elkerüljék az elfogultságot. A StereoInvestigator meghatározása szerint szisztematikus véletlenszerű mintavételezéssel három szakaszt (40 μm) választottak el egymástól nyolc szakaszon a hippocampus képződése mentén. Minden szakaszon meghatározták a hippokampusz területét. Csak azokat a sejteket számoltuk meg, amelyek a számláló kereten belül vannak, vagy amelyek átfedik a számláló keret jobb vagy felső határát, és amelyek esetében a magok a fókuszba kerültek, miközben a disszektor magasságában lefelé fókuszáltak. Az agyi elváltozások térfogat-analíziséhez szövetek által létrehozott és H&E-jelölteket alkalmaztunk az idegsejtek sűrűségének meghatározásához.

2.12. Statisztikai analízis

A kísérletek mindegyik csoportban 10 egérből álltak. A statisztikai elemzéseket és az adatok grafikonozását tudományos adatok elemzésére tervezett számítógépes szoftverek felhasználásával (GraphPad Prism 4; GraphPad Software Inc., La Jolla, Kalifornia, USA) végeztük. A kvantitatív adatokat az egyirányú varianciaanalízissel meghatározott átlag átlagaként és az átlagok közötti különbségekként jelenítettük meg (p 1. ábra). A sérülés előtt minden csoportnak hasonló késési ideje volt (281,2 ± 3,7 mp). Az ál-egerek a tesztelés alatt fenntartották a neuromotoros funkciót. A traumát követő első napon egyedül a TBI egerek látenciaideje 84,5 ± 7,3 volt, ami 70% -kal rövidebb idő, mint a színlelt kontrolloké. A TBI egerek neuromotoros funkciója gyengébb volt a kontrollokhoz képest. A TBI egerek lassan gyógyultak, körülbelül 136,7 ± 9,4 mp-ig. A motoros teljesítményt értékeltük a GF-diétával (GF1, GF2 és GF3) táplált egerek esetében. Általánosságban elmondható, hogy a GF-diétán lévő egereknél lényegesen kevesebb neuromotoros diszfunkció mutatkozott és gyorsabban gyógyultak, mint a TBI-egerek. Az 1. napon a látencia idõk 174,9 ± 16,1 (GF1), 153,5 ± 18,0 (GF2) és 164,7 ± 17,4 (GF3) mp voltak, a TBI egerek szignifikáns 45–52% -kal rövidebb idõvel rendelkeztek, mint a kezelt állatoké. A latens idők a kezelt egereknél a harmadik és a hetedik napon szignifikánsan jobbak voltak, mint a kizárólag TBI egerek. Fontos, hogy ezek az adatok azt sugallják, hogy a sérülés előtt gyümölcsökben és zöldségekben dúsított étrend szignifikánsan csökkentette a TBI okozta neuromotoros diszfunkció súlyosságát, a TBI után 7 nappal majdnem teljes felépüléssel.

A GrandFusion ® (GF) diéták hatása a neuromotoros diszfunkcióra. A neuromotoros diszfunkciót a traumás agysérülés (TBI) utáni hét különböző időpontjaiban értékelték a rotarod assay segítségével a késés és a zuhanás időmérésével, rövidebb idővel nagyobb diszfunkciót tükrözve. Megmutatjuk a színlelt, TBI és TBI plusz GF diéta egerek késési késési idejét. Az egereket normál étrendben vagy 2% GF-el kiegészített étrendben etették. Mindegyik pont az átlag +/− SD (n = 10 per idõpont). * p 2. ábra). Mint az ábrán látható, a CCI után a kognitív teljesítmény jelentősen javult az összes egércsoport esetében. Ezzel szemben a GF-del dúsított étrenden lévő egerek kevesebb kognitív diszfunkciót mutattak, mint a szokásos étrendben. A CCI utáni memóriahiány a rendszeres étrendben lévő egerekben a célnegyedben töltött kevesebb időként fejeződött ki. Ezenkívül nem voltak különbségek az úszási sebességben, ami arra utal, hogy nincs hatással a megnövekedett vagy késleltetett fizikai paraméterekre, de a kognitív funkciók közvetlen változását tükrözi.