Élelemhiány, testsúlycsökkenés és szorongással összefüggő viselkedés patkányokban

Silke Dietze

1 Farmakológiai és Toxikológiai Intézet, Állatorvos-tudományi Kar, Freie Universität Berlin, Koserstr. 20, Berlin 14195, Németország; [email protected] (S.D.); [email protected] (H. F.)

Katarina R. Lees

2 Állatorvos-tudományi és Természettudományi Egyetem, Nottinghami Egyetem, Sutton Bonington Campus, Loughborough LE12 5RD, Egyesült Királyság; moc.liamg@09seelaniratak (K.R.L.); [email protected] (J.-P.V.)

Heidrun Fink

1 Farmakológiai és Toxikológiai Intézet, Állatorvos-tudományi Kar, Freie Universität Berlin, Koserstr. 20, Berlin 14195, Németország; [email protected] (S.D.); [email protected] (H. F.)

Jan Brosda

1 Farmakológiai és Toxikológiai Intézet, Állatorvos-tudományi Kar, Freie Universität Berlin, Koserstr. 20, Berlin 14195, Németország; [email protected] (S.D.); [email protected] (H. F.)

Jörg-Peter Voigt

Absztrakt

Egyszerű összefoglalás

Az élelmiszer-nélkülözési protokollokat gyakran használják a viselkedési vizsgálatok során. Kevés bizonyíték van azonban arra nézve, hogy az élelmiszerhiány mikor veszélyezteti az állatok jólétét. Az állatokkal végzett kísérletek finomítását illetően ez a tanulmány az élelmiszerhiánynak a hím és nőstény patkányok testsúlycsökkenésére és viselkedésére gyakorolt hatásait vizsgálta. Az élelmiszer-nélkülözés utáni viselkedésbeli és motivációs állapotbeli különbség a vizsgálat fő megállapítása. Az adatok rávilágítanak a testre szabott kísérleti kísérletek szükségességére az élelmiszer-nélkülözés állatokra gyakorolt hatásának értékelésére az állattudományban a 3R elvek (pótlás, csökkentés, finomítás) szempontjából.

Absztrakt

1. Bemutatkozás

Ennek a vizsgálatnak az első célja a patkányok maximális testsúlycsökkenésének értékelése volt 16, 24 és 48 órás böjtöt követően. Ezenkívül a korlátozott táplálkozás, vagyis kevesebb étel vagy rövidebb idő biztosítása, amikor élelmiszer állt rendelkezésre, szintén a vizsgálat ezen részébe beletartozott. A korlátozott etetést leginkább hosszú távú kísérleti vizsgálatokban, például operáns kondicionálási eljárásokban [22] vagy toxicitási vizsgálatokban [10] alkalmazzák. Általában pozitív korrelációt feltételezünk az éhezés időtartama és a válaszarány között [23]. Tudomásunk szerint csak néhány tanulmány vizsgálta a korlátozott táplálkozás hatásait a fajspecifikus feltétel nélküli viselkedésre [22,24]. Heiderstadt és munkatársai (2000) a patkányokat olyan szinten táplálták, hogy fenntartsák a kezdeti testtömeg 20% -os csökkenését, és nyílt terepen végzett tesztben fokozott aktivitást tapasztaltak a szérum kortikoszteronszint megnövekedett szintje mellett, a kísérleti időszak kezdete után 37 nappal mérve [ 22].

A súlyos táplálékhiány kísérleti helyzetekben történő felhasználásának kérdését, különös tekintettel a kondicionálásra, már korábban megvitatták [25]. Moran (1975) előadja azt az érvet, miszerint a súlyos táplálékhiány olyan mértékben megváltoztathatja a motivációs állapotot, hogy az zavarja a fajspecifikus viselkedést, és ezáltal több változót a kondicionálás során [25]. Az ilyen motivációs változások tehát zavaró változóvá válhatnak a viselkedési tesztekben, például a tanulás és a memória tesztelésének protokolljaiban. Ez különösen azokra a kísérleti helyzetekre vonatkozik, amikor az alanyok élelemhiányosak, és az ételeket jutalomként használják.

Ezért a jelen tanulmány második célja az élelmiszer-motiváció konfliktushelyzetben kifejtett hatásainak vizsgálata volt, amely nem tartalmazza a kondicionálást és ezáltal csökkenti a változók számát. Ennek érdekében kísérleti felállítást használtunk, amely a neofóbia/szorongás és az éhség közötti konfliktus alapján készült [26]. Célunk az volt, hogy megvizsgáljuk a böjt időtartama és az állat motivációja között a potenciális averzív helyzet leküzdését az étel megszerzése érdekében. A patkány szorongásának kiegyenlítésére az éhség motivációjával módosított nyílt terepi (mOF) tesztet [27], más néven újdonság által indukált hipofágia (NIH) tesztet [28,29] alkalmaztunk. Az mOF-ot laboratóriumunkban széles körben validálták, és konfliktusmodellt képvisel, amely a szorongással kapcsolatos viselkedés érvényes mércéje, mivel az szorongásoldó gyógyszerek ilyen averzív helyzetben stimulálják a táplálékfelvételt [27].

Az állatok érzelmi állapotára gyakorolt lehetséges tartós hatások vizsgálatához patkányoknak tettük ki a szorongással kapcsolatos viselkedés emelt plusz labirintus (EPM) tesztjét. Az EPM-teszt finom és általánosan használt teszt a rágcsálók szorongással kapcsolatos és feltáró magatartásának értékelésére [30]. A tesztet alaposan validálták és értékelték [31,32,33,34]. Kimutatták, hogy a stressz megelőzése jelentős hatással van a szorongással kapcsolatos viselkedés mértékére ebben a tesztben [35,36,37], ami az állapot szorongásának robusztus állati modelljévé teszi [36,38].

Feltételezzük, hogy az ételhiány a testtömeg jelentős csökkenéséhez vezet, amit a szorongással kapcsolatos viselkedés csökkenése kísér az mOF-tesztben, vagyis megnövekedett motiváció táplálkozik averzív környezetben. A viselkedési hatások nagyságának korrelálnia kell az élelmiszerhiány időtartamával.

A rendelkezésre álló tanulmány eredményei új betekintést nyerhetnek a laboratóriumi állatok különböző etetési protokolljainak finomításába, ami következésképpen csökkenti az állatok stresszét és javítja jólétüket a tartás és a kísérleti körülmények között.

2. Kísérleti szakasz

2.1. Állatok

A kísérleteket a német állatvédelmi törvény irányelveinek megfelelően hajtották végre, és a berlini állami hatóság jóváhagyta („Landesamt für Gesundheit und Soziales” (LaGeSo); G 0153/12). Az állatkísérletek etikai elfogadhatósága kulcsfontosságú része az alkalmazásnak, amelyet megvitattak a berlini Freie Universität állatvédelmi tisztviselőjével, majd ezt követően a LaGeSo Berlinet segítő etikai bizottság felülvizsgálta. A 3R koncepciójának megvalósításában rejlő lehetőségeket a jelen tanulmány egyes részei során alaposan kutatták. Minden érintett kísérletező jól képzett és tapasztalt volt a laboratóriumi állatok használatában és viselkedésében.

Összesen 51 naiv hím (n = 25; Ø 440 g ± 30 g) és nőstény (n = 26; Ø 260 g ± 16 g) 5–6 hónapos Wistar patkányokat (Harlan Laboratories, Horst, Hollandia) használtunk. . A kísérleteket megelőzően az állatokat csoportos elhelyezéssel (n = 2–4) a IV típusú Macrolon ketrecekben (59 × 38 × 20 cm, alapterület 1,815 cm 2; Ehret, Wandlitz, Németország) pormentes keményfa ágyneművel ( Higiénikus állatágynemű, J. Rettenmaier & Söhne GmbH und Co. KG, Rosenberg, Németország) standard körülmények között (szobahőmérséklet 22 ± 2 ° C; relatív páratartalom 55% ± 10%), 12 órás világos/sötét ütemezéssel (világít 6:00 órakor). Az otthoni ketreceket rejtekhelyként papírzsebkendők és fémcsövek gazdagították. A kísérletek előtt és alatt a patkányok a szokásos laboratóriumi chow-t kapták, amelyhez hozzászoktak (V153x R/MH: 19% fehérje, 3,3% zsír, 4,9% rost, 6,4% hamu, nyomelemek és vitaminok; ssniff, Soest, Németország) és csapvizet, és minden második napon kezelték és lemérték. Hetente egyszer az otthoni ketreceket egy hivatásos állattartó megtisztította és új ágyneművel látta el. Az Állatok Laboratóriumi Állattudományi Szövetségének (FELASA) ajánlásai szerint az állatok kórokozóktól mentesek voltak, és egészségi állapotukat negyedévente monitorozták.

2.2. Kísérleti terv

2.2.1. Élelmiszer-elvonás és határozott idejű etetési ütemterv

A kezdeti testtömeg-mérés után, amely lehetővé tette számunkra, hogy kizárjunk minden jelentős kiugró értéket, az állatokat véletlenszerűen osztottuk be az öt független kísérleti csoportba, amelyek 16 órás, 24 órás, 48 órás táplálékhiányos (nincs hozzáférés az élelemhez), 4 napos táplálékhoz korlátozás (fix idejű etetés; FF) vagy ad libitum etetés (kontrollcsoport). Tizenhat órával a kísérletek megkezdése előtt a patkányokat rejtekhelyként fémcsövekkel dúsított egyháztartásba (III. Típusú Macrolon ketrecek; szoktatási időszak) vitték át. A fix idejű etetési csoportban az állatok naponta 4 órán át (8: 00–12: 00) kaptak táplálékot négy egymást követő napon keresztül [27]. Az ad libitum táplált kontrollcsoport ugyanazon kezelési eljárásokon ment keresztül (pl. Egy ház, testtömeg mérés). A víz mindenkor szabadon elérhető volt. A kontroll csoport kivételével (öt hím, hat nő) mindegyik csoport öt hímből és öt nőből állt. A csoportok méretét a G * Power 3 számította ki (Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Düsseldorf, Németország) [39].

2.2.2. Testtömeg mérések

A testtömeget az mOF-teszthez viszonyítva közvetlenül az élelmiszer-nélkülözés megkezdése elõtt, és a teszt 5 perces expozícióját követõen, azaz újratáplálás elõtt mértük. A böjt vagy a határozott idejű etetés előtti testsúlyt 100% -ra állítottuk be minden állatra, majd az mOF időpontjában mért testtömegüket ehhez.

2.2.3. Viselkedési kísérletek

Az összes kísérletet zajcsökkentett helyiségben végezték 8: 30–12: 30 óra között. Az állatokat a megfelelő kísérlet megkezdése előtt 1 órán át szoktattuk a szobába. Az egyes patkányok viselkedését számítógépes nyomkövető rendszer (VideoMot 2; TSE-Systems, Bad Homburg, Németország) segítségével rögzítettük és elemeztük. A vizsgálati arénákat Meliseptol®-nal tisztítottuk minden állat között. Az élelemhiányos időszakok ütemezése fokozatosan oszlott meg annak biztosítása érdekében, hogy az egyes kísérleti csoportok állatai egyidejűleg éheztek a viselkedésvizsgálat kezdetén, amelyet az étkezési hiány utolsó órájában hajtottak végre.

2.2.4. Módosított nyílt terepi (mOF) teszt

Az mOF tesztet Rex és munkatársai (1998) [8] leírása szerint hajtottuk végre. Röviden: a patkányokat külön-külön egy erősen megvilágított (350 lux) fehér nyílt mező (100 × 100 × 40 cm) egyik sarkába helyeztük, a nyílt mező közepe felé nézve, ahol ismert étkezési pelletek (standard chow) álltak rendelkezésre. A patkányokat 5 percig figyeltük, és viselkedésüket a következő paraméterek alapján elemeztük: a táplálékfelvétel gyakorisága (csoportonként táplálkozó patkányok% -a), a kezdeti táplálékkal való érintkezés (ek) látenciája, megtett távolság (cm, vízszintes mozgás) és szám (függőleges aktivitás). Minden kísérlet végén az állatokat visszahelyezték háziketreceikbe és ad libitum etetésbe.

2.2.5. Emelt szintű labirintus (EPM) teszt

Huszonnégy órával az mOF-kísérlet befejezése és az újratáplálás után az állatokat EPM segítségével tesztelték a szorongással kapcsolatos viselkedés szempontjából. Az labirintus két nyitott karból (50 × 15 cm) és két zárt karból (50 × 15 × 10 cm) állt, amelyeket egy központi platform (15 × 15 cm; a labirintus magassága: 64 cm) kötött össze. A megvilágítás 250 lux volt a nyitott karok felületén, 60 lux a zárt karokban és 200 lux volt a központi platformon. A patkányokat a nyitott és zárt kar közötti sarok felé néző központi platformra helyeztük, lehetővé téve ezzel az esélyt, hogy beléphessünk e karok egyikébe. Mindegyik állatot 5 percig figyeltük. A szorongásos viselkedéssel kapcsolatos klasszikus paraméterekként rögzítették a nyitott karokba történő belépés számát az összes belépéshez viszonyítva, valamint a nyitott karokban töltött időt. Ezenkívül a teljes megtett távolságot (cm) és az utánpótlás számát is mértük (ezek a paraméterek nem függetlenek az EPM szorongásától). A fejbecsapódások számát a kockázatértékelés paramétereként figyeltük meg.

2.2.6. Adatok bemutatása és elemzése

A táplálékhiány (16 óra, 24 óra, 48 óra), a határozott idejű etetési ütemezés (FF; 4 óra 4 napig) vagy a szabad etetés (kontroll) hatása a spontán aktivitásra a módosított nyílt terepi teszten hím és nőstény patkányokban . Az adatok átlag + S.E.M. A kétirányú ANOVA nemi jelentőséget mutatott, *** p 4. ábra). Azonban a szex jelentős fő hatása a szorongással kapcsolatos paraméterbejegyzésekre és a tárt karokban töltött időre (bejegyzések (%): F1,41 = 7,32, p = 0,01; idő (ek): F1,41 = 10,23, p = 0,003 ) megtalálták. A nőstények ezen paraméterek növekedését mutatták, vagyis gyakrabban látogatták az averzív karokat, ami arra utal, hogy szorongásoldó viselkedésre utal (4.a, b ábra). Bár a takarmányozásnak nem volt általános hatása az EPM viselkedésére, a korábban fix idejű etetésnek kitett nőstény patkányok szignifikáns tendenciát mutattak, mivel kevesebb időt töltöttek az averzív tárt karokon (p = 0,083) (4. ábra b).

4. Megbeszélés

Ebben a vizsgálatban a táplálékhiányból és az élelemkorlátozásból adódó testtömeg-változásokat és az azt követő viselkedésbeli változásokat értékelték patkányokban. Jelenleg korlátozott számú tanulmány elemzi ezeket a paramétereket együtt, ezért a jelen tanulmány célja, hogy átfogóbb képet nyújtson az élelmiszerhiány és az élelmiszer-korlátozás patkányokban gyakorolt hatásairól. A fő megállapítás az, hogy az ételhiány és a határozott idejű táplálás jelentős és nemtől független testsúlycsökkenést okozott, de a viselkedési tesztek során csak egy 48 órás ételhiány volt mérhető hatással. Erre a megállapításra nem számítottak, mert a viselkedési vizsgálatokban széles körben alkalmazzák a 16 és 48 órás megvonási periódusokat [13].

Az itt közölt 48 órás nélkülözési időszakot követő átlagos 8% -os súlyvesztés (a megfigyelt maximum 13% volt egyetlen patkánynál) összhangban van a korábbi jelentésekkel [40,41,42]. Mások azonban magasabb, 15% -os átlagos testsúlycsökkenésről számoltak be Wistar patkányokban, csupán 24 órás nélkülözést követően [43]. Más patkánytörzsekben még nagyobb, akár 18% -os redukcióról számoltak be egy 24 órás böjtöt követően [44,45,46,47]. Így a különféle laboratóriumokban előforduló törzsek és alkatrészek változók lehetnek, amelyek hozzájárulnak a táplálékhiányt követő testsúlycsökkenés mértékéhez. A jelen tanulmányban tapasztalt mérsékelt súlycsökkenést tekintve a kompenzációs vízfogyasztás kizárható, mivel különféle vizsgálatok kimutatták, hogy a testtömeg-csökkenés a 3 és 4 napos nélkülözési időszakokban párosul a csökkent vízfogyasztással [41,48]. Egy másik változó lehet az állat kora, a fiatalabb patkányok nagyobb testsúly-százalékot veszítenek, mint az idősebb patkányok. Ennek bizonyítéka Li és Wassner tanulmányából származik [49], ahol a fiatalabb patkányok 24 órás táplálékhiány után 29% -os testsúlyt vesztettek.

Ezért azt javasoljuk, hogy végezzen kísérleti vizsgálatokat annak biztosítására, hogy a fogyás ne lépje túl a szabályozó testület és/vagy az állatetikai bizottság által az állatok indokolatlan szenvedésének megakadályozása érdekében megállapított megengedett súlycsökkenési határt.

Jelen tanulmány azt sugallja, hogy a testtömeg jelentős csökkenése ellenére az angiogén körülmények közötti táplálkozás motivációja bizonyos mértékű testsúlycsökkenést igényel. Megállapításainak megvitatása a korábbi tanulmányok kontextusában, mind laboratóriumunkból, mind más csoportokból kiderült, hogy ez a szint sokféle tényezőtől függ. Ezért testreszabott kísérleti tanulmányok ajánlottak annak felmérésére, hogy a testsúlycsökkenés mely szintje befolyásolja egy adott kísérleti helyzetben a motivációs állapotot. Ez minimalizálhatná a motivációs állapotokkal való „túlvezetés” miatti káros interferenciákat is, például a kondicionálási kísérletek során. Ezeknek a kísérleti tanulmányoknak az eredménye valóban javíthatja a patkányok jólétét a szükségtelenül hosszú éhomi időszakok elkerülésével.

Vizsgálatunk harmadik része arra a kérdésre irányult, hogy megvédett patkányokban tartós viselkedési következményekhez vezethessen-e egy korábbi táplálékhiányos vagy korlátozott időszak tapasztalata. Fiziológiai változások következnek be az élelmiszerhiányos időszak alatt és után, különösen az etetési időszakban [41]. Sőt, az ételhiány potenciális stresszes esemény. Így beszámoltak arról, hogy 24 órán át tartó, de 6 és 16 órán át tartó akut nélkülözés a plazma kortikoszteronszint emelkedését idézi elő Sprague Dawley patkányokban [62]. Nemcsak az akut táplálékhiány, hanem a krónikus korlátozás is hatással van a plazma hormon több szintjére, a wistari patkányokban és más patkánytörzsekben a kortikoszteron növekedése [19,63], bár az ellentétes eredmények azt sugallják, hogy a wistari patkányokban a kortikoszteron jelentős növekedése nem legalább 5 nap étkezéshiány előtt nem fordulhat elő [64,65].

Vizsgálatunkban csak a rögzített idejű táplált női csoport mutatott ki tartós viselkedési hatásokat az újratáplálást követően, amelyet a szorongással kapcsolatos viselkedés tendenciája fejez ki az EPM-ben. Ez a hatás, ha igaz, ellentmondana azoknak a korábbi megállapításoknak, amelyekben a nőstény Sprague-Dawley patkányok kalória-korlátozási ciklusoknak való kitettsége, majd újratáplálása nem befolyásolta a szorongással kapcsolatos viselkedést [66]. Jelen tanulmány azonban nem zárhatja ki a tartós viselkedési hatásokat, különösen a szorongással közvetlenül nem összefüggő magatartásokban, mivel ezeket itt nem vizsgálták.

A nőknél megfigyelt általános szorongásoldó viselkedés az EPM-en összhangban van a korábbi vizsgálatokkal [67,68,69]. A mozgásszervi aktivitásra gyakorolt nemi hatás ellenére, amely valószínűleg nem független az anksiolízistől, legalábbis az EPM-ben [32], az élelmiszer-hiány és a korlátozás önmagában nem volt hatással a mozgásszervi aktivitásra a megfelelő tesztcsoportokban. Ez egybeesik a korábbi megállapításokkal [70], amelyek Sherman patkányoknál bizonyítják, hogy a mozgásszervi aktivitást nem befolyásolta az élelmiszerhiány, míg a felfedező magatartás egyéb formái nőttek. Hasonlóképpen a Long-Evans patkányokban, az ételhiány nem befolyásolta a mozgásszervi aktivitást [71].

A témával kapcsolatos további vizsgálatok során a kísérleti változók szisztematikus megváltoztatását kell elvégezni, például különböző mértékű nélkülözést és különféle mértékű elfordulást. A stresszhormonok egyidejű mérése, de az otthoni ketrecben tanúsított viselkedés elemzése is segíthet a különböző táplálkozási és nélkülözési ütemek jólétre gyakorolt hatásának további igazolásában.

5. Következtetések

Összegzésként elmondhatjuk, hogy eredményeink hozzájárulhatnak az állatok jólétének javításához a vizsgálati tervek finomításával, amelyek magukban foglalják az élelem korlátozását vagy a kísérleti állatok megfosztását. Az adatok arra utalnak, hogy a fogyás és a táplálkozási motiváció nincs szoros összefüggésben. Eredményeink a kísérleti vizsgálatok mellett szólnak, hogy biztosítsák a jó jólétet a tényleges viselkedési kísérletek során.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönetet mondanak Sabine Jacobs-nak a kiváló technikai segítségért és Wiebke Gentner-nek a kézirat igazolvasásáért.