Gliadin-alapú CD4 + CD45RBlowCD25- T-sejtek gluténfüggő vékonybél károsodást okoznak, miután örökbe adták őket limfopéniás egerekbe.

Teljes szöveg

Idézetek

kapcsolódó cikkek

BioEntities

Külső linkek

Tobias L. Freitag

1 Celiac Center, Div. Gasztroenterológia, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 330 Brookline Avenue, Boston, MA 02215

2. Bakteriológiai és Immunológiai Tanszék, Haartman Intézet, Haartmaninkatu 3, 00014 Helsinki Egyetem, Finnország

Svend Rietdijk

3 Div. immunológia, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 77 Avenue Louis Pasteur, Boston, MA 02215

Yvonne Junker

1 Celiac Center, Div. Gasztroenterológia, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 330 Brookline Avenue, Boston, MA 02215

Jurij Popov

1 Celiac Center, Div. Gasztroenterológia, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 330 Brookline Avenue, Boston, MA 02215

Atul K. Bhan

4 immunopatológiai egység, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 55 Fruit Street, Boston, Massachusetts 02114

Ciaran P. Kelly

1 Celiac Center, Div. Gasztroenterológia, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 330 Brookline Avenue, Boston, MA 02215

Cox Terhorst

3 Div. immunológia, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 77 Avenue Louis Pasteur, Boston, MA 02215

Detlef Schuppan

1 Celiac Center, Div. Gasztroenterológia, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 330 Brookline Avenue, Boston, MA 02215

Társított adatok

Absztrakt

Háttér és célok

A lisztérzékenység (cd) a vékonybél gyakori gyulladásos rendellenessége, amely a gluténreaktív effektor T-sejtek által vezérelt étrendi gluténfehérjék iránti béltűrés megsértéséből ered. Célul tűztük ki a gluténreaktív effektor T-sejtek patogén szerepének felmérését és a glutén által kiváltott enteropathia modelljének létrehozását.

Mód

A CD4 + CD25− T sejtfrakciókat adoptív módon átvittük limfopéniás egerekbe, ami „kiindulási” vékonybélgyulladáshoz vezetett.

Eredmények

Rag1 -/- gliadin-preszenzitizált CD4 + CD45RBlowCD25-T sejtek, de nem CD4 + CD45RBhigh naiv T-sejtek, kevesebb súlyt kaptak és súlyosabb duodenitisben szenvedtek, ha orális gluténnel kezelték őket, mint gluténmentes étrendben részesülők, vagy kontroll (ovalbumin) -érzékenyített T-sejtek. Ez a cd-re jellemző nyálkahártya szövettani jellemzőinek romlásával és a duodenumban és a periférián megnövekedett Th1/Th17 sejtpolarizációval járt. Érdekes módon a gluténmentes étrend újbóli bevezetése súlygyarapodáshoz, a szövettani duodenitis javulásához és a duodenális IFNγ és IL-17 transzkriptumok csökkenéséhez vezetett. Ezenkívül a gliadin-preszenzitizált T-sejtek B-sejt-kompetens meztelen címzettjei csak akkor adtak magas szérum-anti-gliadin IgA-t és IgG1/IgG2c-t, ha orális gluténnel kezelték őket.

Következtetések

A CD4 + T-sejtek gluténnel szembeni immunitása az orális glutén tolerancia és a vékonybél patológiájának megsértéséhez vezet a limfopéniás egerekben, hasonlóan az emberi cd-hez. Ez a modell hasznos lesz a CD patogenezisének tanulmányozásához, de új, nem diétás terápiák teszteléséhez is.

Bevezetés

A lisztérzékenység (cd) gluténérzékeny enteropathia, amelynek prevalenciája 0,5–1% a legtöbb nyugati populációban 1,2. A betegek 90–95% -a hordozza a humán leukocita antigént (HLA-) DQ2, a maradék HLA-DQ8 3-at. A Cd-t az orális glutén (a búza és az ahhoz kapcsolódó gabonafélék tárolófehérjei) expozíció váltja ki, és a glutén-specifikus T-sejtek válaszainak szabályozatlansága jellemzi. A gluténpeptidek bemutatása a CD-hez kapcsolódó HLA II. Osztályú molekulákon a gluténspecifikus CD4 + T helper 1 (Th1) sejtek aktivációjához vezet, amelyek szerepet játszanak a bélpatológiát okozó adaptív immunválasz előidézésében 3,4. A cd vékonybél elváltozásait limfocitákkal történő nyálkahártya-infiltráció, kriptahiány és a villus atrófia határozza meg. 1 .

Mód

Állatok és kezelések

A hím C57BL/6 donor egereket születésüktől kezdve gluténmentes standardizált étrenden (AIN-76A, Research Diets) tartották fenn. Az egereket a –28. Napon (100 μg antigén CFA-ban) és a –14. Napon (50 μg antigént IFA-ban) gliadinnal vagy ovalbuminnal (minden Sigma) immunizáltuk, és az 1. napon felöltük. Rag1 -/- (Jackson Laboratory) és meztelen (Taconic) recipiens egereket (az összes C57BL/6 genetikai hátteret) autoklávozott ketrecekben tartottuk, és a −7. napon besugárzott AIN-76A-ra cseréltük. Az 1. napon súly-egyeztetett hím Rag1 -/- (7–9 hetes) vagy hím meztelen (8–24 hetes) recipiens egerek csoportjait intraperitoneálisan injektáltuk 4,5 × 105 frakcionált lépdonor donor T-sejtekkel 9, 10. A befogadók egyes csoportjait testreszabott, besugárzott étrendre cserélték (AIN-76A, Research Diets alapján), amely kilogrammonként 2,5 g búza-glutént (Sigma) tartalmazott. Feláldozás után vért vettünk, és vékonybélből, vastagbélből, hasnyálmirigyből, tüdőből, májból, veséből és bőrből vett mintákat vettünk szövettani vizsgálat céljából. Valamennyi eljárás jóváhagyását az intézményi állatgondozási és állat-egészségügyi bizottság szerezte (jegyzőkönyv: 043-2005).

T-sejt-frakciók előkészítése az örökbefogadó transzfer kísérletekhez

A nem T-sejteket a donor splenocita szuszpenziókból CD3 + T sejtdúsító oszlopok (R&D) segítségével lemerítettük. A CD4 + CD45RBlowCD25−, CD4 + CD45RBlowCD25 + vagy CD4 + CD45RBhigh T sejteket FACSAria Sorter (BD Biosciences) alkalmazásával 9,10 áramlási citometriával szelektáltuk. A fluoreszcens jelöléshez PE anti-egér CD45RB, PE-Cy5 anti-egér CD4 és FITC anti-egér CD25 (az összes BD biotudományt) alkalmaztunk. A sejtfrakciók> 97% -os tisztaságúak voltak a rendezés utáni elemzés során.

Klinikai és makroszkópos megfigyelések és pontszámok

Boncoláskor feljegyezték a teljes vékonybél súlyát. A vastagbélgyulladás aktivitását klinikailag/makroszkóposan értékeltük, kiszámítva 4 paraméter összegét: Hunching (0–1), pazarlás (0–1), vastagbél megvastagodás (enyhe, közepes, súlyos; 0–3), széklet konzisztencia (normál, lágy, nem képződött, vizes; 0–3); maximális pontszám = 8.

Szövettani elemzések és pontszámok; immunhisztokémia

Citokin ELISA

Az egyes egerekből származó splenocitákat 3 μg/ml anti-CD3 mAb-vel (pozitív kontroll, 145-2C11 klón, eBioscience), 10 μg/ml gliadinnal vagy 10 μg/ml ovalbuminnal (negatív kontroll; mindkettő a Sigma-tól) újra stimuláltuk a teljes RPMI 1640-ben. A citokin koncentrációkat (pg/ml) felülúszókban mértük 48 óra elteltével IFNy, IL-2, IL-4 és IL-10 ELISA készletek (R&D, eBioscience) alkalmazásával. Statisztikai összehasonlítás céljából az egyes gliadin- vagy ovalbumin (negatív kontroll) -stimulált minták citokin-koncentrációit a maximális stimuláció belső standardjára (ugyanazon egér anti-CD3 mAb-vel aktivált splenocitáira) utaltuk.

Kvantitatív RT-PCR

A vékonybélből származó mintákat (0,5 cm-es szegmens, 2 cm-re a pylustól disztálisan) összeszedés közben összegyűjtöttük, és a további elemzés céljából gyorsfagyasztással lefagyasztottuk. A relatív mRNS-transzkriptum szinteket a LightCycler FastStart DNS Master Hybridization Probes kit segítségével LightCycler-en (mind a Roche-tól) használtuk, a TaqMan-elvet alkalmazva, ahogyan azt korábban leírtuk 16. A TaqMan próbákat és primerkészleteket az I. kiegészítő táblázat mutatja be. Az mRNS transzkriptumszinteket második derivált maximumok és belső kalibrációs görbék alkalmazásával számszerűsítettük, normalizáltuk glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) mRNS-re és tetszőleges egységekben fejeztük ki relatív változásokként (x-szeres). ) az egészséges C57BL6 kontrollok átlaga felett vagy arányként.

A gliadin és a szöveti transzglutamináz elleni szérum antitestek meghatározása

Amint azt korábban leírtuk 17, 96 mélyedésű lemezeket vontunk lyukanként 1 μg gliadinnal (Sigma) vagy rekombináns egérszövet transzglutaminázzal (tTG). A szérumokat soros hígításokban vizsgáltuk. Torma peroxidázzal jelölt anti-egér IgA, IgG (mindkét Sigma), IgG1 (Serotec) vagy IgG2c (Bethyl Lab; hígítások 1: 10 000–1: 100 000) után tetrametil-benzidin szubsztrát (Sigma), majd detektálás 450 nm-nél . Antitest titerek a következő képlet alapján számoltuk: (minta OD - vak vak OD) × szérum hígítás. A 20 alatti titkokat negatívnak tekintették.

Statisztikai analízis

Az adatokat a Prism 5 szoftverrel (GraphPad) elemeztük. A testtömeg adatok esetében a p értékek (* p 18 (1a. Ábra). Meglepő módon azok a Rag1 -/- egerek, amelyek gliadin-szenzibilizált donoroktól kaptak örökbefogadó T-sejt transzfert, és gluténnel fertőzöttek voltak (gliadin/gluténcsoport), kevesebb súlyt kaptak, mint egerek, amelyeket gfd-n (gliadin/gfd) tartottak, vagy olyan egereknél, amelyeket orális gluténnel kezeltek, de örökbefogadó transzfereket kaptak a kontrollimmunizált donoroktól (ovalbumin/glutén; (1b. ábra)). Ez arra utalt, hogy a donor T-sejtek a bél gyulladásos betegségének súlyosbodásához vezettek orális gluténnel kezelt Rag1 -/- recipiensekben.

A gfd bevezetése a glutén által kiváltott gyulladásos változások megfordulásához vezet a gliadin-preszenzitizált T-sejtek Rag1 -/- recipienseiben

a) A Rag1 -/- egerek testsúlyának változásai a gliadinnal preszenzitizált CD4 + CD45RBlowCD25− T sejtek átadása után 21,5 hét alatt. Közvetlenül a gfd bevezetése után a 10.5. Héten (↑) az étrend váltó csoportja egyre hízik a gliadin/glutén csoporthoz képest (*** p +++ p 9,20. Fontos, hogy a befogadók mindkét csoportja nem különböznek a következő paraméterek bármelyikében: Testtömeg, vastagbélgyulladás-aktivitási index, a vékonybél és a vastagbél szövettana, valamint az in vitro újra stimulált lépsejtek által kiválasztott citokin-szekréció (az adatokat nem közöljük). Az örökbefogadásra szánt T-sejtek kulcsfontosságúak a gluténérzékeny enteropathia kiváltásában.

A gliadinnal preszenzitizált T-sejtek örökbefogadását követően orális gluténnel fertőzött meztelen egerek szérum gliadin antitesteket termelnek

Az anti-gliadin IgA és IgG szérumszintjét meztelen egér befogadók 2 csoportjában (gliadin/glutén, gliadin/gfd), valamint gluténmentes étrenden nevelt C57BL/6 kontroll egerekben (C57BL/6-gfd) határoztuk meg. ) vagy normál (gluténtartalmú) chow (C57BL/6-glutén; mindegyik n = 8). Az anti-gliadin IgG és az IgA különbségei a gliadin/glutén és minden más csoport között nagyon szignifikánsak voltak (*** p 9,20 csak az orális gluténnel fertőzött befogadóknál, de a gfd-n tartott egereknél nem. A glutén-specifitást tovább igazolták a lényegtelen élelmiszer-antigénnel preszenzitizált naiv T-sejtek vagy memória-T-sejtek befogadóinak hatásának hiánya, és ami fontos, a súlycsökkenés megfordításával, az enteropathia javításával és az immunológiai változások normalizálásával a gfd-re történő áttérés után. a vékonybél hisztológiájában a Thod (és Th17) fokozott polarizációja társult a duodenumban, szorosan utánozva az aktív cd 4,19 betegek nyálkahártyájának citokinmintázatát. Magas szérum anti-gliadin IgA és IgG titerek (beleértve a Th1 -alkotó IgG2c alosztály) meztelen recipiensekben tovább bizonyította a gluténnel szembeni béltolerancia megsértését ebben a modellben.

Az ártalmatlan antigének orális toleranciájának zavara, amelyet általában a bélszabályozó T-sejtek tartanak fenn, autoimmun gyulladásos megbetegedést okoz a bélben 8–10. Ennek megfelelően a szabályozó CD4 + CD25 + T sejteket (Treg) kimerítettük modellünkben, antigénnel tapasztalt CD4 + CD45RBlowCD25-T sejtek FACS szelekciójával gliadinnal immunizált donoroktól. Korábbi beszámolók kimutatták, hogy a naiv donorokból származó CD4 + CD45RBlowCD25-T sejtek (de nem CD4 + CD45RBlowCD25 + T sejtek) kimerítő betegséget okozhatnak a Rag2 -/- egerekben 21, és nem képesek elnyomni a vastagbélgyulladást a CD4 + CD45RBhigh T sejt transzfer modellben . Eredményeink nem bevitt vagy kontrollimmunizált donorokból származó CD4 + CD45RBlowCD25-T sejtek felhasználásával megerősítették ennek a T sejtfrakciónak a belső patogenitását, ami alacsony szintű kiindulási duodenitishez vezetett Rag1 -/- egerekben. A glutén által kiváltott specifikus változásokat ezért gyulladásos háttérrel kellett mérni.

Modellünkben a vékonybél közeli patológiája a duodenitishez hasonlított, amelyet a CD4 + CD45RBhigh T-sejtek adoptív transzferje után észleltek limfopéniás egerekbe 9, 20, általában a Crohn-betegség modelljének tekintették. A patológiát nyálkahártya-infiltráció jellemezte limfocitákkal, kripta hiperplázia és villus atrófia, a CD-re jellemzőnek tekinthető változások, de a neutrofilekkel való beszivárgás is, ami kriptitishez és kriptatályogokhoz vezetett. Míg a kriptatályogok tipikusak a cd-vel szemben, a neutrophil infiltráció a cöliákia vékonybél elváltozásainak jellegzetes jellemzője 24,25. A közelmúltban a cöliákiás betegek biopsziás mintáiban a génexpressziós profilalkotás az aktivált neutrofilek krónikus toborzását tárta fel aktív betegségben vagy remisszióban 26, ami azt jelzi, hogy a neutrofilek (korai) veleszületett immunjeleket szolgáltathatnak a cd kialakulásához 2,27 Érdekes módon a meztelen egerek részben védettek voltak a duodenitis ellen, összehasonlítva a Rag1 -/- recipiensekkel, hasonlóan a kolitisz elleni részleges védelemhez, amelyet a B-sejt-kompetens és nem-kompetens TCRα -/- egereknél figyeltek meg 23, ami valószínűleg a B-sejtek szabályozó funkciójának tulajdonítható.

Ami az adaptív immunitást illeti, a cd-t a glutén-specifikus T-sejt-válaszok diszregulációja jellemzi. A cöliákia autoantigén tTG deamidálhatja a bevitt gluténpeptidek (főként a gliadinek) 17 bizonyos glutamin-maradványait, és ezek a módosított gliadin-peptidek fokozott affinitással kötődnek csak az antigént bemutató sejtek 1,3-as HLA-DQ2 és -DQ8 molekuláihoz. Az eredmény a gliadin-specifikus CD4 + Th1 sejtek aktiválása, amelyet a szabályozó T-sejtek látszólag nem ellenőriztek. Hasonló eredményhez vezetve modellünk a CD4 + CD45RBlowCD25-T sejtek adoptív átvitelén alapul CFA-ban gliadinnal immunizált egerekből, amelyek az egér MHC H2b haplotípusát fejezik ki. Ezért hiányzik a HLA-DQ2- vagy -DQ8-korlátozott (deamidált) gluténpeptid megjelenítésének és a tTG-vel szembeni autoimmunitásának komponensei. Ennek ellenére a modell tovább finomítható cd-asszociált HLA II. Osztályú transzgének bevezetésével.

Oldható antigén táplálása naiv egereknek antigénspecifikus, tolerogén Treg 28,29 indukcióhoz vezet, amely elnyomja a gyomor-bél traktus gyulladásos reakcióit 29. A mai napig egyetlen tanulmány számolt be a T-sejtek által közvetített enteropathia indukciójáról az oldható 30 antigén táplálásával, amely immunmoduláló arachidonsav metabolitok, pl. prosztaglandin E2. Ennek megfelelően valószínűleg mind a tolerogén Treg kimerülése, mind a veleszületett immunrendszer által biztosított kostimulációs gyulladásos jelek szükségesek a gliadin-specifikus memória T-sejtek aktiválásához és a duodenitis későbbi gluténfüggő exacerbációjához. Az előbbit az a megfigyelés is sugallja, hogy a nem frakcionált T-sejtek nem vezetnek bélgyulladáshoz, hasonlóan a CD4 + CD45RBhigh transzfer modellhez, 9,10 .

A takarmányadag

12,5 mg glutén/egér/nap megfelelt az emberi testtömeg-kiigazított gluténbevitel 2,7-szeresének, a

13g glutén/fő/nap Nyugat-Európában 31. Naiv állatoknál az ilyen nagy mennyiségű táplálékfehérje lenyelése orális toleranciához vezetne, amint azt egészséges vagy kolitikus egerek (CD4 + CD45RBhigh modell) 29,32 mutatják, akiket specifikus táplálékfehérjével (ovalbumin) tápláltak, és ez előidézte a szabályozó citokinek termelését. TGFβ1 és IL-10, valamint a Th1 sejtek szuppressziója. Világos ellentétben a gliadinnal alapozott T-sejtek szelektív transzfer stratégiája a diétás gluténnel szembeni tolerancia eltörlését és a nyombél patológiájának fokozódását eredményezte, amelyet IFNγ és IL-17 túlexpressziója jellemzett. Az IFNy és az IL-17 CD4 + T sejtek általi termeléséről nemrégiben beszámoltak az egér gvhd 33-ban. A TGFβ1 és az IL-10 relatív emelkedése az IFNγ transzkriptum szinttel szemben a Rag1 -/- recipiensekben 21,5 vs. 8,5 héten, valamint az IL-17 és az IL-2 kifejezett növekedése az effektor T-sejtek válaszainak fokozott szabályozására utalhat, és esetleg elmozdulás a Th1-től a Th17-citokintermelés felé a duodenitis kronikálása során modellünkben.

Összegzésként bemutatjuk a glutén által kiváltott enteropátia kis állatmodelljét, amely hasonlít az emberi cd-re. Javasoljuk, hogy ez a modell alkalmazható az orális tolerancia és a cd patogenezis mechanizmusainak tanulmányozására, de a cd nem diétás terápiáinak tesztelésére is, amelyek a glutén lenyelés után történő lebontását, semlegesítését vagy nyálkahártya-kizárását célozzák. Ez fontos, mivel 1) a szokásos terápiát, a szigorú gluténmentes étrendet nehéz fenntartani, és 2) az élelmiszerekben rejlő glutén nyomai folyamatos étrendi kockázatokat jelentenek a lisztérzékenységben szenvedők számára. A közelmúltban figyelmet kaptak olyan terápiás megközelítések, mint például az orális 34, 35 enzimterápia vagy a bél gluténfelvételének gátlása. Alkalmazhatóságuk és hatékonyságuk tesztelésének megvalósíthatónak kell lennie ebben az új állatmodellben.

Kiegészítő anyag

suppl adatfájl

Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondunk John Daley-nek és Suzan Lazo-Kallaniannak (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA) a sejtszortírozással kapcsolatos technikai támogatásért, Jessica Zaks és Anisha Y. Sharma az RT-PCR elvégzéséért, valamint Suzanne White, Wendy Dasgupta és Justine Cohen (mind Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA) szövettani és immunhisztokémiai segítségért. Hálásak vagyunk Dr. Daniele Sblattero-nak (Kelet-Piemonti Egyetem, Novara, Olaszország) rekombináns egér tTG biztosításáért.

Finanszírozás:

Ezt a munkát az NIH # 1 R21 DKO73254-01 támogatása támogatta Detlef Schuppan számára.