Haplotípussal megoldott egész genom szekvenálás folytonosságot megőrző transzpozícióval és kombinatorikus indexeléssel

Tárgyak

Absztrakt

A haplotípussal megoldott genomszekvenálás lehetővé teszi az orvosilag releváns genetikai variáció, a populáció előzményeire vonatkozó mély következtetések és a magzati genomok nem invazív előrejelzésének pontos értelmezését. Leírunk egy megközelítést a genom egészére kiterjedő haplotipizáláshoz, amely az összefüggést megőrző transzpozíción (CPT-seq) és a kombinatorikus indexelésen alapul. A Tn5 transzpozíciót a DNS módosítására alkalmazzák adapterrel és indexszekvenciákkal, miközben megőrzik az összefüggést. A DNS hígítása és rekeszizálása után a transzpozázt eltávolítjuk, és a DNS-t külön-külön indexelt könyvtárakba bontjuk. Az egyes rekeszekben lévő könyvtárakat, gazdagítva a szomszédos genomi elemekkel, tovább indexeljük PCR-en keresztül. A kombinatorikus 96 plexes indexelés mind az átültetés, mind a PCR szakaszban lehetővé teszi a szintetikus leolvasások felépítését a közel 10 000 „virtuális rekeszből”. Bemutatjuk ennek a módszernek a megvalósíthatóságát azáltal, hogy az emberi genomban a heterozigóta variánsok> 95% -át hosszú, pontos haplotípus blokkokba állítjuk (N50 = 1,4–2,3 Mb). A gyors, méretezhető és költséghatékony munkafolyamat lehetővé teheti a haplotípus felbontásának rutinszerűvé válását az emberi genom szekvenálásában.

Hozzáférési lehetőségek

Feliratkozás a Naplóra

Teljes napló hozzáférést kap 1 évre

csak 4,60 € kiadásonként

Az árak nettó árak.
Az áfát később hozzáadják a pénztárhoz.

Cikk bérlés vagy vásárlás

Időben korlátozott vagy teljes cikkelérést kaphat a ReadCube-on.

Az árak nettó árak.

Csatlakozási kódok

Elsődleges csatlakozások

BioProject

Hivatkozások

Bansal, V. és mtsai. Az emberi genetika következő szakasza. Nat. Biotechnol. 29., 38–39 (2011).

Tewhey, R. és mtsai. A fázisinformációk fontossága az emberi genomika szempontjából. Nat. Tiszteletes Genet. 12., 215–223 (2011).

Fan, H.C. et al. A magzat genomjának nem invazív prenatális mérése. Természet 487, 320–324 (2012).

Kitzman, J. O. et al. Emberi magzat nem invazív teljes genom-szekvenálása. Sci. Fordítás Med. 4, 137ra76 (2012).

Sabeti, P.C. et al. A legújabb pozitív szelekció kimutatása az emberi genomban a haplotípus szerkezetéből. Természet 419, 832–837 (2002).

Adey, A. és mtsai. Az aneuploid HeLa rákos sejtvonal haplotípus-felbontású genomja és epigenomja. Természet 500, 207–211 (2013).

Tishkoff, S. A. és mtsai. A kötés egyensúlyhiányának globális mintázata a CD4 lokusz és a modern emberi eredet. Tudomány 271, 1380–1387 (1996).

Kong, A. és mtsai. A megosztás detektálása leszármazás, nagy hatótávolságú fázisok és haplotípus imputálás útján. Nat. Közönséges petymeg. 40, 1068–1075 (2008).

Hosomichi, K. és mtsai. A HLA gének fázis által meghatározott teljes szekvenálása következő generációs szekvenálással. BMC Genomics 14, 355 (2013).

Browning, S.R. & Browning, B.L. Haplotípus fázis: meglévő módszerek és új fejlesztések. Nat. Tiszteletes Genet. 12., 703–714 (2011).

Bansal, V. és mtsai. MCMC algoritmus haplotípus összeállításhoz teljes genom szekvencia adatokból. Genome Res. 18., 1336–1346 (2008).

Ő, D. és mtsai. Optimális algoritmusok a haplotípus összeállításához teljes genom szekvencia adatokból. Bioinformatika 26., i183 – i190 (2010).

Kaper, F. és mtsai. A teljes genom haplotipizálása hígítással, amplifikációval és szekvenálással. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 5552–5557 (2013).

Kitzman, J. O. et al. Egy gudzsaráti indiai egyed haplotípus-felbontású genomszekvenálása. Nat. Biotechnol. 29., 59–63 (2011).

Peters, B.A. et al. Pontos teljes genom szekvenálás és haplotipizálás 10-20 emberi sejtből. Természet 487, 190–195 (2012).

Fan, H.C. et al. Egyes sejtek teljes genom molekuláris haplotipizálása. Nat. Biotechnol. 29., 51–57 (2011).

Levy, S. és mtsai. Egy ember diploid genomszekvenciája. PLoS Biol. 5., e254 (2007).

Duitama, J. és mtsai. HapMap trió gyermek fosmid-alapú teljes genom-haplotipizálása: egyedi haplotipizálási technikák értékelése. Nukleinsavak Res. 40, 2041–2053 (2012).

Suk, E.K. et al. Az európai egyén átfogóan molekuláris haplotípussal feloldott genomja. Genome Res. 21, 1672–1685 (2011).

Lo, C. és mtsai. A klón alapú haplotipizálás tervezéséről. Genome Biol. 14, R100 (2013).

Geraci, F. Számos algoritmus összehasonlítása az egyedi SNP haplotipizálás rekonstrukciós problémájához. Bioinformatika 26., 2217–2225 (2010).

Caruccio, N. Következő generációs szekvenáló könyvtárak előkészítése Nextera technológiával: egyidejű DNS-fragmentáció és adapterjelölés in vitro átültetése. Módszerek Mol. Biol. 733, 241–255 (2011).

Adey, A. és mtsai. Gyors, alacsony bemenetű, alacsony elfogultságú sörétes puskakönyvtárak nagy sűrűségű felépítése in vitro átültetése. Genome Biol. 11., R119 (2010).

Erlich, Y. és mtsai. DNS Sudoku - nagy áteresztőképességű szekvenálás felhasználása a multiplexált mintaelemzéshez. Genome Res. 19., 1243–1253 (2009).

Duitama, J. és mtsai. ban ben Proc. 1. ACM Int. Konf. Bioinformatika Comput. Biol. 160–169 (ACM (Association for Computing Machinery), New York, 2010).

Kuleshov, V. és mtsai. A teljes genom haplotipizálása hosszú leolvasásokkal és statisztikai módszerekkel. Nat. Biotechnol. 32, 261–266 (2014).

Abecasis, G.R. et al. Az emberi genom variációjának térképe a populációs léptékű szekvenálástól. Természet 467, 1061–1073 (2010).

Conrad, D.F. et al. A genom egészére kiterjedő mutációs ráta változása az emberi családokon belül és között. Nat. Közönséges petymeg. 43, 712–714 (2011).

Kamphans, T. és mtsai. Összetett heterozigóta szekvenciaváltozatok szűrése nem-rokon származású törzskönyvekben. PLOS ONE 8., e70151 (2013).

Bentley, D.R. et al. Pontos az egész emberi genom szekvenálása reverzibilis terminátor kémia alkalmazásával. Természet 456, 53–59 (2008).

Lo, C. és mtsai. Stroboszekvencia tervezése haplotípus összeállításhoz. BMC Bioinformatika 12. (1. kiegészítés), S24 (2011).

Fu, A.Y. et al. Mikrofeldolgozott fluoreszcenciával aktivált sejtválogató. Nat. Biotechnol. 17., 1109–1111 (1999).

Hua, Z. és mtsai. Multiplexált valós idejű polimeráz láncreakció digitális mikrofluid platformon. Anális. Chem. 82, 2310–2316 (2010).

Adey, A. és mtsai, hosszú távú szekvencia információk a de novo a genom összeállítása a transzpozáz kontinuitásán keresztül. Genome Res. 10.1101/gr.178319.114 (2014. október 19.)

Li, H. & Durbin, R. Gyors és pontos rövid leolvasási igazítás Burrows-Wheeler transzformációval. Bioinformatika 25, 1754–1760 (2009).

Köszönetnyilvánítás

Hálásak vagyunk J. Bruandnak, F. Zhangnak és A. Kia-nak az adatok elemzésében nyújtott segítségért. Hálásak vagyunk I. Goryshin, N. Caruccio és R. Vaidyanathan számára is a projekt különböző szakaszaiban folytatott megbeszélésekért. Köszönetet mondunk S. Norbergnek, J. Zhangnak, J. Berndnek, T. McSherry-nek, T. Le-nek, P. Diep-nek és G. Roberts-nek a szekvenálás elvégzéséért, az egyedi receptek elkészítésében való segítségért és az adatátvitel támogatásáért. J.S. az Országos Emberi Genomkutató Intézet HG006283 támogatásával támogatta. A.A. és J.O.K. támogatta a Nemzeti Tudományos Alapítvány DGE-0718124 posztgraduális kutatási ösztöndíja.

Szerzői információk

Hovatartozások

Illumina, Inc., Advanced Research Group, San Diego, Kalifornia, USA

Sasan Amini, Dmitry Pushkarev, Lena Christiansen, Emrah Kostem, Tom Royce, Casey Turk, Natasha Pignatelli, Kandaswamy Vijayan, Mostafa Ronaghi, Kevin L Gunderson és Frank J Steemers

Genomtudományi Tanszék, Washingtoni Egyetem, Seattle, Washington, USA

Andrew Adey, Jacob O Kitzman és Jay Shendure

A PubMed Google Scholar alkalmazásban is kereshet erre a szerzőre

Hozzájárulások

F.J.S., S.A. és K.L.G. fogant a tanulmány. F.J.S. felügyelte a technológia fejlesztését. S.A. vezette a vizsgálat fejlesztését, elvégezte a kísérleteket és elemezte az adatokat. L. C., C. T., N. P., A. A. és J.O.K. kísérleteket hajtott végre. T.R. és E.K. elvégzett adatelemzést. D.P. kidolgozta az elemzési folyamatot. K.V. kifejlesztette az egymolekulás képalkotó rendszert és képeket gyűjtött az egymolekulás kísérletekhez. S.A., L.C., D.P., M.R., K.L.G., J.S. és F.J.S. együtt írta a kéziratot. Minden szerző hozzájárult a kézirat átdolgozásához és felülvizsgálatához.

Levelezési cím

Etikai nyilatkozatok

Versenyző érdekek

S.A., D.P., L.C., E.K., T.R., C.T., N.P., K.V., M.R., K.L.G. és F.J.S. nyilvánítsa a versengő pénzügyi érdekeltségeket az Illumina, Inc. részvénytulajdon és fizetett foglalkoztatás formájában.

Integrált kiegészítő információk

Kiegészítő 1. ábra Folyamatosan transzponált DNS egymolekulás képalkotása.

Egymáson át transzponált DNS egymolekulás képalkotása Cy5-jelölt transzpozómák és YOYO-1-jelölt DNS-ek alkalmazásával (piros, illetve kék színűek). A szubsztrát DNS transzpozíció utáni „gyöngy-húron” konfigurációja (felső panel, Mg 2+ -val) azt jelzi, hogy a cél DNS nem fragmentálódik az átültetés után. Mg 2+ hiányában a transzpozómakomplexek kötődnek a szubsztrát DNS-hez (felső panel, Mg 2+ nélkül), de nem transzponálódnak a DNS-be; ezért a proteázkezelés nem fragmentálja a transzpozómáknak előzetesen kitett DNS-t Mg 2+ hiányában (alsó panel, Mg 2+ nélkül, proteázzal). Amikor a transzpozíció Mg 2+ és proteáz (amely megemészti a transzpozázt) jelenlétében történt, DNS-fragmensek (alsó panel Mg 2+ -val, proteázzal).

Kiegészítő 2. ábra Elvi bizonyítási példa, amely bemutatja a távolságértékek eloszlását a tandem illesztések között SDS kezeléssel a hígítási lépés előtt vagy után.

Kiegészítő 3. ábra: A kétszintű (transzpozon és PCR) indexelt sablonok és szekvenálási kiolvasási séma tervezése.

Az univerzális transzpozonszekvenciákat és indexeket (azaz a T5 és T7 indexeket) a mintába vezetjük be az átültetési lépés során. A PCR lépés során a PCR és a transzpozon oligonukleotidok (azaz az univerzális csatlakozó) közötti átfedést használják az univerzális szekvenáló primerek (azaz P5 és P7) bevitelére a PCR indexekkel (azaz P5 és P7 indexekkel) együtt. 8 különböző P5, 12 különböző P7, 8 különböző T5 és 12 különböző T7 index szekvencia létezik (lásd Online módszerek és 4. kiegészítő táblázat).

Kiegészítő 4. ábra: Intenzitás versus ciklus diagram egy tipikus kétszintű kettős indexelésű szekvenálási futtatáshoz.

A szekvenálás sorrendje a következő: genomi DNS 1. leolvasás (1-51. Ciklus), 1. index (i7 transzpozon, 52-59. Ciklus és PCR i7, 60-67. Ciklus), 2. index (PCR i5, 68. ciklus) 75 és az i5 transzpozon, 76–83. Ciklus) és a genomi DNS 2. leolvasása (84–134. Ciklus).

Kiegészítő 5. ábra Az ebben a vizsgálatban használt genomi DNS-minták pulzustéri gélelektroforézise.

Az NA12878, NA12891 és NA12892 mintákat vagy Coriell-től szereztük be, vagy a Gentra protokoll alkalmazásával készítettük. Az összes mintát Bio-Rad pulzálómezõs gélelektroforézis rendszerrel elemeztük, 1% agarózgél alkalmazásával, 16 órán át, 14 ° C-on 170 V feszültségen, 1 mp-nél megkezdõdõ kapcsolási idõvel és 6 mp-re haladva.

Kiegészítő 6. ábra: Három index reprezentatív lefedettségi diagramjai.

Az összehangolt szekvenciális olvasmányok eloszlását három indexre ábrázoljuk, a proximális régiók szigetekként jelennek meg a 22. kromoszóma egy részén. A pillanatkép az Integrated Genome Viewer (IGV) v.2.3 (Broad Institute) segítségével készült.

Kiegészítő 7. ábra A tandem igazítás közötti leolvasott távolságok reprezentatív eloszlása egyetlen index esetében.

Bimodális eloszlás figyelhető meg, a proximális és a disztális genomiális régió két külön alcsoportra különül el. A Gentra készítményből nyert NA12878 genomi DNS-t a CPT-seq munkafolyamat segítségével dolgoztuk fel, és a HiSeq 2000 négy sávján szekvenáltuk. Az adatokat demultiplexáltuk és feltérképeztük a referencia emberi genomra (hg19).

Kiegészítő 8. ábra A szigeten belüli lefedettségi értékek megoszlása.

A haplotipizálás szigeteinek határait úgy határoztuk meg, hogy olyan fürtöket találtunk, amelyek két egymást követő olvasás között nem haladták meg a 15 kb-ot, és mindegyik klaszterben legalább öt egyedi olvasópár volt. Kiszámoltuk az egyes haplotipizáló szigetek szekvenálással lefedett részét és az eloszlást ábrázoltuk.

Kiegészítő 9. ábra: Az adatelemzési folyamat összefoglalása a teljes genom fázisához.

A 9 216 partíció demultiplexelt szekvenálásának leolvasását az emberi referenciagenomhoz (hg19) igazítottuk. Az összehangolási koordinátákat használtuk a haplotipizáló szigetek hívására. Minden partícióhoz heterozigóta SNP-k fázisosításával, a ReFHap 25 alkalmazásával kezdeti haplotipizáló blokkokat állítottunk elő. Ezt követően azokat az SNP-ket eltávolították, amelyeket csak egy adatpont kapcsolt össze, vagy több sziget egymásnak ellentmondó hívásokat mutatott. Ezután 1000 Genomes Project panel adatot használtak fel további SNP-k fázisba állításához.

Kiegészítő 10. ábra: Varrás versus kitöltési imputáció.

Az 1000 Genomes Project adatai felhasználhatók hosszabb haplotipizáló blokkok előállítására kisebb blokkok összekapcsolásával (öltési imputáció). Alternatív megoldásként ezek az adatok felhasználhatók hiánypótló SNP-k hiánypótlásához, amelyeket nem fednek le nagy megbízhatóságú kísérleti adatok (kitöltési imputáció). Az adatokat (III. Lépés) és (ReFHap pontosság, I. lépés) imputáció nélkül jelentjük (1. táblázat). Az imputációt csak a hiányosságok kitöltésére használják, mivel az öltési imputáció potenciálisan magas hosszú kapcsolású hibaarányt eredményezhet. Ezért az összeállított haplotipizáló blokkok N50-je az imputációs lépés után nem változik. M az anya SNP-jét, D pedig az apa SNP-jét jelöli. Ideális esetben egy haplotípus húr csak M vagy D SNP-ből áll.

Kiegészítő 11. ábra: Szekvenálási mélység, fokozatos lefedettség és pontosság.

A szakaszolt SNP-k százalékos arányát és a fázisok pontosságát ábrázoljuk a szekvenálás mélységének függvényében.