A TALÁLMÁNY HÁTTERE

A találmány tárgya táplálék-összetétel táplálékallergiák diagnosztizálására és kezelésére társállatokban, például kutyákban és macskákban, és különösen hipoallergén étrendi készítményekre vonatkozik, amelyek egyedüli hidrolizált fehérjét használnak fehérjeforrásként.

Az állatorvosi közösségben folyamatos kihívás volt az élelmiszerallergiák diagnosztizálása és kezelése a kísérő állatokban, például kutyákban és macskákban. Az ételallergia gyakran bőr- és gyomor-bélrendszeri betegségeket eredményez a kutyáknál, amelyek 2 hónapos kortól 12 éven felüli túlérzékenységet okozhatnak. A kutyák ételallergiájával járó egyéb tünetek közé tartozik a krónikus hasmenés, a tápanyagok felszívódási zavarai, fogyás, hasi fájdalom és levertség.

A fő ételallergének a vízben oldódó glikoproteinek, amelyek molekulatömege 10 000 - 60 000 dalton. A kutyák étel-túlérzékenységének elsődleges okai a tejtermékek, a marhahús és a növényi fehérjék, míg a macskák túlnyomórészt a halak és tejtermékek iránti túlérzékenységet fejlesztik ki.

Az állatok ételallergiájának diagnosztizálása olyan eljárásokat tartalmazott, mint az intradermális bőrvizsgálat ételallergénekkel, vagy szerológiai vizsgálatok, például radioallergoszorbens (RAST) vagy enzimmel kapcsolt immunvizsgálatok (ELISA). Az ilyen módszereket azonban megbízhatatlannak találták. Az ételallergiák diagnosztizálása jelenleg általában megköveteli, hogy az állatot házilag elkészített eliminációs étrendre helyezzék, amely időigényes és kényelmetlen. Például az állatot 3–10 hétig tartó eliminációs étrenden kell tartani.

Az ételekkel szembeni túlérzékenység gyakori kezelése a szigorú kerülés. A kísérőállatoknál azonban az elkerülés nehezen megvalósítható, mivel az otthon elkészített étrendet kényelmetlen elkészíteni, a fehérjeforrásokat, például a bárányt, nehéz beszerezni, a kereskedelmi étrendben pedig rejtett antigének lehetnek. Ezenkívül egy vagy több új fehérjeforrás hosszantartó táplálása az adott fehérjével szembeni túlérzékenység kialakulását eredményezheti. Bár a kortikoszteroidok csökkenthetik a klinikai tüneteket, a krónikus alkalmazás hosszú távon káros hatással lehet a kutyákra és macskákra.

Megállapították, hogy a fehérjék allergén tulajdonságai csökkenthetők a fehérjék enzimszerű peptidekké történő hidrolízisével. Tanulmányok szerint a hidrolizált fehérjével összeállított étrendek csökkentik az antigén terhelést és csökkentik az allergiás reakciókat az élelmiszerallergia modellekben. Részben hidrolizált étrendet alkalmaztak a magas kockázatú csecsemők számára, valamint az étkezési túlérzékenység klinikai tüneteinek megelőzésében kutyákban és macskákban. Ezen étrendek többsége hidrolizált tejtermékeket (kazein) vagy növényi fehérjéket (szójafehérje) használ. Az ilyen vizsgálatok azonban nem mutatják be az állatok allergiás reakciójának megelőzéséhez szükséges hidrolízis mértékét. A korábbi vizsgálatok sem jelzik a megfelelő fehérjeforrásokat a kísérő állatok étrendjében történő felhasználásra.

Egy másik tényező, amelyet figyelembe kell venni a kísérő állatok hipoallergén étrendjének kialakításakor, az a rostforrás beépítése, amely elfogadható székletképződést eredményez, miközben elkerüli az esetleges allergiákat. Például a répapép az állatok táplálékában általánosan használt rostforrás, amely fehérjéket tartalmaz, amelyek allergiás reakciót válthatnak ki.

Ennek megfelelően a szakterületen továbbra is szükség van a kísérő állatok, például kutyák és macskák táplálék-összetételére, amely lehetővé teszi az ételallergia diagnosztizálását és kezelését az ilyen állatokban, miközben elfogadható székletképződést biztosít.

A jelen találmány megfelel ennek az igénynek azáltal, hogy hipoallergén táplálékkészítményt biztosít társállatok, például macskák és kutyák számára, amelyek felhasználhatók ételallergiák diagnosztizálására és kezelésére. Az étrendi összetétel tartalmaz egy hidrolizált fehérjét, mint egyedüli fehérjeforrást az étrendben az antigéntermelés és az allergiás reakciók csökkentése érdekében, valamint egy rostforrást, amely elfogadható székletképződést biztosít.

A jelen találmány egyik aspektusával összhangban hipoallergén táplálékkészítmény áll rendelkezésre társállatok számára, amely szárazanyagra vonatkoztatva tartalmaz fehérjeforrást, zsírforrást és szénhidrátforrást, ahol a fehérjeforrás körülbelül 20-30 tömeg% hidrolizált fehérje szárazanyagra vonatkoztatva. A hidrolizált fehérje előnyösen hidrolizált csirkemájat tartalmaz. Előnyösen a fehérje legalább 99% -ának molekulatömege kisebb, mint 1,5 kDa.

A szénhidrátforrás előnyösen manióka, amely a készítmény szárazanyagra vonatkoztatva körülbelül 50-60 tömeg%.

A készítmény előnyösen körülbelül 1-5 tömeg% szárazanyagra vonatkoztatva tartalmaz egy rostforrást, amely az almaszál, a borsórost, a karboxi-metil-cellulóz (CMC) és a rezisztens keményítő keveréke, valamint ezek keveréke.

Amikor a jelen találmány szerinti készítményt a társállatoknak táplálkozási szükségleteiknek megfelelő mennyiségben és gyakorisággal adják be, azt találták, hogy az állatok csökkent antigéntermelést mutatnak. A jelen találmány szerinti készítmény felhasználható az élelmiszer-allergia diagnosztizálására szolgáló módszer előállítására egy társállaton. Például egy allergiás tüneteket észlelő állatot több hétig fel lehet tenni a jelen találmány szerinti étrendre, és ha a tünetek enyhülnek, akkor az élelmiszerallergia jelenléte megerősítést nyer, és az állatot ezután különböző fehérjeforrásokkal etethetik a az allergia specifikus forrása.

Ennek megfelelően a jelen találmány egyik jellemzője hipoallergén étrendi összetétel és eljárás biztosítása az élelmiszerallergiák diagnosztizálására társállatoknál. A találmány további jellemzői és előnyei a következő leírásból, a mellékelt rajzokból és a csatolt igénypontokból nyilvánvalóak lesznek.

ÁBRA. Az 1. ábra oszlopdiagram mutatja a különböző hidrolizált táplálékkal táplált kutyák bőrreakcióit, beleértve a találmány szerinti hipoallergén étrendet. és

ÁBRA. A 2. ábra egy oszlopdiagram, amely a 2. ábrán bemutatott hidrolizált táplálékkal etetett kutyák gyomornyálkahártya-válaszait mutatja. 1.

A jelen találmány szerinti hipoallergén étrendi készítmény javulást nyújt a jelenleg rendelkezésre álló étrendi kompozíciókhoz képest, mivel a készítmény egyedüli hidrolizált fehérjét használ fel fehérjeforrásként, amely hatékony módszert biztosít az ételallergiák diagnosztizálására társállatoknál. Ezenkívül a készítmény tartalmaz egy rostforrást, amely nem indukál további allergiás reakció lehetőségét, és amely elfogadható székletképződést biztosít.

Megállapítottuk, hogy a találmány szerinti étrendi összetétel csökkenti az állat antigéntermelését, és a reakció bemutatása vagy a reakció mértéke szempontjából ugyanolyan jól vagy jobban teljesít, mint más kereskedelemben kapható hipoallergén étrend.

Az étrendi készítmény bármilyen megfelelő formában rendelkezésre állhat, amennyiben szárazanyagra vonatkoztatva tartalmazza a hidrolizált fehérje előnyös koncentrációját. Például a készítmény extrudálható és konzerválható, vagy keksz formában kapható.

A készítmény előnyösen körülbelül 9-30 tömeg% zsírt, 50-60 tömeg% szénhidrátot és körülbelül 20-30 tömeg% hidrolizált fehérjeforrást tartalmaz, szárazanyagra vonatkoztatva. Ezenkívül a készítmény előnyösen körülbelül 1-5 tömeg% rostforrást tartalmaz, amely alma szál, borsó rost, karboxi-metil-cellulóz és rezisztens keményítő keveréke, valamint ezek keveréke.

A készítményben a hidrolizált fehérje forrása előnyösen hidrolizált csirkemájat tartalmaz. A készítményt előnyösen úgy alakítjuk ki, hogy a fehérjeforrás legalább 99% -ának molekulatömege kevesebb, mint 1,5 kDa, hogy biztosítsa a hidrolízis bekövetkezését olyan mértékben, hogy az allergiás reakció megakadályozható legyen.

A szénhidrátforrás előnyösen manióka, de tartalmazhat más forrásokat is, például burgonyalisztet, zabot és árpát.

A zsírforrás előnyösen állati eredetű, de tartalmazhat baromfizsírt, halolajat, lenolajat és borágóolajat.

Annak érdekében, hogy a találmány könnyebben érthető legyen, hivatkozunk a következő példákra, amelyek a találmány szemléltetésére szolgálnak, de nem korlátozzák azok körét.

A kutyák számára étrendet állítottak össze, amely hidrolizált csirkemájat használt fehérjeforrásként és maniókat szénhidrátforrásként. Az étrendet az 1,4 kgDalton (kDa) alatti molekulatömegű fehérje 99,8% -ával állítottuk össze, az alábbiakban az 1. táblázat szerint.

A kezdeti ízesítési vizsgálatból megállapították, hogy meg kell határozni egy rostforrást, amelynek mérsékelt fermentálhatósága van a kutya gyomor-bél traktusában, de amely nem okoz allergiás reakciót, és amely elfogadható székletképződést eredményez. Az e kritériumoknak megfelelő rostforrások az almaszál, a borsórost és a CMC/rezisztens keményítő kombinációja voltak. Ezeket a rostokat beépítettük az étrendbe (lásd a 4. táblázatot), és biológiai vizsgálatban teszteltük a széklet termelését. Összesen 12 kutyát használtak fel ebben a biológiai vizsgálatban (kezelésenként 4 kutya). A kutyákat a megfelelő étrendjükkel 21 napig etették, és naponta rögzítették a széklet pontszámát. Az eredményeket az 5. táblázat foglalja össze. Az Apple Pomace-vel készített étrend eredményezte a legjobban a székletet.

Az 1. példa szerinti étrendet teszteltük annak hatékonyságának meghatározásához. Az alkalmazott étrendet az alábbi 6. táblázat mutatja be.

Jegyzőkönyv. A vizsgálatokat az NIH szerint hajtották végre Útmutató a laboratóriumi állatok gondozásához és használatához és a kanadai állatügyi tanács Gondozási útmutató a kísérleti állatok gondozásához és használatához. Keresztezett szán kutyákat (n = 14) használtunk ebben a vizsgálatban, és az állatokat 3 alomból nyertük. Az állatokat véletlenszerűen 2 kezelési csoportba soroltuk a születéstől számított 24 órán belül. Az 1. csoportba tartozó kutyákat (n = 11) szenzibilizáltuk kazein, csirkemáj és szójafehérje iránt, a 2. csoport kutyái (n = 3) kontrollként működtek, és nem voltak érzékenyek egyetlen ételantigénre sem.

A kutyákat az első 6 hónapban kölyökkutya diétára helyezték (The Iams Company, Dayton, Ohio), majd a vizsgálat további részében felnőtt étrenden tartották őket (The Iams Company, Dayton, Ohio). Ezek az étrendek nem tartalmaztak tejfehérjét, szójafehérjét vagy csirkemájat. A kutyák tejfehérjét, szójafehérjét és csirkemájat tartalmazó étrendet kaptak 4 héten át, 11 hónapos korukban. Az ételeket a gyártók ajánlásai szerint, az édesvizet pedig szabadon biztosítottuk. Az állatokat naponta megfigyeltük, és minden klinikai rendellenességet feljegyeztünk.

Élelmiszer-antigének/elemzés. Szenzibilizáló antigének közé tartozott a kazein, a szójafehérje és a csirkemáj (1: 1: 1, tömeg alapján). A túlérzékenységi reakciókat a következő hidrolizált és ép diétákon hajtották végre: kazein (Sigma), 1% hidrolizált kazein (Iams), 2% hidrolizált kazein (Iams), 5% hidrolizált kazein (Iams), 10% hidrolizált kazein (Iams), 20 % hidrolizált kazein (Iams), 50% hidrolizált kazein (Iams), csirkemáj, hidrolizált csirkemáj (Iams), szójafehérje, Exclude® (hidrolizált kazein és máj, 16,5% fehérje, DVM Pharmaceuticals, Miami, Fla.), HA -Formula ™ (hidrolizált szója, 18% fehérje, Ralston Purina, St. Louis, Mo.) és hidrolizált csirkemáj diéta (teszt étrend; 19% fehérje, The Iams Company, Lewisburg, Ohio). A kazein és a csirkemáj hidrolízisét az Iams Company (Lewisburg, Ohio) végezte. A hidrolízis mértéke százalékban kifejezve a hidrolízis reakció és a szabad aminosavak arányát képviseli.

A fehérjék molekulatömegének meghatározásához a teszt étrenden és a szenzibilizáló antigének között SDS-PAGE elektroforézist hajtottunk végre. Mindegyik antigént 10 tömeg/tömeg% előállításával állítottuk elő. szuszpenzió vagy oldat desztillált vízzel és 1 órán át erőteljesen rázva. A fehérjekoncentrációt a BioRad assay rendszer (BioRad, Missisauga Ontario) segítségével határoztuk meg. Az oldatokat úgy állítottuk be, hogy 2 mg/ml fehérjét tartalmazzanak. Az SDS-PAGE elektroforézist 20% -os elválasztó gélen és 4% halmozó gélen végeztük 200 V feszültségen 5,5 órán át. Tíz mikrogramm fehérjét töltöttünk a gél minden egyes sávjába.

Az SDS-PAGE gélek 5 és 80 kDa közötti fehérjéket választottak szét. Az egyes mintákból kimutatható maximális és minimális molekulatömeget a 7. táblázat tartalmazza.

Az 1%, 2% és 5% hidrolizált kazein mintákban nagy molekulatömegű fehérjék minimális hidrolízise következett be. Ezek a hidrolizált minták nem különböztek szignifikánsan a csak kazeintől. A nagy molekulatömegű fehérjék jelentős hidrolízisét a 10 és 20% -os mintákban érték el, de néhány nagy molekulatömegű fehérjéről még mindig volt bizonyíték. Az 1–10% hidrolizált kazein mintákban specifikus kazeinfehérjéket, például α-laktalbumint (14,2 kDa) lehetett azonosítani. Úgy tűnik, hogy a nagy molekulatömegű fehérjék teljes hidrolízise az 50% -ban hidrolizált kazeinmintában történt. A nem hidrolizált kazeinben rengeteg nagy molekulatömegű fehérje volt. Mind a csirkemáj, mind a hidrolizált csirkemáj nagy molekulatömegű sávokkal rendelkezik. Jelentős fehérjehidrolízist értek el az Exclude, a HA-Formula és a teszt étrendben, de a gyenge, nagy molekulatömegű sávok még mindig azonosíthatók.

Szenzibilizációs protokoll. Az 1. csoportba tartozó kutyák szenzibilizációs protokollja a kölyökkutyák szubkután injekcióját tartalmazta élő vírusoltással (diszpergálódás, hepatitis, parvovírus, parainfluenza, Fort Dodge Ayerst, Guelph Ontario), majd egy élelmiszer-antigén szubkután injekcióját a timsó 10. adjuvánsban az 1. és a 85. napon az 1. csoportba tartozó kutyákat 1 mg kazein, szójafehérje és csirkemáj 7 injekciójával szenzibilizáltuk. A kontroll állatok csak adjuvánst kaptak.

Bőrvizsgálatok. A bőrpróbákat azután hajtották végre, hogy a kutyák körülbelül 6 hónapos korban teljesítették a szenzibilizáló antigének szenzibilizációs protokollját. Bőrön túlérzékenység a teszt étrendekkel szemben (kazein, 1% hidrolizált kazein, 2% hidrolizált kazein, 5% hidrolizált kazein, 10% hidrolizált kazein, 20% hidrolizált kazein, 50% hidrolizált kazein, csirkemáj, hidrolizált csirkemáj, szójafehérje, Kizárva, HA-Formula, teszt étrend) körülbelül 10 hónapos korban végeztük. A hasi hasi aspektust alkalmazták minden kiskutya bőrvizsgálatához. Négy élelmiszer-allergén koncentrációt (2000, 200, 20 és 0,02 μg/ml) injektáltunk intradermálisan (0,05 ml). Az antigénekkel azonos koncentrációjú hisztamint használtunk pozitív kontrollként, míg steril sóoldatot negatív kontrollként. Az Evans kék festéket (0,5%, 0,2 ml/kg) intravénásan adtuk be 5-10 perccel az intradermális injekciók után. Körülbelül 20 perccel az intradermális injekciók után megmértük az allergének wheal és fellángolásának átmérőjét.

Gasztroszkópos ételérzékenység. Gasztroszkópos vizsgálatokat végeztek kölyökkutyákon, amikor körülbelül 6 hónaposak voltak (szenzibilizáció után) és 10 hónaposak voltak (teszt-diéták). A kutyákat 2–3% halotánnal altattuk acepromazin szedáció után. Az endoszkópiát gyermeki felső GI endoszkóppal végeztük, injekciós csatornával. Tesztantigéneket (ugyanazokat, mint a bőrtesztek, 0,5 ml, 1 mg/ml 1: 1 sóoldat/glicerinben) scleroterápiás tűvel injektáltunk a gyomor nyálkahártyájába. A kontroll sóoldatból/glicerinből állt. Evans kék színezéket (0,5%, 0,2 ml/kg) adtunk IV-ben 5-10 perccel a gyomorinjekciók előtt. Az egyes antigénekre és a kontrollra adott gyomornyálkahártya-reakciókat 5 perccel az injekció beadása után értékeltük a duzzanat, az erythema és a kék foltosság mértéke szerint a következő osztályozási rendszer alkalmazásával: 0 = normál gyomornyálkahártya; 1 = enyhe bőrpír; 2 = enyhe bőrpír és ödéma; 3 = mérsékelt bőrpír és ödéma; enyhe kék folt; 4 = súlyos bőrpír és ödéma; kék folt.

Szérum IgE. A szérumot kontroll és szenzibilizált kutyáktól gyűjtöttük a szenzibilizációs protokoll végén (6 hónapos korban). A specifikus IgE szérum antitestek koncentrációját ELISA alkalmazásával határoztuk meg egy kereskedelmi diagnosztikai laboratóriumban (Biomedical Services, Austin, Tex.). A szérum IgE titerét normál kutyák és kutyák túlzott érzékenységével rendelkező kutyák nagy csoportjával hasonlítottuk össze. Az IgE-szinteket normálnak, határértéknek, pozitívnak és erősen pozitívnak értékeltük.

A kutyák szenzibilizálása. Miután a kutyákon átesett a szenzibilizációs protokoll, 6 hónapos korban mértük a bőr érzékenységét és a szenzibilizáló antigénekkel szembeni gyomorreakciókat. Megállapítást nyert, hogy valamennyi kutyát sikeresen érzékenyítették a kazein, a szójaliszt és a csirkemáj antigének iránt. A kontroll állatokat nem érzékenyítettük.

Klinikai értékelés. Amikor a kutyákat szója, kazein és csirkemájból álló étrendre helyezték 11 hónapos korukban, az összes túlérzékenyített kutyánál mérsékelt vagy többszörös hasmenés és fogyás alakult ki (az adatokat nem közöljük). Ezenkívül a 11 szenzibilizált kutya közül 8 bőrgyógyászati reakciót mutatott, amelyek magukban foglalják a hajhullást és a ventrum viszketését. A kontroll kutyáknál nem figyeltek meg dermatológiai reakciókat. A klinikai tünetek a szenzibilizáló étrend etetésének első hetében alakultak ki, és mindaddig fennmaradtak, amíg a diétát biztosították.

A gyomor nyálkahártya reakcióinak mintái a teszt étrend antigénjeihez hasonlóak voltak a dermális injekciókat követően. Az érzékenyített kutyákban csak az 50% -ban hidrolizált kazein, a HA-Formula, az Exclude és a teszt étrend gasztroszkópos pontszáma szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a nem hidrolizált antigéneké (2. ábra). A teszt étrend volt a legkevésbé reaktív az összes provokáló antigén közül. A kontroll kutyák gasztroszkópos pontszáma normális vagy csekély volt az összes antigén esetében (2. ÁBRA).

Eredmények. A vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy a túlérzékenységi reakciók kiküszöböléséhez magas fokú fehérjehidrolízisre (a teljes hidrolízis 50% -áig) van szükség. A kisebb mértékű hidrolízis fokozhatja az allergiás reakciókat, mivel a fehérjék 3-dimenziós struktúrájában lévő antigén epitópok immunológiai feldolgozásnak vannak kitéve.

A kutyák nem reagáltak a kereskedelmi hipoallergén hidrolizált étrendekre (Exclude vagy HA-Formula diéta), amelyek tej/máj vagy szója alapú tápszerek. A teszt étrend a legkevésbé dermális és nyálkahártya-reakciókat eredményezte a három szenzibilizált étrend közül.

Noha a találmány szemléltetése céljából bemutattunk bizonyos reprezentatív kiviteli alakokat és részleteket, a szakember számára nyilvánvaló, hogy az itt ismertetett módszerekben és készülékekben különféle változtatásokat lehet végrehajtani anélkül, hogy eltérnénk a találmány oltalmi körétől. a csatolt igénypontokban meghatározottak szerint.