A magas diétás fehérje súlyosbítja a magas vérnyomást és a vesekárosodást a Dahl SS patkányokban azáltal, hogy növeli a beszivárgó immunsejteket a vesében

Absztrakt

BEVEZETÉS

Az étrendi tápanyagok jelentősen befolyásolják az emberek és a kísérleti állatok artériás vérnyomását. A koleszterin, a telített zsírok vagy a szénhidrátok fogyasztása emelkedett artériás vérnyomással jár, míg a magas fehérjetartalmú étrend az általános emberi populáció csökkent vérnyomásához kapcsolódik. 1, 2, 3, 4, 5 A veseelégtelenségben szenvedő betegek bizonyítékai azonban azt jelzik, hogy a megnövekedett fehérjebevitel felgyorsíthatja a vesefunkció csökkenését. 6, 7, 8, 9 Az étkezési zsír-, fehérje- és szénhidrátváltozások vérnyomásra gyakorolt hatásait kísérleti állatmodellekben is megvizsgálták. A magas vérnyomás kialakulása felgyorsul a magas vérnyomás genetikai modelljeiben, a fehérjétől, 10 szénhidráttól 11, 12, 13, 14 és zsírtól függően. 14, 15 étrend összetétele. Ezek a klinikai és kísérleti eredmények azt mutatják, hogy a különféle étrendi összetevők a nátrium bevitelétől függetlenül befolyásolhatják az artériás vérnyomást és a vesekárosodást.

Laboratóriumunk legújabb tanulmányai kimutatták, hogy a Dahl SS patkányokkal táplált tojás fehérjeforrása módosította a nátrium-érzékeny magas vérnyomás mértékét és az ezzel járó vesekárosodást, amelyet magas NaCl bevitel mellett figyeltek meg. További kísérletek kimutatták, hogy a Dahl SS patkányok vesekárosodása összefügg a makrofágok és a T-limfociták beszűrésével, és hogy az immunsejtek beszivárgásának elnyomása gyengíti a nátrium-érzékeny magas vérnyomást és a vesekárosodást. 18, 19 Mivel a sótól függő magas vérnyomás és a vesekárosodás jellemzői az SS patkánytörzsben hasonlóak az emberi populációkban megfigyeltekhez, 20 a betegség fenotípusait módosító környezeti hatások megértése betekintést nyújthat az emberi betegségbe. Jelen tanulmány kifejezetten annak a hipotézisnek a tesztelésére készült, hogy az étrendben lévő fehérje mennyisége módosíthatja a nátrium-érzékeny magas vérnyomást és a vesekárosodást Dahl SS patkányokban. További kísérleteket terveztek az immunsejtek beszivárgásának vizsgálatára a magas NaCl-tartalmú patkányok veséjében, és meghatározták ezeknek a beszűrődő sejteknek a jelentőségét e fehérje- és nátrium-érzékeny betegség fenotípusok kialakulásában.

E kérdések megválaszolásához a patkányokat különböző mennyiségű fehérjét tartalmazó egyedi étrendekkel etették. Az egyedi étrend az AIN-76A étrend-készítmény egyszerű módosításából állt, alacsony (6%), normál (18%) vagy magas (30%) fehérje mennyiségben. A patkányokat különböző, 0,4% NaCl-tartalmú étrendekkel etettük körülbelül 4-12 hetes korban; az étrendben lévő só mennyiségét ezután 4,0% NaCl-ra növelték a vizsgálat utolsó három hetében. Az étrendi fehérjetartalom hatását a nátrium-szenzitív hipertónia és a vesekárosodás kialakulására, valamint az infiltrálódó immunsejtek potenciális szerepét ebben a folyamatban értékelték a magas NaCl-bevitel időszakának utolsó hetében.

MÓD

Kísérleti állatok

Fogyókúrák

A diétákat a Dyets Inc.-től (Bethlehem, PA) szereztük be. A normál, 18% kazeint tartalmazó AIN-76A chow normál protein chow volt. 6% és 30% kazeint tartalmazó egyedi készítményeket is kaptunk, és alacsony fehérjetartalmú étrendként, illetve Az egyes étrendek különböző fehérjeszázalékai helyettesítették vagy helyettesítették szénhidráttal (szacharóz), és izokalorosak voltak.

Sebészeti eljárás

A műtéti eljárásokat a kéthetes kísérleti protokoll első napján hajtották végre, és két héttel az alacsony (0,4%) és a magas (4,0%) NaCl chow közötti átmenet után következtek be. A patkányokat mélyen altattuk ketamin (35 mg/kg), xilazin (10 mg/kg) és acepromazin (0,5 mg/kg) intraperitoneális injekcióval, szükség esetén kiegészítő érzéstelenítéssel. Aszeptikus technika alkalmazásával a polivinil katétereket beültették a femor artériába, szubkután alagútba helyezték őket, és a nyak hátsó részén exteriorizálták egy könnyű rögzítő rugóban. Mind az antibiotikumokat, mind a fájdalomcsillapító szereket műtét után adtuk be, és a patkányokat hagyjuk teljesen ébredni az érzéstelenítésből egy szabályozott hőmérsékletű párnán. Az érzéstelenítésből való kilábalást követően az összes patkányt egyedi rozsdamentes acél ketrecekbe helyezték, amelyek lehetővé teszik az artériás vérnyomás napi mérését és az éjszakai vizeletgyűjtést.

Kísérleti eljárások

A műtét után a patkányokat egy hétig hagyták helyreállni. Ez idő alatt 4,0% NaCl-ot tartalmazó egyedi étrenden tartották őket. A gyógyulási periódus után magas sós vérnyomásméréseket végeztek 9:00 és 12:00 óra között három egymást követő napon, az előzőekben leírtak szerint. 16, 17 A vérnyomásmérés második napját követően egy éjszakai vizeletgyűjtést (16: 00-08: 00 között) nyertünk a vizelet nátrium-, kreatinin- és albumin kiválasztási sebességének mérésére. Az adatok 24 órás időtartamra normalizálódnak, ezért túlértékelhetik a kiválasztási paramétereket ezekben az éjszakai állatokban. Az utolsó napon artériás plazmamintákat nyertünk a plazma kreatinin-koncentráció mérésére, miközben a patkányokat magas NaCl-étrenden tartották.

A vizelet elektrolitjait lángfotometriával mértük (IL-943, Instrumentation Laboratories, Lexington, MA). A plazma és a vizelet kreatinin értékeket egy Jaffé Reaction by autoanalyzer (ACE, Alfa Wasserman, Fairfield, NJ) alapján végzett méréssel mértük. A vizeletalbumin mennyiségét fluoreszcens vizsgálattal határoztuk meg, amely Albumin Blue 580 festéket (Molecular Probes, Eugene, OR) és fluoreszcens lemezolvasót (FL600, Bio-Tek, Winooski, VT) használt.

Szövettani és immunhisztokémiai elemzés

A veséket szövettani és immunhisztokémiai analízishez állítottuk elő, az általunk korábban leírt módszerekkel. 17, 18, 19 A patkányokat nátrium-pentobarbitállal (50 mg/kg, ip) altattuk; a veséket ezután eltávolítottuk és 10% -os formaldehid-oldatba helyeztük. A szövetet paraffinba ágyazottuk (Microm HMP 300), 3 µm-es metszetekre vágtuk (Microm HM355S), felhelyeztük és Gomori egylépéses trikromjával festettük. Az egyes glomerulusokat (patkányonként átlagosan 37) Raij és munkatársai módszerével értékeltük. Az immunhisztokémia céljából a tárgylemezeket paraffinizáltuk, és a proteináz K-val inkubáltuk az antigén visszaszerzéséhez. A T-sejtek kimutatására használt elsődleges monoklonális antitest az anti-CD43 (Abcam) volt. Biotinilezett ló anti-egér szekunder antitestet alkalmaztunk avidin-biotinilezett torma-peroxidáz komplexummal történő fejlesztéshez (Vectastain ABC kitek; Vector Laboratory, Burlingame, CA). A tárgylemezeket anilinkék színezékkel enyhén ellenfestették és lefényképezték.

T-sejtek izolálása

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± standard hibaként mutatjuk be. A kísérleteket csoportonként 5-10 patkányon végeztük. Egyirányú varianciaanalízist alkalmaztunk a különböző étrenden tartott patkányok közötti paraméter-különbségek meghatározására. Tukey post-hoc tesztet alkalmaztunk, ha ez helyénvaló. Párosítatlan t-tesztet alkalmaztunk két csoport közötti különbségek értékelésére. A 95% -os konfidencia intervallumot szignifikánsnak tekintették.

EREDMÉNYEK

A magas sótartalmú artériás vérnyomás szignifikánsan megemelkedett a magas fehérjetartalmú étrenddel (153 ± 7 Hgmm) táplált SS patkányokban, összehasonlítva az alacsony vagy normál fehérjetartalmú étrendet fogyasztókkal (1. ábra - teteje). Az alacsony és normál fehérjetartalmú táplálékkal etetett patkányok között nem tapasztaltunk különbséget. A magas NaCl-étrenddel táplált patkányok pulzusszáma az alacsony vagy magas fehérjetartalmú étrend-csoportokban nem változott a normál fehérje-patkányokban mért értéktől (389 ± 14 ütés/perc). A vesebetegség indexeként azt figyelték meg, hogy a magas sótartalmú patkányokban a vizelettel történő albumin kiválasztási arány közvetlenül összefügg az étrend fehérjetartalmával. Az albumin és a kreatinin aránya a vizeletben körülbelül tízszer nagyobb volt a magas fehérjetartalmú étrenddel táplált patkányoknál, mint az alacsony fehérjetartalmú étrendet fogyasztó patkányoknál (1. ábra - alsó rész). Az albumin és a fehérje kiválasztási sebessége átlagosan 114 ± 37 mg/nap, illetve 220 ± 45 mg/nap volt a magas fehérjetartalmú patkányokban. Az állandó állapotú nátrium-kiválasztási arány nem volt különbözõ a csoportok között, és átlagosan 10 ± 2 mEq/nap volt azokban a normál fehérje patkányokban, akiket magas NaCl-tartalommal tápláltak.

Az átlagos artériás vérnyomás (MAP, felső) és a vizelet albumin/kreatinin kiválasztási arány (alsó) SS/Mcw patkányokban magas, normál vagy alacsony fehérjetartalmú étrendben 14 hétig. A méréseket 3 hét után magas NaCl (4,0%) étrenden végeztük. * jelzi p 2. ábra. A korábbi, 18, 19 jelentésekkel összhangban nagy mennyiségű kék fibrotikus szövet jelenléte összeesett glomeruláris kapillárisokkal nyilvánvaló a magas fehérjetartalmú étrendet tápláló SS/Mcw veséiben. Az alacsony fehérjetartalmú étrendet fogyasztó patkányok veséiben láthatóan kevesebb glomeruláris károsodás látható, annak ellenére, hogy a nátrium-bevitel hasonló volt. A glomeruláris sérülési index (2. ábra - alul) szignifikánsan nagyobb volt a magas fehérjetartalmú étrendet (2,2 ± 0,1) tartalmazó Dahl SS/Mcw patkányokban, mint a normál (1,4 ± 0,2) vagy alacsony fehérjetartalmú étrendben (1,5 ± 0,3) táplált patkányokban ). Az étkezési fehérjetartalom glomeruláris szövettani károsodásra, valamint az albumin és a fehérje kiválasztódására gyakorolt hatása ellenére a kreatinin-clearance nem mutatott különbséget. Noha a magas só tudatos kreatinin-clearance-e a megnövekedett fehérjebevitel mellett csökkenni szokott, a magas (0,48 ± 0,12 ml/perc/gkwt) vagy az alacsony (0,66 ± 0,10 ml/perc/gkwt) táplált csoportokban nem volt más. fehérjetartalom a normál fehérjetartalmú Dahl SS patkányokban mért 0,62 ± 0,06 ml/perc/gkwt átlaghoz képest.

Jelen adatok olyan mechanizmusokat tárhatnak fel, amelyek révén a magas fehérjetartalmú étrend súlyosbíthatja a vesebetegségeket és a magas vérnyomást. Bár a magas fehérjetartalmú étrend nem bizonyítottan meggyőzően indukál vesebetegséget normál egyéneknél, az epidemiológiai és kísérleti adatok azt mutatják, hogy a megemelkedett fehérjetartalom káros a már meglévő vesebetegségben szenvedő alanyokban. 6, 7, 8, 9 Ez a megfigyelés összhangban áll a Brenner és munkatársai által feltett hipotézissel, amelyben feltételezték, hogy a megnövekedett fehérjebevitel vese vazodilatációhoz és megnövekedett glomeruláris kapilláris hidrosztatikus nyomáshoz vezethet, ami eredményezheti glomeruláris károsodást. A fehérje által kiváltott vese-dilatáció a Dahl SS patkányban, amely hajlamos a glomeruláris károsodásra és a magas vérnyomásra, felgyorsíthatja a betegség folyamatát.

A változó fehérjebevitel vérnyomáshatásait szintén nem figyelték fel következetesen. 34 A magas fehérjetartalmú étrendről kimutatták, hogy a magas vérnyomás genetikai modelljében növeli a vérnyomást. 10 A klinikai adatok azt mutatják, hogy a magas fehérjetartalmú étrend emelheti az artériás vérnyomást a 35, 36 betegeknél, bár más emberi adatok fordított összefüggést mutatnak a vérnyomás és a fehérje bevitel között. 37, 38 Megjegyzendő, hogy egy korábbi patkányokon végzett vizsgálat kimutatta, hogy a normál Lewis patkányok fehérje-túlterhelése nagy mennyiségű szarvasmarha-szérumalbumin intraperitoneális injekciójával az immunsejtek beszivárgásához, vesekárosodáshoz és sóérzékeny magas vérnyomáshoz vezetett. Érdekes, hogy ezeknek a patkányoknak a vese medullájában a szövettani változások leírása hasonló volt a magas sótartalmú Dahl SS patkányoknál megfigyeltekhez, bár a fehérje-túlterheléses patkányok glomeruláris károsodása kevésbé súlyosnak bizonyult, mint a Dahl esetében SS. Jelen adatok alátámasztják azt az elképzelést, hogy az étrendi fehérjebevitel fokozása fokozza a magas vérnyomást egy genetikai állatbetegség modelljében.

A jelen kísérletben a normál fehérje/magas sótartalmú étrendet tápláló Dahl SS patkányok gyengítették a magas vérnyomás és a vesebetegség fenotípusait, összehasonlítva a korábbi adatokkal, melyeket Dahl SS/Mcw patkányokkal azonos AIN-76A táplálékkal tápláltunk. Bár a jelen vizsgálatban alkalmazott Dahl SS patkányok genetikailag megegyeznek a korábban vizsgáltakkal, a jelen vizsgálatban szereplő állatokat kereskedelmi forgalmazótól szerezték be. Korábbi, ezen a területen végzett munkánk alapján, amely azt jelezte, hogy az anyáknak a terhesség és az elválasztás során táplált étrendnek jelentős hatása lehet a betegség végső fenotípusára (16, 17), feltételezzük, hogy a betegség végső fenotípusának mértékében a különbség a Charles River folyó terhességi és szoptatási ideje alatt a tenyészállománynak táplált étrendnek tulajdonítható (Purina 5L79, gabonaalapú étrend), összehasonlítva az AW-76A étrenddel, amelyet az MCW tenyésztelepén tápláltak.

PERSPEKTÍVOK

Jelen kísérletek bemutatják a magas fehérjetartalmú étrend káros hatásait a sóérzékeny magas vérnyomás állatmodelljében. Az eredmények azt mutatják, hogy a magas NaCl bevitel káros hatásai súlyosbodnak a Dahl SS/Mcw patkányokban, amikor a magas fehérje bevitel hátterére kerülnek. Az ebben a vizsgálatban azonosított egyik lehetséges mechanizmus összefüggésbe hozható az immunsejtek, különösen a T-limfociták beszivárgását elősegítő tényezőkkel. További vizsgálatokra lesz szükség a T-sejtek beszivárgásához vezető mechanizmusok felderítéséhez ezen hipertóniás állatmodellben, valamint azoknak a mechanizmusoknak a felderítésére, amelyeket ezek a sejtek felhasználhatnak a betegség fenotípusainak megváltoztatására.

Köszönetnyilvánítás

FINANSZÍROZÁSI FORRÁSOK

Ezt a munkát részben támogatta a HL-29587 és a DK-62803 egészségügyi támogató intézetek.

Lábjegyzetek

Kiadói nyilatkozat: Ez egy szerkesztetlen kézirat PDF-fájlja, amelyet kiadásra elfogadtak. Ügyfeleink számára nyújtott szolgáltatásként a kéziratnak ezt a korai változatát biztosítjuk. A kézirat átmásolásán, szedésén és a kapott bizonyíték felülvizsgálatán átesik, mielőtt a végső hivatkozható formában közzétennék. Felhívjuk figyelmét, hogy a gyártási folyamat során olyan hibákat fedezhetnek fel, amelyek befolyásolhatják a tartalmat, és a naplóra vonatkozó minden jogi felelősségvállalás vonatkozik.

ÉRDEKKONFLIKtus/KÖZZÉTÉTEL