Idegen gének és új hidrofil fehérjegének vesznek részt a

ÖSSZEFOGLALÁS

BEVEZETÉS

Bizonyos organizmusok képesek túlélni a belső víz szinte teljes veszteségét, anhidrobiózisnak nevezett felfüggesztett animáció állapotába kerülve. Amikor a víz újra elérhetővé válik, a szervezet újraéleszti és folytatja normális tevékenységét. Ezeket az organizmusokat „alvó szépségeknek” nevezik, mivel úgy tűnik, hogy a nyugalmi állapotban nem öregednek (Hengherr et al., 2008; Ricci és Covino, 2005). A kiszáradási tolerancia viszonylag elterjedt a prokarióták és az egysejtű eukarióták között [pl. pékélesztő, Saccharomyces cerevisiae (Potts, 1994)], de ritkábban fordul elő a többsejtű eukariótákban, mivel a növények (főleg a magvak és a virágpor), számos feltámadási növény és néhány gerinctelen növény életének egyes szakaszaiban jól ismert példákkal rendelkezik. az ízeltlábúak, a tardigrádák, a fonálférgek és a bdelloid rotifers között (Alpert, 2006; Clegg, 2001).

Egyes organizmusokban a di- és oligoszacharidok, különösen a nem redukáló trehalóz (állatokban) és a szacharóz (növényekben) szintjének növekedése összefüggésben áll a kiszáradás túlélésének képességével (Crowe et al., 1998; Hoekstra és mtsai., 2001). Például a Polypedilum vanderplanki kironomid anhidrobiotikus lárvája száraz tömegre számítva ~ 18% trehalózt halmoz fel, miközben vizet veszít, és a trehalóz szintje korrelál az egyedek túlélésének változásával (Watanabe et al., 2002). Az ilyen összefüggések, valamint a trehalóz in vitro erőteljes stabilizáló tulajdonságai (Colaco és mtsai., 1992) anhidrobiosis modellekhez vezettek, amelyekben a nem redukáló diszacharidok központi szerepet játszanak, és leggyakrabban vízcserét vagy üvegesítést javasolnak nekik. funkciók (Crowe és mtsai, 1998; Crowe és mtsai, 1992). Azonban nem ez a teljes történet (Tunnacliffe és Lapinski, 2003): például a bdelloid rotifers nem tartalmaz trehalózt, és nyilvánvalóan hiányoznak a szintéziséhez szükséges gének (Caprioli et al., 2004; Lapinski and Tunnacliffe, 2003). A S. cerevisiae élesztőben, amelynek deszikkációs toleranciája jól igazolható, a trehalóz szintézise mutációval megszüntethető, a túlélés csak mérsékelt csökkenésével (Ratnakumar és Tunnacliffe, 2006).

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Rotifer karbantartás

A bdelloid rotifer Adineta ricciae Segers és Shiel, 2005-t (korábban Adineta sp. 1 néven ismerték) modellként alkalmazták a génszabályozást egy kiszáradás-toleráns organizmusban. Az A. ricciae klón tenyészeteit műanyag palackokban vagy lombikokban tartottuk; vagy vízszintesen tartott műanyag hengeres palackokat használtunk (Corning Life Sciences, Amszterdam, Hollandia), hogy maximalizáljuk a felület/térfogat arányt, kb. 300 ml autoklávozott, rendkívül nagy tisztaságú (UHP) vízzel, vagy sejttenyésztő lombikokkal (35 és 175 között). cm 2, szűrőkupakkal) (Nunc, Roskilde, Dánia) 12–200 ml ugyanolyan vízzel. A rififajtákat 22 ° C-on tartottuk, és 1-3 naponta egyszer RAGO-val etettük (Rotifer és Artemia GrowOut; www.aquaculturesupplies.co.uk: 15 gl –1 törzsoldat vízben előkészítve, autoklávban, hagytuk lehűlni és ülepedni; tápanyagként felülúszót használtunk) vagy Escherichia coli [Luria táptalajban (LB) táptalajon növesztettük egy éjszakán át, centrifugálással kinyertük és autoklávozott UHP vízben szuszpendáltuk]. Mindkét alapanyagot fagyasztva tároltuk, és 4 ° C-on tartottuk néhány napig a használat során.

Rotifer kiszáradás

Korábban kimutatták, hogy az A. ricciae akár ~ 80% -os sebességgel is képes túlélni a kiszáradást (Ricci et al., 2004; Ricci és Covino, 2005), és hasonló túlélési arány figyelhető meg kezünkben, az alkalmazott szárítási protokolltól függően. A szárítandó rotifereket szűréssel összegyűjtöttük: a tartályt néhányszor rázattuk a rotiferek leválásához, majd a rotifer szuszpenziót 20 μm vagy 5 μm Nitex szűrőn (Sefar, Heiden, Svájc) átszűrtük. A szűrőkön összegyűjtött állatokat három különböző szárítási eljárás egyikének megfelelően szárítottuk (Ricci és mtsai, 2003). Az első két módszerhez környezeti tesztkamrát (Temperature Applied Sciences Ltd., Goring, Egyesült Királyság) használtak, ahol a hőmérséklet és a relatív páratartalom (RH) szabályozható. Az első protokollban a Ricci B, RH értéke 98% -ról 40% -ra csökken 15 óra alatt, majd további 153 órán át 40% relatív páratartalom mellett marad; a második protokollban Ricci C, RH-t 98% RH-n tartjuk 72 órán át. A harmadik eljárásban, amelyet hat gén abszolút mRNS-kvantifikálására használtunk, a szűrőt két Whatman-papír közé helyeztük, 1 ml autoklávozott UHP-vízbe áztatva, és szobahőmérsékleten 24 órán át lezárt állapotban hagytuk (RH ~ 100%); ezt követően a Petri-csészét kinyitottuk és 48 órán át hagytuk, amíg a szűrő kiegyenlítődött a környezeti páratartalommal (~ 33% RH). A kontroll, nem szárított rotiforfiákat is összegyűjtöttük a szűrőkön, de az RNS-t azonnal kivontuk.

RNS extrakció

Az RNS-t TRIzol reagenssel (Invitrogen, Paisley, Egyesült Királyság) extraháltuk a gyártó protokollja szerint, etanollal mostuk és dietil-pirokarbonáttal kezelt vízben újraszuszpendáltuk. Az RNS-koncentrációt NanoDrop (ND-1000) spektrofotométerrel (Thermo Fisher Scientific, Loughborough, Egyesült Királyság) mértük, és a minőséget az abszorpciós spektrumok és az A260/280 és A260/230 arány elemzésével értékeltük.

EST könyvtárépítés

Bioinformatika és szekvenciaelemzés

A kivonási könyvtár DNS-szekvenciáit különféle szoftvercsomagokkal elemeztük: 4Peaks (1.7.2 verzió, www.mekentosj.com), ApE (A plasmid Editor, 1.17 verzió, http://www.biology.utah.edu/jorgensen/ wayned/majom) és a Geneious Pro (4.8.4 verzió, www.geneious.com). A sikertelen szekvenciákat (pl. Megkülönböztethetetlen csúcsokkal rendelkező szekvenciákat vagy többszörös/átfedő leolvasásokat) ebben a szakaszban elvetettük, és a jóváhagyott szekvenciákat blastx-szal elemeztük (Altschul et al., 1990) (blastx verziók 2.2.21–2.2.23, nem redundánsak). fehérje adatbázis). A kiválasztott EST-k további elemzését a tblastx alkalmazásával végeztük.

Azok a szekvenciák, amelyek E-05-nél alacsonyabb E-05 értékkel rendelkeznek a blastx-keresésben, meghatározott találatoknak tekinthetők, míg az E-05-nél magasabb E-értékű szekvenciákat újszerűnek tekintették. Az első esetben a szekvenciákat a 10 funkcionális kategória egyikéhez rendeltük. Ahol nem találtak egyezést a blastx-szel, ott a Geneious Pro-val a hat lehetséges nyitott leolvasási keretet (ORF) kaptuk, és a leghosszabbat tovább elemeztük. A fizikai-kémiai jellemzőket különböző szoftvercsomagokkal vezették le. A bdelloid mRNS-ek (Pouchkina-Stantcheva és Tunnacliffe, 2005) és a poli (A) farokszekvenciák 5 'végén található spliced vezető jelenlétét a Geneious segítségével határoztuk meg; a hidrofilitást az ExPASy ProtScale (http://www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) alkalmazásával értékeltük; az elméleti pI-t, a töltött maradékok számát, a GRAVY-indexet (nagy átlag hidropátia) és a glicintartalmat az ExPASy ProtParam eszközzel számoltuk (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html); rendellenesség-előrejelzéseket a PONDR-nél végeztek (Predictors of Natural Disordered Regions; http://www.pondr.com) Uversky-diagramok, VL-TX és VL3 algoritmusok felhasználásával (Li et al., 1999; Radivojac et al., 2003), és a FoldIndex-szel (Prilusky és mtsai, 2005) (http://bip.weizmann.ac.il/fldbin/findex).

Filogenetikai elemzés

Néhány EST külföldi eredetének alátámasztására filogenetikai elemzéseket végeztek a Geneious alkalmazásával. Az ORF-eket blastp és aminosav szekvenciákkal elemeztük, amelyek megfelelnek a tíz legjobb faj egyezésnek, és letöltöttük, valamint illesztettük a ClustalW-hez, és építettünk egy Szomszéd-Csatlakozó fát (Jukes-Cantor genetikai távolság modell; anélkül, hogy a priori outgroup-ot jelölnénk ki). A rendszerindítási támogatást 1000 iterációval számoltuk, és a taxonokat színkóddal láttuk el a konszenzus fában. A szekvenciákat ott szüntették meg, ahol a hosszú ágak miatt az összes többi ág összeomlott.

Mennyiségi PCR

A dehidratáció előtti és utáni génexpressziós profilt általában relatív valós idejű kvantitatív PCR-rel (qPCR) vizsgálták, normalizálva a génexpressziót egy referenciagénnel szemben, amelynek expressziós szintje várhatóan állandó marad, vagy majdnem ilyen (akár aktin, akár 18S, akár mindkettő). A sablon cDNS-t a fent leírtak szerint állítottuk elő, és az összes PCR-t RotorGene 3000-ben futtattuk SYBR-Green PCR kit (Qiagen) alkalmazásával. Számos esetben az abszolút mennyiségi meghatározást ugyanazzal a műszerrel hajtottuk végre, a Real-Time RT-qPCR kit (Qiagen) felhasználásával, amint azt korábban leírtuk (Browne és mtsai, 2004). Ebben az esetben a baktériumok törzséből származó plazmid DNS-t midi-prep kit-del (Qiagen) extraháltuk, ultraibolya abszorbanciával NanoDrop 1000 spektrofotométerrel (Thermo Fisher Scientific) számítva, in vitro MEGAscript Kit-lel (Applied Biosystems/Ambion, Warrington) írva, Egyesült Királyság), a gyártó utasításai szerint T7 vagy SP6 polimerázt alkalmazva, a fragmens orientációjától függően, és a célmolekulák soros hígítással számszerűsítve (általában 0,001–1000 ng μl –1 tartományban).

EREDMÉNYEK

A dehidrációra reagáló gének EST-könyvtára

A maximális túlélés érdekében a bdelloid rotiferek lassú száradási sebességet igényelnek (Lapinski és Tunnacliffe, 2003; Ricci és mtsai, 2003), ezért indokoltuk, hogy számos metabolikus alkalmazkodást kell aktiválni a sikeres anhydrobiosis érdekében ezekben a gerinctelenekben. A transzkripciós szinten szabályozott adaptációk azonosításának megkísérléséhez létrehoztunk egy olyan EST könyvtárat, amelyet gazdagítottunk olyan szekvenciákra, amelyek 24 órás szárítás után felülreprezentáltak a bdelloid transzkriptómban, a nem szárított kontrollokhoz képest. A kezdeti 93 olvasható szekvenciát tovább elemeztük a lehetséges duplikátumok után, összesen 75 egyedi feltételezett jelöltet kapva, amelyeket azután a BLAST kereső eszközzel összehasonlítottunk az ismert szekvenciákkal. A Blastx 36 szekvenciát adott vissza, szignifikáns egyezéssel az adatbázisokban (az 1. táblázatban felsorolva), és a fennmaradó 39 EST-t új szekvenciaként vonta be (a legközelebbi egyezési pontozás> E – 05). Közülük nyolc EST (F24-15, F24-19, F24-26, F24-31, F24-38, F24-54, F24-91 és F24-98; HO188837, HO188839, HO188841, HO188843, HO188845, belépési számok) HO188853, HO188864 és HO188866) nem mutattak egyértelmű ORF-eket (≥50 aminosav), ezért kizárták őket a további elemzésekből; a fennmaradó 31 EST-t a 2. táblázat tartalmazza. A tiszta ORF nélküli szekvenciák közül három (F24-15, F24-38 és F24-98) bekerült az expressziós profil vizsgálatokba (lásd alább).

Expressz szekvencia címkék (EST) az A. ricciae-ból, jelentős adatbázis-egyezésekkel; 10 funkcionális kategóriában

Blastx-analízissel nyílt leolvasási keretek (ORF) elemzése expresszált szekvencia címkékből (EST) jelentős adatbázis-egyezések nélkül; azaz „regény” szekvenciák

Az adatbázis-egyezéssel rendelkező EST-k idegen géneket tartalmaznak

A horizontális géntranszferből potenciálisan eredő A. ricciae gének expresszált szekvencia címkéi

A fennmaradó négy EST esetében azonban a tblastx eredmények alátámasztották a megfelelő gének exogén eredetét. Az F24-2, amelynek szekvenciája hasonlóságot mutat az ismeretlen funkciójú glükóz-reprezentálható génekkel, nem adott találatot E-értékkel 9,0). Így a 31-ből nyolc, vagyis 26% az új szekvenciák valószínűleg hidrofil IDP-k, vagy legalább tartalmaznak belső rendezetlen régiókat (IDR-eket). Szigorúbb megközelítéssel, amely a rendellenesség négy kritériuma közül három teljesülését igényli, három EST-t (F24-49, F24-82, F24-106) elvetettek (világosszürke árnyékolás a 2. táblázatban), így a 31-ből öt vagy 16% hidrofil IDP-ként. Az EST-adatkészlet egészéből (összesen 67 EST, kivéve a nyolc felismerhető ORF nélküli EST-t) a hidrofil IDP-k az alkalmazott kiválasztási szempontoktól függően 12, illetve 7% -ot tettek ki. Ez az eukarióta proteomokban az IDP reprezentáció értékeinek tartományán belül van (Dunker és mtsai., 2000; Tompa, 2009), és ezért arra utal, hogy az ilyen fehérjék nincsenek felülreprezentálva a bdelloid rotiferben. Az azonosított külföldiek nem tartalmaznak nagy mennyiségű glicint, ezért nem felelnek meg a „hidrofilinek” meghatározásának (Garay-Arroyo et al., 2000), ahol minimum 6% glicint írtak elő.

Filogenetikai fa az F24-20 feltételezett fő méhpempő fehérje/glükonolaktonáz számára. Szomszéd csatlakozó konszenzusfa bootstrap támogatással 1000 iteráció után (a bootstrap támogatás csak a főbb ágaknál van feltüntetve). A taxonok színkóddal jelennek meg: fekete, metazoa; rózsaszínű, gombák; kék, baktériumok; szürke, egyéb. Az F24-20 expresszált szekvencia címke piros színű. A skála az aminosav-helyettesítések számát mutatja helyenként.

Gén expressziós profilok

VITA

A. ricciae génszabályozás különböző szárítási rendszerek alatt. Az expressz szekvencia címkék az y tengelyen vannak felsorolva, kategóriák csoportjaira vannak osztva, és a hajtásszabályozás az x tengelyen látható (log skála). A folytonos függőleges vonal azt jelzi, hogy a transzkriptum szintje nem változik, és a szegélyező szaggatott vonalak 0,5, illetve 2-szeres szabályozást jelentenek; az ezeken a határokon belüli értékek nem vagy marginális szabályozást jelentenek. A szimbólumok különböző kiszárítási protokollokat jelölnek (piros, Ricci B; kék, Ricci C; zöld, szárítás Petri-csészében - levegőn szárított) és az alkalmazott qPCR típusát (körök, relatív mennyiségi meghatározás; háromszögek, abszolút mennyiségi meghatározás). Az adatpontok összehasonlításának megkönnyítése érdekében ugyanazon gén különböző értékeit egy vízszintes vonal köti össze. Az idegen génekből származó EST-ket tiszta fekete négyzet vázolja (a 3. táblázatban felsoroltak szerint); Az „újszerű” hidrofil és belső rendellenességű fehérje EST-k sötétszürke vagy világosszürke árnyalatúak az azonosításukra vonatkozó többé-kevésbé szigorú kritériumok szerint (lásd 2. táblázat).

Csak egyféle LEA fehérje szekvencia jelenléte az EST adatkészletben arra késztetett minket, hogy más típusú strukturálatlan hidrofil fehérjéket keressünk, amelyeknek hasonló szerepük lehet a szárítási toleranciában. Nem találtunk példát egy „hidrofilinre” (Garay-Arroyo és mtsai, 2000), vagyis mind magas hidrofilicitással, mind magas glicintartalommal, de feltártunk olyan hidrofil jelölteket, akiknek bizonyos fizikai-kémiai jellemzőik voltak a LEA fehérjékkel. Az öt legerősebb jelölt közül hármat szabályoznak az elpárolgási vízvesztés során, és így részt vesznek a szárítási stressz válaszában. Ezenkívül legalább 12 további új szekvenciát is folyamatosan szabályoz a dehidratáció; mivel e gének funkciója teljesen ismeretlen, érdekes lehetőséget jelentenek a további vizsgálatokra.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetet mondunk Prof. Tim Barraclough-nak (Imperial College, London) és Dr. Esther Lubzens-nek (Izraeli Oceanográfiai és Limnológiai Kutatások) a kézirattal kapcsolatos hasznos megjegyzésekért.

LÁBJEGYZETEK

Pres * Jelenlegi cím: 712 Darwin Center, Állattani Tanszék, Természettudományi Múzeum, Cromwell Road, London SW7 5BD, Egyesült Királyság