A glutamin-kiegészítés elnyomja a herpes simplex vírus reaktivációját

Kening Wang, 1 Yo Hoshino, 1 Kennichi Dowdell, 1 Marta Bosch-Marce, 2 Timothy G. Myers, 3 Mayra Sarmiento, 1 Lesley Pesnicak, 1 Philip R. Krause, 2 és Jeffrey I. Cohen 1

1 Fertőző betegségek laboratóriuma, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

glutamin-kiegészítés

2 Biológiai Értékelési és Kutatási Központ, Élelmiszer- és Gyógyszerigazgatás, Silver Spring, Maryland, USA.

3 Kutatási Technológiai Osztály, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

Cím levelezés: Jeffrey I. Cohen, 50. épület, 6134. szoba, 50 South Drive, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892-8007, USA. Telefon: 301.496.5265; E-mail: [email protected].

Szerzői megjegyzés: K. Wang és Y. Hoshino egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

1 Fertőző betegségek laboratóriuma, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

2 Biológiai Értékelési és Kutatási Központ, Élelmiszer- és Gyógyszerigazgatás, Silver Spring, Maryland, USA.

3 Kutatási Technológiai Osztály, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

Cím levelezés: Jeffrey I. Cohen, 50. épület, 6134. szoba, 50 South Drive, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892-8007, USA. Telefon: 301.496.5265; E-mail: [email protected].

Szerzői megjegyzés: K. Wang és Y. Hoshino egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

Hoshino, Y. cikkeit itt találja: JCI | PubMed | Google ösztöndíjas

1 Fertőző betegségek laboratóriuma, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

2 Biológiai Értékelési és Kutatási Központ, Élelmiszer- és Gyógyszerigazgatás, Silver Spring, Maryland, USA.

3 Kutatási Technológiai Osztály, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

Cím levelezés: Jeffrey I. Cohen, 50. épület, 6134. szoba, 50 South Drive, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892-8007, USA. Telefon: 301.496.5265; E-mail: [email protected].

Szerzői megjegyzés: K. Wang és Y. Hoshino egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

Dowdell, K. cikkeit itt találja: JCI | PubMed | Google ösztöndíjas

1 Fertőző betegségek laboratóriuma, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

2 Biológiai Értékelési és Kutatási Központ, Élelmiszer- és Gyógyszerigazgatás, Silver Spring, Maryland, USA.

3 Kutatási Technológiai Osztály, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

Cím levelezés: Jeffrey I. Cohen, 50. épület, 6134. szoba, 50 South Drive, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892-8007, USA. Telefon: 301.496.5265; E-mail: [email protected].

Szerzői megjegyzés: K. Wang és Y. Hoshino egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

Bosch-Marce, M. cikkei: JCI | PubMed | Google ösztöndíjas

1 Fertőző betegségek laboratóriuma, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

2 Biológiai Értékelési és Kutatási Központ, Élelmiszer- és Gyógyszerigazgatás, Silver Spring, Maryland, USA.

3 Kutatási Technológiai Osztály, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

Cím levelezés: Jeffrey I. Cohen, 50. épület, 6134. szoba, 50 South Drive, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892-8007, USA. Telefon: 301.496.5265; E-mail: [email protected].

Szerzői megjegyzés: K. Wang és Y. Hoshino egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

1 Fertőző betegségek laboratóriuma, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

2 Biológiai Értékelési és Kutatási Központ, Élelmiszer- és Gyógyszerigazgatás, Silver Spring, Maryland, USA.

3 Kutatási Technológiai Osztály, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

Cím levelezés: Jeffrey I. Cohen, 50. épület, 6134. szoba, 50 South Drive, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892-8007, USA. Telefon: 301.496.5265; E-mail: [email protected].

Szerzői megjegyzés: K. Wang és Y. Hoshino egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

Sarmiento, M. cikkeit itt találja: JCI | PubMed | Google ösztöndíjas

1 Fertőző betegségek laboratóriuma, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

2 Biológiai Értékelési és Kutatási Központ, Élelmiszer- és Gyógyszerigazgatás, Silver Spring, Maryland, USA.

3 Kutatási Technológiai Osztály, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

Cím levelezés: Jeffrey I. Cohen, 50. épület, 6134. szoba, 50 South Drive, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892-8007, USA. Telefon: 301.496.5265; E-mail: [email protected].

Szerzői megjegyzés: K. Wang és Y. Hoshino egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

Pesnicak, L. cikkeit itt találja: JCI | PubMed | Google ösztöndíjas

1 Fertőző betegségek laboratóriuma, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

2 Biológiai Értékelési és Kutatási Központ, Élelmiszer- és Gyógyszerigazgatás, Silver Spring, Maryland, USA.

3 Kutatási Technológiai Osztály, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

Cím levelezés: Jeffrey I. Cohen, 50. épület, 6134. szoba, 50 South Drive, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892-8007, USA. Telefon: 301.496.5265; E-mail: [email protected].

Szerzői megjegyzés: K. Wang és Y. Hoshino egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

1 Fertőző betegségek laboratóriuma, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

2 Biológiai Értékelési és Kutatási Központ, Élelmiszer- és Gyógyszerigazgatás, Silver Spring, Maryland, USA.

3 Kutatási Technológiai Osztály, Országos Allergia és Fertőző Betegségek Intézete, NIH, Bethesda, Maryland, USA.

Cím levelezés: Jeffrey I. Cohen, 50. épület, 6134. szoba, 50 South Drive, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892-8007, USA. Telefon: 301.496.5265; E-mail: [email protected].

Szerzői megjegyzés: K. Wang és Y. Hoshino egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

Publikálva 2017. június 5 - További információk

A krónikus vírusfertőzéseket nehéz kezelni, ezért új megközelítésekre van szükség, különösen azokra, amelyek a reaktiváció csökkentését célozzák az immunválaszok fokozásával. A herpes simplex vírus (HSV) létrehozza a látenciát és gyakran újraaktiválódik, és a szuppresszív antivirális terápia ellenére áttörési reaktiváció léphet fel. A vírusspecifikus T-sejtek fontosak a HSV szabályozásában, és az aktivált T-sejtek szaporodása megköveteli a glutamin fokozott metabolizmusát. Itt azt tapasztaltuk, hogy az orális glutaminnal történő kiegészítés csökkentette a vírus reaktivációját látensen HSV-1-fertőzött egerekben és HSV-2-fertőzött tengerimalacokban. A látensen HSV-1-fertőzött, glutaminnal kezelt WT egerek trigeminus ganglionjainak transzkriptómanalízise számos IFN-γ-indukálható gén upregulációját mutatta. A WT egerekkel ellentétben a kiegészítő glutamin hatástalan volt a HSV-1 reaktiváció sebességének csökkentésében a látensen HSV-1-fertőzött IFN-γ – KO egerekben. A glutaminnal kezelt egereknél a HSV-specifikus IFN-y-termelő CD8 T-sejtek száma is nagyobb volt a látensen fertőzött ganglionokban. Így a glutamin fokozhatja az IFN-y-asszociált immunválaszt és csökkentheti a látens vírusfertőzés reaktivációjának sebességét.

Az Egyesült Államokban az emberek körülbelül 60% -a 1. típusú herpes simplex vírussal (HSV-1), 20% -a pedig HSV-2-vel fertőzött. Az acyclovir vagy valacyclovir profilaktikus terápiája 40% -60% -kal, a genitális herpesz reaktivációjának aránya 70% -80% -kal csökkenti a herpesz (herpes labialis) kiújulásának mértékét. Ezért más megközelítésekre van szükség a HSV reaktivációjának csökkentésére. A HSV reaktivációjának kontrollja korrelál a vírusspecifikus T-sejtekkel (1). A T-sejtek fokozott funkciója csökkentheti a vírus reaktivációját. A tápanyagok, beleértve a glükózt és bizonyos aminosavakat, kritikus fontosságúak a T-sejtek aktiválásához (2). Az aktivált T-sejtek megnövekedett glükóz- és glutamin-metabolizmust igényelnek a szaporodáshoz, és e molekulák hiánya vagy gátlása csökkenti a T-sejtek proliferációját (3, 4).

A HSV-1 reaktiválása az egerek trigeminus ganglionjaiban, amelyek ivóvizükben glutamint, glicint vagy kiegészítést nem kaptak. Az állatokat szaruhártya-hegesítéssel oltottuk be HSV-1-gyel, 2 héttel később kiegészítő aminosavat kaptak, majd további 2 hét múlva érzéstelenítették és a szemüket UV-besugárzásnak tették ki. Két nappal később az állatokat eutanizálták, a trigeminus ganglionokat eltávolították és homogenizálták, a homogenizátumokat Vero sejt monorétegekre helyezték, és meghatározták a reaktivált vírussal rendelkező ganglionok számát. Három külön kísérletet hajtottak végre (A-C), és mindhárom kísérlet tenyésztési eredményeit az 5. napon mutatjuk be (D). Az 1. kísérletben 25 egér volt mindegyik csoportban, a 2. és 3. kísérletben pedig 15 egér volt a glutamin és a glicin csoportban, illetve 7, illetve 10 egér volt a kiegészítés nélküli csoportban. Fisher pontos tesztjét használták a statisztikákhoz.

A genitális HSV-2 kiújulási aránya tengerimalacokban, akik glutamint kaptak, vagy ivóvízükben nem adtak kiegészítést. Az állatokat intravaginálisan oltottuk be HSV-2-vel, majd a gyógyulás után (2 héttel később, a 15. napon) 2 csoportra osztottuk őket (az akut fertőzés utáni elváltozások pontszáma alapján) és glutamint adtunk a 2 csoport egyikének ivóvízéhez. Az állatokat megismételtük, és a betegség pontszámokat kaptunk minden nap; Az egyes csoportokban egy tengerimalacra jutó kumulatív kiújulások átlagos számát két külön kísérletben ábrázoltuk (A és B). A kezelési periódusok végén az összes állatot leállítottuk a terápiáról (kimosási időszak), és a 2 különálló kísérlet mindegyikében figyeltük megismétlődésétC és D). 1. kísérlet (A és C) csoportonként 9 állat volt; 2. kísérlet (B és D) csoportonként 15-en voltak. Kétfarkú t tesztet használtak a statisztikákhoz.

Az HSV-1 látens vírusterhelés az egér trigeminális ganglionokban (14) és a ganglionokban beszűrődő CD8 T-sejtek száma egyaránt korrelál az ex vivo reaktiváció valószínűségével (14, 15). Nagyobb vírusterhelés és alacsonyabb CD8 T-sejtek száma a reaktiváció megnövekedett sebességével jár. Ezért megvizsgáltuk, hogy az egerek glutamin-kezelése csökkenti-e a trigeminális ganglionokban a látens vírusterhelést vagy az infiltráló CD8 T-sejtek számát. A glutaminnal kezelt egerek trigeminális ganglionjaiban a latens HSV-1 DNS-szint nem különbözött szignifikánsan az egyedül glicinnel vagy vízzel kezelt állatokétól (Kiegészítő 2A. Ábra; P ≥ 0,14 Kruskal-Wallis teszttel). A glutaminnal kezelt állatokban a ganglionokba beszivárgó CD8 T-sejtek száma nem különbözött szignifikánsan azoktól az állatoktól, amelyeket csak glicinnel vagy vízzel kezeltek (2B. P = 0,58, Kruskal-Wallis teszt). Így a glutaminnal kezelt egereknél megfigyelt alacsonyabb reaktivációs sebesség nem az alacsony látens HSV-1 terhelésnek vagy a trigeminalis ganglionokban a CD8 T-sejtek összes számának növekedésének volt köszönhető.

Glutaminnal kezelt egerek trigeminus ganglionjában mindhárom mikroarray vizsgálatban felregulált sejtgének

Mivel a glutamin növelte a látensen fertőzött egerek IFN-γ-indukálta génjeinek expresszióját, megvizsgáltuk, hogy az IFN-γ expresszálására képtelen egerek nem mutatják-e a HSV-1 reaktivációjának csökkenését a glutamin-kezelés után. Ifng -/- egereket (IFN-y knockout egereket) HSV-1-vel fertőztünk, és glutaminnal vagy kiegészítés nélkül kezeltük a fentiek szerint. A reaktiváció gyakorisága magasabb volt az IFN-y knockout egerekben, mint a WT egerekben kiegészítő glutamin hiányában, feltehetően az IFN-γ szerepe miatt a vírusterhelés és a reaktiváció szabályozásában. Az IFN-γ knockout egerek glutaminnal történő kezelése csekély hatással volt a reaktiválódás sebességének csökkentésére ahhoz képest, mint azokban az állatokban, amelyek 2 független kísérletben nem kaptak kiegészítő glutamint (3. ábra, A és B ábra), összhangban azzal a megfigyeléssel, hogy a glutamin szabályozza az IFN-γ-t –Indukálható gének.

A HSV-1 reaktivációja a WT és IFN-γ knockout egerek trigeminus ganglionjaiból, valamint a HSV-1-specifikus IFN-γ-termelő CD8 T sejtek glutamint vagy kiegészítést nem kapott WT egerekben. (A és B) A HSV-1 reaktiválása a WT és IFN-γ knockout egerek trigeminus ganglionjaiból (TG), amelyek glutamint kaptak, vagy ivóvízükben nem adtak kiegészítést. Az első kísérletben 10 WT egér és 11 IFN-y knockout egér volt a glutamin csoportban, és 13 WT egér és 12 IFN-y knockout egér volt a víz csoportban (A); a második kísérletben 17 WT egér és 16 IFN-y knockout egér volt a glutamin csoportban, és 15 WT egér és 16 IFN-y knockout egér volt a víz csoportban (B). A kísérleti részleteket lásd az 1. ábra jelmagyarázatában. (C és D) A HSV-1-specifikus IFN-y-termelő CD8 T-sejtek száma 106 limfocitánként (C) és gangliononként az összes CD8 T-sejt (D) glutamint kapó egerek, vagy ivóvízükben nem tartalmaznak kiegészítést. 4 független kísérlet eredményeit összesítettük. Tíz egeret alkalmaztunk a fertőzés nélküli csoportban, és 30-at a kezelés nélküli és a glutamin csoportban. A statisztikákhoz Mann-Whitney tesztet használtak; átlag ± SEM látható.

A glutamin és az IFN-γ reaktiváció megakadályozásában betöltött szerepének további tanulmányozásához HSV-specifikus IFN-γ-termelő CD8 T-sejteket vizsgáltunk a ganglionokban, mivel ezeket a sejteket fontosnak tartják a ganglionokban történő reaktiváció megakadályozásában (16) . A glutaminnal kezelt látensen fertőzött egerekben szignifikánsan nagyobb volt a HSV-specifikus IFN-y-termelő CD8 T-sejtek száma a trigeminus ganglionokban, mint a kezeletlen állatokban (P = 0,007, Mann-Whitney-teszt) (3C. Ábra), míg a CD8 T-sejtek összes száma a kezelt és kezeletlen csoportokban nem volt szignifikánsan különbözõ (P = 0,375) (3D ábra). Ezek az eredmények, valamint az IFN-γ knockout egerek megfigyelései és az RNS mikroray-megállapítások alátámasztják azt a hipotézist, hogy a glutamin az IFN-γ útvonalon keresztül hat a HSV-1 reaktivációjának csökkentésére. Míg a glutamin szintén befolyásolhatja a vírus replikációját, tehát a reaktiválódást, úgy gondoljuk, hogy ez kevésbé valószínű, mivel a korábbi vizsgálatok nem mutatják a glutamin hatását a WT HSV replikációjára in vitro (12).

Az IFN-y fontos a HSV reaktivációjának szabályozásában. Az emberek és egerek látensen HSV-1-fertőzött ganglionjaiban T-sejtek expresszálják az IFN-γ-t (17). Az IFN-γ számos állatmodellben csökkenti a látenciából történő reaktivációt. Az IFN-y-t CD8 T-sejtek termelik látensen HSV-1-fertőzött egér trigeminális ganglionokból származó szuszpenziókban (18). Az IFN-y hozzáadása a látensen fertőzött trigeminus sejtkultúrákhoz csökkenti a HSV-1 reaktiválódását (18). Az IFN-y knockout egereknél magasabb a HSV-reaktiváció sebessége (19). Megállapítottuk, hogy a glutamin számos IFN-γ-indukálható gén szintjét növelte, többek között Cxcl9, ami kritikus fontosságú a nemi szervek HSV-2 szabályozásához a vírusspecifikus citotoxikus T-sejtek mobilizálásával az egerek idegrendszerébe és hüvelyébe (20). Egyes tanulmányok megkérdőjelezik a T-sejtek fontosságát a reaktiváció szabályozásában, mivel a látensen fertőzött emberi idegsejtek csak kis részét veszik körül T-sejtek; azonban úgy gondolják, hogy a HSV-vel fertőzött idegsejtekkel szomszédos aktivált T-sejtek száma növekszik, amikor ezekben az idegsejtekben alacsony szintű vírusreaktiváció történik (21, 22).

A stressz glutamin kimerülést és a limfociták működésének károsodását eredményezheti. A stressz emeli a HSV reaktivációjának sebességét is (23). A stressz csökkentheti a látensen fertőzött ganglionokban a CD8 T-sejtek számát, valamint a ganglionokban található HSV-1-specifikus CD8 T-sejtek képességét arra, hogy a vírus reaktivációjára reagálva IFN-γ-t termeljenek (23). Ezért a glutamin visszafordíthatja a stressz CD8 T-sejtekre adott válaszreakcióit és csökkentheti a reaktivációt.

Míg a glutamin csak 50% -kal csökkentette az in vivo HSV-1 reaktiváció mértékét az egér trigeminális ganglionjaiban, ez ugyanolyan szintű hatással bír, mint az antivirális szuppresszív terápia a HSV-1 herpes labialis tüneti kiújulási arányának csökkentésében (24). Ezenkívül, míg az acyclovir részben csökkenti a HSV-2 genitális kiújulásait, ez nem csökkenti a HSV-2-hez kapcsolódó HIV-megszerzés kockázatának 2-3-szorosát (25). Így egyértelműen szükség van más terápiákra az orális és nemi szervek HSV kiújulásának elnyomására. A glutamin képessége a HSV reaktivációjának csökkentésére 2 különböző állatmodellben új megközelítést javasol a vírus reaktivációjának csökkentésére emberben.

Statisztika. A mikrorajz kivételével minden statisztikát a JMP 7.0.2-ben (SAS Intézet) készítettünk; P kevesebb, mint 0,05 volt szignifikáns. A microarray adatok normalizálását és a differenciál expressziót SAS és JMP/Genomics 4.0 (SAS Institute) alkalmazásával számítottuk ki.

Tanulmány jóváhagyása. Valamennyi állatkísérletet az Országos Allergiai és Fertőző Betegség Intézetének, valamint az Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatal állattenyésztési és -használati bizottságának jóváhagyott protokollok szerint hajtották végre. A módszerek teljes leírását a Kiegészítő módszerek tartalmazza.

YH, KW, KD, MS, LP, MBM és PRK végezték az állatkísérleteket. KW és YH valós idejű PCR-t végzett. A KD mennyiségileg meghatározta a vírusspecifikus CD8 sejteket a ganglionokban. A TGM elvégezte a mikroarray kísérleteket és elemzéseket. JIC, YH és KW tervezték a vizsgálatot. JIC, YH, KW, TGM és PRK írták a cikket.

Ezt a kutatást az Országos Allergiai és Fertőző Betegségek Intézetének és a Biológiai Értékelő és Kutató Központ intramural kutatási programjai támogatták. Ez a cikk Priscilla Schaffer emlékének szól, aki inspirálta ezt a munkát.

Összeférhetetlenség: A szerzők kijelentették, hogy nincs összeférhetetlenség.