Magas koncentrátumú kukoricaszalma-diéta indukálta epigenetikus változások a tejelő tehenek emlőszövetében

Állattudományi és Technológiai Főiskola, valamint a Chongqingi Fű és Növényevők Fő Laboratóriuma, Délnyugati Egyetem, Beibei, Chongqing, Kína

Állattudományi Főiskola, Belső-Mongólia Mezőgazdasági Egyetem, Hohhot, Belső-Mongólia, Kína

Állattudományi és Technológiai Főiskola, valamint a Chongqingi Fű és Növényevők Fő Laboratóriuma, Délnyugati Egyetem, Beibei, Chongqing, Kína

Állattudományi Főiskola, Belső-Mongólia Mezőgazdasági Egyetem, Hohhot, Belső-Mongólia, Kína

Állattudományi és Technológiai Főiskola, valamint a Chongqingi Fű és Növényevők Fő Laboratóriuma, Délnyugati Egyetem, Beibei, Chongqing, Kína

Állattudományi és Technológiai Főiskola és Chongqing Fű- és Növényevő Kutatóintézete, Délnyugati Egyetem, Beibei, Chongqing, Kína

Állattudományi és Technológiai Főiskola, valamint a Chongqingi Fű és Növényevők Fő Laboratóriuma, Délnyugati Egyetem, Beibei, Chongqing, Kína

Guozhong Dong,
Min Qiu,
Changjin Ao,
Jun Zhou,
Khas-Erdene,
Xi Wang,
Zhu Zhang,
Te Yang

Ábrák

Absztrakt

Célja

A vizsgálat célja a magas koncentrátumú kukoricaszalma (HCS) étrend (65% koncentrátum + 35% kukorica szalma) táplálásának hatásainak vizsgálata volt a tejelő tehenek emlőszövetében bekövetkezett epigenetikai változásokra, összehasonlítva az alacsony koncentrátummal kukorica szalma (LCS) diéta (46% koncentrátum + 54% kukorica szalma) és alacsony koncentrátumú kevert takarmány (LMF) diéta (46% koncentrátum + 54% vegyes takarmány).

Kísérleti terv

A sok laktáció közepén lévő kínai holstein teheneket e három étrend egyikével etették 6 héten keresztül, ekkor vér- és emlőszövetmintákat gyűjtöttek. Az emlő artériás és vénás vérmintákat lipopoliszacharid (LPS) koncentrációkra elemeztük, míg az emlő szövetmintákból megvizsgáltuk a hiszton H3 acetilezését és a zsír- és fehérjeszintézissel összefüggő specifikus gének metilációját.

Eredmények

A hisztonok kivonása és a hiszton H3 acetilezés mennyiségi meghatározása azt mutatta, hogy az HCS-táplálékkal etetett teheneknél az acetilezés jelentősen csökkent, összehasonlítva az LCS-táplálékkal etetett tehenekkel. A HCS-étrenddel táplált tehenek LPS-koncentrációja lényegesen magasabb volt az emlő artériás vérében, mint az LCS-táplálékkal etetett teheneknél. Megállapítottuk, hogy a hiszton H3 acetilezés mértéke negatívan korrelált az LPS koncentrációival. A tejzsírszintézissel összefüggő sztearoil-koenzim A deszaturáz gén metilációja fokozódott a HCS-táplálékkal etetett teheneknél. Ezzel szemben az 5A jelátalakítót és az 5A transzkripció aktivátorát kódoló gén metilációja csökkent a HCS-táplálékkal etetett teheneknél, ami arra utal, hogy a magas koncentrátumú kukoricaszalma-táplálék etetése megváltoztathatja a zsír- és fehérjeszintézisben részt vevő specifikus gének metilációját. tejelő tehenek emlőszövete.

Következtetések

A magas koncentrátumú étrend etetése epigenetikus változásokat idézett elő a tejelő tehenek emlőszöveteiben, valószínűleg azáltal, hogy különböző mennyiségű LPS-t szabadított fel az emlővérbe.

Idézet: Dong G, Qiu M, Ao C, Zhou J, Khas-Erdene, Wang X és mtsai. (2014) Magas koncentrátumú kukoricaszalma-diéta indukálta epigenetikus változások a tejelő tehenek emlőszövetében. PLoS ONE 9 (9): e107659. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107659

Szerkesztő: Zane Andrews, Monash Egyetem, Ausztrália

Fogadott: 2014. június 6 .; Elfogadott: 2014. augusztus 16 .; Közzétett: 2014. szeptember 15

Adatok elérhetősége: A szerzők megerősítik, hogy az eredmények alapjául szolgáló összes adat korlátozás nélkül teljes mértékben elérhető. Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: A tanulmányt Kína Nemzeti Kulcsfontosságú Alapkutatási Programjának (2011CB100803 sz.) Forrásai támogatták. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az epigenetikát a génexpresszió örökletes változásainak tanulmányozása jelenti, amelyek függetlenek a DNS-szekvenciától [1]. A legfontosabb epigenetikus események közé tartozik a hisztonok acetilezése és metilezése, a DNS-metiláció és a génszabályozás nem kódoló RNS-ek segítségével. Az eukarióta magban a hiszton DNS-hez való kötődése módosítja a DNS tulajdonságait. Különböző hisztonmódosítások közé tartozik az acetilezés, a metilezés, a foszforilezés és az ubiquitation [2]. A H3 és H4 hisztonok acetilezése és metilezése, amelyek lizin vagy arginin maradványoknál fordulnak elő, a leggyakoribb és legjobban tanulmányozott hiszton módosítások. A DNS-metilezés egy metilcsoport hozzáadását jelenti a DNS-templát citozin-maradékainál, amely főleg citozin-foszfát-guanin (CpG) dinukleotidokban fordul elő emlősökben [3]. A hisztonok és a DNS epigenetikus módosulása a környezeti tényezőkre reagálva következik be. Az étrend, a méreganyagok, a szennyező anyagok, a betegség és más környezeti tényezők az epigenetikus szabályozás révén mélyen befolyásolhatják a génexpressziót. Az epigenetikus szabályozás azon képessége, hogy befolyásolja a fejős tehenek emlőfunkcióit, az elmúlt években figyelemre méltó volt [4] [5].

A tejtermelő rendszerekben a szarvasmarhákat gyakran magas koncentrátumú étrenddel etetik a minőségi takarmány-alapanyagok szezonális vagy regionális hiánya miatt. A nagy tejtermelést támogató, nagy koncentrátumot tartalmazó tejelő tehenek etetéséhez a szubakut kérőskő acidózisának (SARA) magas előfordulási gyakorisága társult [6] [7] [8]. A SARA olyan emésztési rendellenesség, amely egészségügyi veszélyt jelent a tejelő tehenekre, és a tejtermelés legfontosabb anyagcsere-betegségévé vált a világon. A koncentrátumkeverékekben a legtöbb gabona magas bendő emészthetősége növeli az illékony zsírsavak termelését a bendőben, és a bendő pH-jának megfelelő csökkenését okozza [6] [9] [10], ami a bendő környezetében változásokat eredményezhet, ami a bendő mikrobiota összetételének változásai [11] [12] és az endotoxin (lipopoliszacharid, LPS) felhalmozódása, a gram-negatív baktériumok potenciálisan káros sejtfal-összetevője [7] [13] [14]. Az LPS transzlokálódhat a véráramba a gyomor-bél traktus hámgátján [15] [16] [17], gyulladásos reakciókat váltva ki tehenekben [15] [18] [19].

Az LPS emésztő tehenek emlőszövetében káros epigenetikai változásokat is kiválthat. Még nem dokumentálták az összefüggést az LPS és a fejős tehenek emlőszövetében bekövetkezett epigenetikus változások között a magas koncentrátumtartalmú étrendek etetése során. Ezenkívül a tejkoncentrációjú tápanyagok tejelő tehenek etetése során a tejgén expressziójának epigenetikus kontrollja hisztonmódosítással és DNS-metilációval nem ismert. Sok országban a kukoricaszalmát gyakran használják a tehenek étrendjében a minőségi takarmány hiánya miatt, ezért a laktáció táplálkozási szükségleteinek kielégítése érdekében meg kell növelni az étrendben a koncentrátum arányát. Feltételeztük, hogy a kukorica szalma alapú étrendben a koncentrátum arányának növelése az endotoxin fokozottabb bejutását eredményezi az emlőmirigyben, és ezáltal epigenetikus változásokat vált ki a tőgyben, ami káros hatást gyakorolhat a tejgén expressziójára. Ezért ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy értékelje a magas koncentrátumú kukoricaszalma (HCS) táplálásának hatásait a fejős tehenek emlőszövetének epigenetikai változásaira, összehasonlítva az alacsony koncentrációjú kukoricaszalma (LCS) étrenddel. alacsony koncentrátumú kevert minőségű takarmány (LMF) étrend.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

A vizsgálatot a Southwest University Állatetikai Bizottsága hagyta jóvá, és minden kísérleti eljárás és az állatok gondozása szigorúan összhangban volt a Tudományos Minisztérium által kiadott „Iránymutatások a kísérleti állatok etikai kezeléséhez (2006, 398. sz.)”. és Kína technológiája. Az alábbiakban részletesen leírt vér- és emlőszövet-mintavételt általános vagy regionális érzéstelenítésben végezték, hogy minimalizálják az állatok szenvedését és fájdalmát.

Állatok, étrend és kísérleti eljárás

Vérminta és elemzés

Az emlőszövet mintavétele és elemzése

Az emlőszövet mintákat lyukasztásos biopsziával nyertük Baumgard és mtsai. [21] módosításokkal. A teheneket általános érzéstelenítésben visszatartották a mozgástól. Az emlőmirigyet kitettük, és 20 ml prokain-hidrokloridot adtunk körkörös mintázatban a metszési hely körül. A jobb emlőmirigy hátsó negyedének középpontján 5–6 cm-es bemetszést végeztek a nyírás és fertőtlenítés után. A kötőszövetet eltávolítottuk a mirigy kapszulájának feltárására, emlőszöveti biopsziát (~ 500 mg) kaptunk, és felére osztottuk. A minta egyik felét használtuk hiszton H3 acetilezési vizsgálatokban, míg a másikat DNS metilációs vizsgálatokban. Az összes mintát azonnal folyékony nitrogénben tároltuk. Az emlőszövet mintavétele után a mirigy kapszuláját, a kötőszövetet és a bőrt varrták, és az állatoknak intramuszkuláris penicillint adtak a fertőzések megelőzése érdekében.

A teljes hisztonokat az EpiQuik ™ Total Histone Extraction Kit (Epigentek Group Inc.) segítségével extraháltuk a gyártó protokolljainak megfelelően. A hiszton H3 acetilálást az EpiSeeker Histone H3 acetilezési tesztkészlet (Abcam) segítségével számszerűsítettük. A hiszton H3 acetilezési helyeit a H3 hiszton rezolválásával azonosítottuk nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel, majd Coomassie briliánskékkel festettük. A hiszton H3 sávot kivágtuk és 50% acetonitril + 25 mM ammónium-hidrogén-karbonát oldattal desztilláltuk. A hisztont H3 tripszinnel emésztettük, és a peptideket folyadékkromatográfia-tömegspektrometria (MS) × MS (Thermo Scientific Inc.) alkalmazásával elemeztük. A peptid tömegspektrumokat mértük és elemeztük az acetilezési helyek meghatározásához Mascot szoftver segítségével, különös figyelmet fordítva a 126,1 tömeg/töltés arányú (m/z) ionok kimutatására, amely diagnosztikus a lizin-acetilezés szempontjából [22]. A lizin-acetilezett peptideket szintén megerősítettük a szomszédos b-ionok vagy y-ionok közötti 170 Da tömegkülönbségek kimutatásával.

Az emlőszövetből származó teljes DNS-t reagenskészlettel (Tiangen, Peking, Kína) extraháltuk, és specifikus gének DNS-metilációs tesztjeihez használtuk biszulfit szekvenáló PCR-en (BSP) keresztül. A DNS-t először biszulfáttal kezelték, hogy a metilálatlan citozinokat dezaminálás útján uracillá alakítsák, míg a metilezett citozinok a kezelés során változatlanok maradtak. Az uracileket timinekké alakították át a PCR során. A PCR-primereket Methyl Primer Express v1.0 alkalmazásával terveztük (2. táblázat). A PCR termékeket klónoztuk és szekvenáltuk, hogy meghatározzuk a specifikus gének DNS-metilációs szintjét a BiQ Analyzer szoftver segítségével.

statisztikai elemzések

Az adatelemzés során az SPSS (v.18) általános lineáris modelljét (GLM) használtuk. A GLM magában foglalta a véletlenszerű tehénhatást és a diéták rögzített hatását, és az összes változó átlagos különbségeit elkülönítettük és összehasonlítottuk Duncan többszörös összehasonlító eljárásával. Az adatokat átlag ± szórásként adjuk meg. A szignifikanciát p2-nél számoltuk, és kiszámítottuk, és felhasználtuk az illeszkedés jóságának értékelésére.

Eredmények

Arra voltunk kíváncsiak, hogy meghatározzuk a HCS-étrend táplálásának hatását a tejelő tehenek emlőszövetének epigenetikai változásaira, összehasonlítva az LCS-diétával és az LMF-étrenddel. Először elemeztük ezen étrendek hatását a hiszton H3 acetiláció mennyiségére az emlőszövetekben. A hisztonok kivonása és a hiszton H3 acetilezés mennyiségi meghatározása azt mutatta, hogy az HCS-táplálékkal etetett teheneknél az acetilezés szignifikánsan csökkent, összehasonlítva az LCS-táplálékkal etetett tehenekkel (1. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a magas koncentrátumú étrend epigenetikus változásokat indukálhat az emlőszövetekben.

A tejelő tehenek emlőmirigyében a hiszton H3 acetiláció mértékét az EpiSeeker Histone H3 acetilációs vizsgálati készlet segítségével számszerűsítettük. Az adatok az átlagot és a szórást mutatják (n = 10/csoport), a csillag pedig statisztikai különbséget mutat (p. 2. ábra. A tömegspektrometriával azonosított hiszton H3 lizin-acetilezett peptidek tömegspektruma.

A. MS/MS spektrumok m/z ion alapján 882,4923. B. MS/MS spektrumok m/z ionból 1376,6936.

A magas koncentrátumú étrend szarvasmarháknak történő táplálásának jellemzője a SARA kialakulása [8] [16] [17], amely gyakran LPS felhalmozódását eredményezi a véráramban, majd gyulladással jár [15]. Annak megállapítására, hogy a különböző étrendek befolyásolták-e az LPS felszabadulását, számszerűsítettük az LPS-t emlőartéria és véna plazma mintákban. A HCS-étrenddel etetett tehenek LPS-koncentrációja a vérben szignifikánsan magasabb volt, mint az LCS-diétával táplált tehenek esetében (3. ábra).

Az LPS-koncentrációkat kromogén végpontvizsgálattal határoztuk meg a limulus amebocyta-lizátum (LAL) teszt reagenskészlettel. Az adatok az átlagot és a szórást mutatják (n = 10/csoport), a csillag pedig statisztikai különbséget mutat (p 4. ábra. Az emlőartéria plazma LPS-tartalma és a hiszton H3 acetilációs szintje közötti kapcsolat.

A hiszton H3 acetiláció mértékét az emlő szövetmintáiban ábrázoltuk az emlő artéria plazma minták LPS koncentrációival szemben.

Az emlőmirigy zsír- és fehérje-metabolizmusában szerepet játszó specifikus gének DNS-metilációjának mértékét BSP alkalmazásával értékelték. A tejzsírszintézissel összefüggő sztearoil-koenzim A-deszaturázt kódoló SCD gén metilációja megnőtt a HCS-étrenddel etetett teheneknél, összehasonlítva az LCS- vagy LMF-táplálékkal etetett tehenekkel (5. ábra). Ezzel szemben a fehérjeszintézisben szerepet játszó 5A transzkripció szignálátalakítóját és aktivátorát kódoló STAT5A metilezése csökkent a HCS-táplálékkal etetett teheneknél (5. ábra).

Tárgyterületek

A PLOS tárgyterületeivel kapcsolatos további információkért kattintson ide.

Szeretnénk visszajelzését. Van-e értelme ezeknek a tárgyköröknek a cikk számára? Kattintson a célra a helytelen Tárgy mellett, és tudassa velünk. Köszönöm a segítséget!

A tárgykör "Diéta" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Hisztonok" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Acetilezés" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "DNS-metilezés" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Kukorica" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Tej" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Epigenetika" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Protein szintézis" alkalmazható erre a cikkre? igen nem