Mio-inozit-hexafoszfát bevitele és az inozit-foszfátok vizelettel történő kiválasztása Wistar patkányokban: Gavage vs.. orális adagolás cukorral

Szerepek Konceptualizálás, vizsgálat, módszertan, felügyelet, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Vese-lithiasis kutatásának laboratóriuma, Egyetemi Egészségtudományi Kutató Intézet (IUNICS-IdISBa), Baleár-szigeteki Egyetem, Ctra Valldemossa, Palma de Mallorca, Spanyolország

Szerepek Konceptualizálás, vizsgálat, módszertan, felügyelet, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Vese-lithiasis kutatásának laboratóriuma, Egyetemi Egészségtudományi Kutató Intézet (IUNICS-IdISBa), Baleár-szigeteki Egyetem, Ctra Valldemossa, Palma de Mallorca, Spanyolország

Szerepek vizsgálata, módszertan

Vese-lithiasis kutatásának laboratóriuma, Egyetemi Egészségtudományi Kutató Intézet (IUNICS-IdISBa), Baleár-szigeteki Egyetem, Ctra Valldemossa, Palma de Mallorca, Spanyolország

Szerepek vizsgálata, módszertan

Affilee Serveis Cientificotècnics, Baleár-szigeteki Egyetem, Ctra Valldemossa, Palma de Mallorca, Spanyolország

Szerepek vizsgálata, módszertan

Affilee Serveis Cientificotècnics, Baleár-szigeteki Egyetem, Ctra Valldemossa, Palma de Mallorca, Spanyolország

Szerepek vizsgálata, módszertan

Társulás Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Biologia Fonamental i Ciències de la Salut, Egészségtudományi Kutató Intézet (IUNICS-IdISBa), Baleár-szigeteki Egyetem, Ctra Valldemossa, Palma de Mallorca, Spanyolország

F. Grases,
A. Costa-Bauzá,
F. Berga,
R. M. Gomila,
G. Martorell,
M. R. Martínez-Cignoni

Ábrák

Absztrakt

Célkitűzés

Az inozitol-foszfátok (InsP) vizeletszintjének értékelése patkányokban, amelyek különböző myo-inozit-hexafoszfát-sókat (InsP6) kaptak szondával vagy szájon át.

Mód

Harminc patkány kapott AIN-76A étrendet (amelyben az InsP-k nem mutathatók ki) 15 napig. Ezután 12 patkány kapta az InsP6-ot nátriumsó vagy Ca/Mg só formájában; 4 nap elteltével a Na vagy Ca/Mg InsP6-ot 15 g/l szacharózt tartalmazó vízzel adtuk be, és vizeletmintákat gyűjtöttünk. A másik 18 patkány orális InsP6-ot kapott, amelyben 0,5 g cukrot kombináltak InsP6-tal Na-sóként, Ca/Mg-sóként vagy Na-sóként CaCO3-mal; napi vizeletmintákat gyűjtöttünk. Az InsP-k vizeletszintjét nem specifikus módszerrel és egy specifikus módszerrel (poliakrilamid-gélelektroforézis, PAGE) határoztuk meg, és a különböző InsP-ket tömegspektroszkópiával (MS) azonosítottuk.

Eredmények

15 napos InsP6-mentes étrend után a nem-specifikus módszer nem talált vizeletbeli InsP-ket, és az MS csak InsP2-t. A Na-InsP6 szondával történő beadása után a nem specifikus módszer több vizeletbeli InsP-t jelzett, mint a PAGE által meghatározott InsP6 mennyisége. Az MS jelezte a vizelet InsP2, InsP3, InsP4, InsP5 és InsP6 jelenlétét ezekben a patkányokban, jelentős eltérésekkel az állatok között. Ugyanezen kezelés alkalmazása a Ca/Mg-InsP6 beadásához alacsonyabb vizelet-InsP-tartalmat és alacsonyabb InsP6-szintet eredményezett. Az InsP6, mint cukor tabletta, orális beadása alacsonyabb vizeletszintet eredményezett, mint az InsP6 szondával történő beadása, és Ca/Mg tabletta vagy Ca/Mg tabletta vagy CaCO3 adagolása alacsonyabb szintet eredményezett, mint Na tablettaként történő beadás.

Következtetés

Az InsP6 patkányoknak történő beadása különböző InsP-k keverékének kiválasztásához vezet. A patkányok hatékonyabban szívják fel az InsP6-ot, ha olyan étrendi összetevők nélkül szállítják őket, amelyek zavarják annak felvételét, mint például a Ca-ion és a cukor.

Idézet: Grases F, Costa-Bauzá A, Berga F, Gomila RM, Martorell G, Martínez-Cignoni MR (2019) myo-inozitol-hexafoszfát bevitele és az inozit-foszfátok vizelettel történő kiválasztása Wistar patkányokban: Gavage vs. orális adagolás cukorral. PLoS ONE 14 (10): e0223959. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223959

Szerkesztő: Juan J. Loor, Illinoisi Egyetem, AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2019. március 19 .; Elfogadott: 2019. október 2 .; Közzétett: 2019. október 18

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a kéziratban és annak kiegészítő információs fájljaiban található.

Finanszírozás: A szerző (k) nem kaptak külön támogatást ehhez a munkához.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A mediterrán étrend egyes összetevői, például a diófélék, a hüvelyesek és a teljes kiőrlésű gabonák bőségesen tartalmazzák a mio-inozit-hexafoszfátot (InsP6), és ennek a diétának néhány pozitív hatása ennek a vegyületnek tulajdonítható [1]. Az InsP6 metabolikus átalakulását jellemezni kell, hogy jobban megértsük jótékony hatásait, de kevés tanulmány vizsgálta ezt a témát. A legújabb vizsgálatok azt mutatták, hogy miután az InsP6 megjelenik a test folyadékaiban, több foszfatáz metabolizálja több foszforilezett formává, az InsP5-től az InsP2-ig [2]. Ezenkívül az InsP6 a sejteken belül de novo szintézissel is képződik [3].

Az InsP6 és metabolizmusának vizsgálata szintén bonyolult a különböző fajok és izomerek azonosításának és mennyiségi meghatározásának analitikai bonyolultsága miatt. Ennek egyik oka az, hogy e molekulák gyenge spektrális jellemzői megnehezítik a hagyományos spektrofotometriai vagy fluorometriai módszerekkel történő azonosítást [1]. A második ok az, hogy nagyon alacsony koncentrációban vannak jelen a nagy mennyiségű foszfátiont tartalmazó táptalajban, és könnyen adszorbeálódnak különböző anyagokra (például acélra [4], [5]), így az izolálás során a visszanyerés gyenge lehet, vagy átalakítható különböző formákra [6]. A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) és a tömegspektrometriával (MS) való összekapcsolása azonban javította ezen vegyületek kimutatását [7]. A tandem tömegspektrometriához (MS/MS) kapcsolt HPLC további javulást eredményezett az inozitol-foszfátok (InsP) biológiai mintákban történő mérésében [8], [9].

Az InsP-k mérésének analitikai nehézségei miatt korlátozott ismeretek állnak rendelkezésre az étrendi InsP6 hatásáról, az InsP6 felszívódásáról és metabolizmusáról, valamint az InsP-k vizelettel történő kiválasztásáról. Ebben a cikkben az InsP6 felszívódását, metabolizmusát és kiválasztódását vizsgáltuk nőstény Wistar patkányokban.

Anyagok és metódusok

Állatok, diéták és kísérleti tervezés

Az Envigótól (Barcelona, Spanyolország) vásárolt nőstény Wistar patkányokat használtuk az InsP-k vizelettel történő kiválasztásának értékelésére az InsP6 különböző készítményeinek orális beadása után. Az állatokat egyedi ketrecekben helyeztük el egy szabályozott hőmérsékletű helyiségben (23 +/- 1ºC) 12 órás világos-sötét ciklus mellett, és AIN-76A étrendet kaptunk (Harlan, Indianapolis, IN, USA), szintetikusan tisztított táplálékot. kimutathatatlan szintje van az InsP6-nak és más InsP-nek. A kísérleti beavatkozások 15 nappal azután kezdődtek, hogy a patkányok elkezdték fogyasztani ezt az étrendet.

Az InsP6 beadása szondával

Tizenkét nőstény patkányt lemértek, és két csoportra osztottak (csoportonként 6 állat), így az átlagos patkánytömeg mindkét csoportban hasonló volt (260 g). A Na-InsP6 zsákos csoport minden reggel 0,03 mmol InsP6Na12 (27,7 mg/1,3 ml) zsákmányt kapott (A csoport), a Ca/Mg-InsP6 zsákos csoport pedig 0,03 mmol InsP6Mg2Ca4 (25,71 mg/1,3 ml) zsákot kapott minden reggel. (B csoport). A 4. nap (4 adagolás) után a szondák leálltak, és az InsP6-ot egy palackban adtuk be 15 ml vízzel, amely 0,03 mmol Na-InsP6 vagy Ca/Mg-InsP6 és 15 g/l szacharózt tartalmazott 3 és 10 napig. A 7. napon (4 napos szondázás + 3 nap folyadék) és a 14. napon (4 napos szondázás + 10 nap folyadék) 24 órás vizeletet gyűjtöttünk egyedi metabolikus ketrecek segítségével. A patkányok ebben a 24 órában 5 g/l szacharózt tartalmazó csapvizet fogyasztottak.

Az InsP6 orális beadása cukros pelletként

Tizennyolc állatot három csoportra osztottak (csoportonként 6 állat), így az átlagos patkánytömeg minden csoportban 240 g volt. Minden reggel a Na-InsP6 tabletta csoport 0,03 mmol InsP6Na12-t kapott, összekeverve 0,5 g fondanttal (félszilárd cukros keverék, hordozóanyagként) (C csoport) [10], [11], a Ca/Mg-InsP6 tabletta csoportot 0,03 mmol InsP6Mg2Ca4 keveréke 0,5 g fondanttal (D csoport), és a Na-InsP6-Ca tabletta csoport 0,03 mmol InsP6Na12 + 0,36 mmol CaCO3-ot kapott, 0,5 g fondanttal keverve (E csoport). Ezután 24 órás vizeletmintákat gyűjtöttünk a 0., 7., 14., 21., 28. és 35. napon egyedi metabolikus ketrecek alkalmazásával.

Valamennyi eljárást a 86/609/EGK irányelvnek megfelelően hajtották végre a kísérleti és egyéb tudományos célokra használt állatok védelmére vonatkozóan. Az állatkísérletek elvégzéséhez hivatalos engedélyt adott a Baleár-szigeteki Egyetem Comité de Ética de Experimentación Animal (CEEA) (Exp. 2016/19/AEXP).

Az InsP-k nem specifikus spektrometriás meghatározása

A globális InsPs mennyiségi meghatározását indirekt kolorimetriás módszerrel végeztük, alumínium-xilenol narancs felhasználásával [12].

InsP-ek kivonása TiO2-vel

Az InsP-k extrakcióját a korábban leírtak szerint hajtottuk végre [2, 13], TiO2 (Titansphere TiO2 5 μm; GL Sciences) alkalmazásával.

Az InsP-k azonosítása a tagállamok által

Az InsPs TiO2-mal történő extrakciója után összesen 150 μl elkészített eluátumot különítettünk el, és 10 μL-t injektáltunk egy Q Exactive Orbitrap nagy felbontású tömegspektrométerbe, amely fűtött elektrospray ionizációs (HESI) szondával rendelkezett (Thermo Fisher Scientific, Waltham USA), amelyet negatív ionizációs módban működtettek. A tömegspektrum példája az 1. ábrán található.

Patkány # 6 (A csoport) 14 napos IP6Na12 beadás után.

Az InsP6 azonosítása és félkvantifikálása PAGE segítségével

Az InsPs TiO2-mal történő extrakciója után az elkészített eluátum 850 μl térfogatát 30 μl térfogatig bepároljuk, a poliakrilamid gélelektroforézisben (PAGE) való felhasználásra, egy korábban leírt eljárást követve [14].

Statisztika

Az adatokat átlag ± standard hiba (SE) formájában mutatjuk be. A vizelet koncentrációjának és az InsP-k kiválasztásának csoporton belüli összehasonlítását (különböző napokon) egyirányú ismételt ANOVA és Bonferroni mérésekkel végeztük post-hoc tesztként minden csoport esetében. A 0., 7., 14., 21., 28. és 35. napon a vizelet koncentrációjának és az InsP-k kiválasztásának csoportok közötti összehasonlítását kétirányú ismételt ANOVA-módszerrel értékelték a kezelés, a periódusok és az interakciós kezelés x periódus hatásának értékelése céljából. A 0,05-nél kisebb kétfarkú p-értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. A statisztikai elemzéseket az SPSS 23.0 verziójával végeztük (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Eredmények

Az InsP6 beadása szondával

A korábbi kísérletekkel [2] összhangban, amikor a patkányok több hétig InsP6-mentes étrendet kaptak, egy nem specifikus módszer nem talált InsP-ket, de az MS az InsP2-t. A Na-InsP6 szondával történő adagolása plusz 3/10 napig Na-InsP6-ot és szacharózt tartalmazó vízzel, változó mennyiségű vizelet InsP6 jelenlétét figyeltük meg (2. ábra). A várakozásoknak megfelelően a nem specifikus módszerrel meghatározott összes InsP-érték nagyobb volt, mint a PAGE által meghatározott InsP6 mennyisége (1-3. Táblázat). Az MS-adatok a vizelet InsP2-jének nagymértékű növekedését és az InsP3, InsP4, InsP5 és InsP6 jelenlétét jelezték (3. ábra). Az állatok között is jelentős eltérések voltak.

SB (mintapuffer), S1 (1. standard: 1,25 nmol InsP6), S2 (2. standard: 5 nmol InsP6), vizeletminták (1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A patkányok).

Az egyes patkányok által kapott értékek átlaga ± SE.

A gyűjtési napon a patkányok ivott csapvizet 5g/l szacharózzal a diurézis növelése érdekében. A csoport - IP6Na12, B csoport - InsP6Mg2 Ca4 adminisztrációja. Az értékeket átlag ± SE-ként fejezzük ki. A csoportok összehasonlítását független minták t-teszttel végeztük.

A csoport - IP6Na12 beadása szondával B csoport - InsP6Mg2 Ca4 beadása szondával C csoport - IP6Na12 orális beadása, D csoport - IP6Mg2Ca4 orális beadása, E csoport - IP6Na12 + Ca orális beadása. Az értékeket átlag ± SE-ként fejezzük ki.

Amikor ugyanazt az eljárást hajtották végre Ca/Mg-InsP6 alkalmazásával, a teljes InsP-k és a specifikus InsP6 vizeletszintje (PAGE alapján meghatározva) alacsonyabb volt (1-3. Táblázat). Az MS adatok InsP2, InsP3, InsP4, InsP5 és InsP6 jelenlétét jelezték, de kisebb mennyiségben, mint Na-InsP6-ot kapott patkányokban (4. ábra).

Az egyes patkányok által kapott értékek átlaga ± SE.

Az InsP6 beadása cukortablettaként

Amikor a Na-InsP6-ot ugyanabban az időszakban cukros pirulaként (nem pedig szondával) adták be, a vizeletből származó InsP-k kisebb mennyiségben voltak (2. és 3. táblázat). Ezenkívül az összegek még alacsonyabbak voltak, ha az InsP6-ot Ca/Mg-InsP6-ként vagy Na-InsP6-Ca-ként adták be, nem pedig Na-sóként (2. és 3. táblázat). Érdekes módon az InsP-k mennyisége fokozatosan nőtt a 35 napos követés során (2. és 3. táblázat). Az MS eredményei nagyon változó mennyiségben jelezték az InsP6 jelenlétét (5. ábra).

Az (I) csoport mindegyik patkánya által kapott InsP5 és InsP6 értékek, valamint az InsP1-InsP6 (II) átlag ± SE.

Vita

Egy korábbi tanulmány arról számolt be, hogy amikor a patkányok hosszú ideig InsP6-mentes étrendet fogyasztottak, vizeletükben csak InsP2-et detektáltak [2], amint azt a jelen tanulmány is megfigyelte. Az itt bemutatott eredmények azt mutatták, hogy az InsP-k kiválasztódása sokkal nagyobb volt, ha az InsP6-ot önmagában (szondával) Na-InsP6-ként adták be, mint Ca/Mg-InsP6-ként, amint az a 2. és 3. táblázatban látható. A szacharózos ivóvízben lévő InsP6 nem növelte a vizeletbe kerülő InsP-k mennyiségét. Az InsP6 specifikus meghatározása PAGE és MS segítségével az InsP6-ot vizeletmintákban detektálta 14 napos patkányokban, amelyek Na-InsP6-ot kaptak szondával. A Ca/Mg-InsP6 szondával történő beadása alacsonyabb vizeletszintet eredményezett az InsP6, InsP5, InsP4 és InsP3 vizeletben, mint a Na-InsP6 szondával történő beadása.

Az InsP6 tabletta adagolása 0,5 g fondanttal, nem pedig szondával, sokkal alacsonyabb mennyiségű vizeletbeli InsP-t eredményezett. Ennek ellenére az InsP-k nagyon fokozatosan növekedtek 35 nap alatt patkányokban, akik cukros pirulaként kapták az InsP6-ot. A vizelet InsP6 mennyisége alacsonyabb volt azoknál a patkányoknál, akik cukros tablettaként kapták az InsP6-ot, mint a szoptatással.

A korábbi vizsgálatokhoz hasonlóan [12], az InsP6 beadása során kezdetben az InsP-k vizeletszintjének figyelemre méltó növekedését figyeltük meg, amelyet csökkentés követett. Ennek oka valószínűleg a metabolikus enzimek időbeli indukciója. Normális esetben az összes InsP nagy mennyiségének vizelettel történő kiválasztása az InsP6 fokozott kiválasztódását kíséri, bár ez az összefüggés nem mindig fordul elő. Megfigyeltük azt is, hogy amikor az összes InsP-k vizeletszintje alacsony, a vizeletbeli InsP6-ot csak néhány állatnál mutatták ki, bár a többi InsP-t minden állatban jelen volt. Ennek oka lehet az állatok tényleges biológiai variációja (valószínűleg a különböző fitáz- és lúgos foszfatázszintek következménye), vagy annak az analitikai problémának az eredménye, amelyet az InsP6 biológiai mintákban történő mérésének komplexitása okoz. Ezért figyelembe kell venni, hogy az InsP6-fogyasztás bizonyos előnyei nem kizárólag az InsP6-nak tudhatók be, és hogy más InsP6-ok is fontos hatásokkal járhatnak. Például az InsP6 és/vagy hidrolízistermékeinek keverékei egyaránt hatásos kristályosodás-gátlók lehetnek, és megakadályozhatják a kóros meszesedések kialakulását [15, 16].

Ez a tanulmány azt is megmutatja, hogy a cukor vagy a kalciumion jelenléte akadályozni látszik az InsP6 felszívódását, ezáltal csökkent kiválasztódást eredményezve. Valójában a kalciumion oldhatatlan InsP6 sót képez, a cukor pedig oldhatatlan adduktokat képez, amelyek megakadályozzák az abszorpciót. Ily módon az InsP6 hasonlít a biszfoszfonátokhoz, mivel a maximális felszívódás nátrium- vagy kálium-sóval és éhezéssel történik, és más tápanyagok akadályozzák annak felszívódását.

A jelen vizsgálat korlátja, hogy az InsP6 szondáját rövid ideig adtuk be. Ez elkerülhetetlen volt, mert a sok napos ismételt szoptatás megterheli az állatokat. Egy másik korlátozás az, hogy a különböző InsP-k MS általi azonosítását előzetesnek kell tekintenünk. Noha az InsP6 azonosítása biztos, nem lehetünk biztosak sem kvantitációjában, sem más InsP-k számszerűsítésében, mert ezeknek a vegyületeknek a törési folyamatai a detektálási folyamat során történhetnek.

Következtetés

Az InsP6 étrendi fogyasztása InsP-k keverékének kiválasztódásához vezet, az InsP2-től az InsP6-ig. A kiválasztott InsP-k vizeletszintje korrelál a jelenlévő InsP6 mennyiségével. Az InsP6 felszívódása nagyobb, ha más étrendi komponensek, például kalciumion vagy cukor hiányában szállítják, amelyek zavarják a felvételt.

Segítő információ

S1 táblázat. Az InsP-k nemspecifikus spektrometriás meghatározásával meghatározott koncentráció és kiválasztás eredményei.

A gyűjtési napon a patkányok ivott csapvizet 5g/l szacharózzal a diurézis növelése érdekében. A csoport - az IP6Na12 beadása, B csoport - a fitin beadása.

S2 táblázat. Poliakrilamid-gélelektroforézissel (PAGE) történő félkvantifikációval kapott InsP6 koncentrációs és kiválasztási értékei.

A gyűjtési napon a patkányok ivott csapvizet 5g/l szacharózzal a diurézis növelése érdekében. A csoport - az IP6Na12 beadása, B csoport - a fitin beadása.

S3 táblázat. Az InsP-k nemspecifikus spektrometriás kvantifikálásával kapott koncentráció eredményei.

A gyűjtési napon a patkányok ivott csapvizet 10 g/l szacharózzal a diurézis fokozása érdekében. GC - IP6Na12, GD - IP6Mg2Ca4, GE – IP6Na12 + Ca adminisztráció.

S4 táblázat. Az InsP-k nemspecifikus spektrometriás kvantifikálásával kapott kiválasztási értékek.

A gyűjtési napon a patkányok ivott csapvizet 10g/l szacharózzal a diurézis fokozása érdekében. GC - IP6Na12, GD - IP6Mg2Ca4, GE – IP6Na12 + Ca adminisztráció.