Hematológiai paraméterek és a patkányok májsejtjeinek állapota az aflatoxin B1 szájon át történő beadása után önmagában és nanodiamondokkal együtt

OA Mogilnaya

1 Biofizikai Intézet SB RAS, Akademgorodok, 50, 660036, Krasznojarszk, Oroszország

AP Puzyr

1 Biofizikai Intézet SB RAS, Akademgorodok, 50, 660036, Krasznojarszk, Oroszország

AV báró

2 Alapvető Biológiai és Biotechnológiai Intézet, Szibériai Szövetségi Egyetem, 79 Svobodny Prospect, 660041, Krasznojarszk, Oroszország

VS Bondar

1 Biofizikai Intézet SB RAS, Akademgorodok, 50, 660036, Krasznojarszk, Oroszország

Absztrakt

Patkányok hematológiai paramétereit és májsejtjeinek állapotát in vivo megvizsgáltuk, miután az állatok egyedül aflatoxin B1-et (AfB1) kaptak, és detonálással szintetizált módosított nanodiamondokkal (MND) együtt. Azoknál a patkányoknál, amelyek MND hidrosolt kaptak, megemelkedett a leukocita szint, elsősorban a magasabb granulocita szám és a kontroll patkányokhoz képest némileg megnövekedett monocita szám miatt. A pusztán AfB1-et kapó patkányok hematológiai paraméterei egy másik módon különböztek a kontroll patkányokétól: a fehérvérsejtek száma szignifikánsan alacsonyabb volt a csökkent limfocita szám miatt. Azoknál a patkányoknál, akik AfB1-et fogyasztottak MND hidrosollal, a hematológiai paraméterek változása kevésbé volt kifejezett, mint azoknál a patkányoknál, amelyek vagy AfB1-et, vagy MND-t fogyasztottak. Az elektronmikroszkóp kimutatta, hogy azoknak a patkányoknak a hepatocytái, amelyek MND hidrosolt vagy AfB1-et kaptak MND hidrosollal együtt, magas lipid zárványokat és lizoszómákat tartalmaznak. A sima endoplazmatikus retikulum (EPR) hiperpláziáját mutatták ki azoknak a patkányoknak a májmintáiban, amelyek AfB1-et kaptak. A tanulmány eredményei arra engednek következtetni, hogy a nanorészecskék és a mikotoxin a patkányok vérére és májsejtjeire gyakorolt hatások kölcsönös enyhítéséről szólnak, miután az AfB1 MND-n adszorbeálódott.

Bevezetés

Az aflatoxinok az Aspergillus - a penészgombák széles körben előforduló nemzetsége - által termelt másodlagos metabolitok. A penészgombákkal fertőzött élelmiszerek és takarmányok szennyeződhetnek aflatoxinokkal. Ez komoly veszélyt jelent az állatok és az emberek egészségére, mivel az aflatoxinok mutagén és rákkeltő hatásúak. Az aflatoxin B1 (AfB1) a legveszélyesebb mikotoxin ebben a csoportban, és toxikus hatásának nincs küszöbkoncentrációja. Az AfB1 fő célpontja a máj, és átalakul a hepatocitákban: biotranszformáció aktív AfB1-8,9-epoxiddá, amely kötődik a DNS-hez; irreverzibilis hidroxilezés, az M1, P1 és Q1 metabolitok képződése; reverzibilis hidroxilezés, aflatoxicol képződik [1-5]. A szennyezett táplálékkal az állati és az emberi gyomor-bélrendszerbe kerülő aflatoxinokat különféle enteroszorbensek mérsékelhetik [6-9].

A detonációval szintetizált módosított nanodiamandumok (MND) javasolhatók mikotoxinok bél adszorbenseként. A magasan fejlett MND-felület, valamint a különféle kémiailag aktív funkcionális csoportok, szénhidrogén-fragmensek és fém mikro-szennyeződések jelenléte a nanorészecskék felületén meghatározza azok nagy affinitását a biomolekulák szorpciójához [10-12]. A nanodiamond felület néhány fizikai-kémiai tulajdonságát Gibson et al. [13]. Az MND jó kolloid stabilitással rendelkezik a diszperziós közegben, és biológiai és orvosi vizsgálatokhoz alkalmazkodik. Így az MND hidroszolok hosszú távú kísérletek során felhasználhatók mindenféle injekcióhoz és nanorészecskék orális beadásához állatoknak. Állatkísérletekkel bebizonyítottuk, hogy az MND biokompatibilis erősen [14]. A nanodiamandok alacsony toxicitásáról A. Schrand et al. [15].

Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk az AfB1 hatását a hematológiai paraméterekre és azoknak a patkányoknak a májsejtjeire, amelyek orálisan kapták az AfB1-et önmagában és MND-vel együtt.

Kísérleti munkák

A kísérleteket felnőtt Wistar patkányokkal végeztük, amelyeket viváriumban tartottunk, hasonló körülmények között. A patkányokat véletlenszerűen 4 csoportra osztottuk (csoportonként 3 állat). Minden patkányt a saját ketrecében tartottak. A kontroll állatok (1. csoport) vizet ittak. A kezelt csoportok állatai MND hidrosolt ittak, amely 0,4 tömeg% nanorészecskét tartalmazott (2. csoport), AfB1 vizes oldatát (3. csoport), MND hidrosolt (0,4 tömeg%), amely AfB1-et tartalmaz (4. csoport). A 3. és 4. csoport minden patkánya megkapta a testtömegével arányos folyadékmennyiséget. Tehát a patkányok által szájon át kapott 1 g-os tömeg AfB1 teljes mennyisége egyenlő volt e csoportok összes állatánál. Miután a patkányok 10 napig fogyasztották az AfB1 tartalmú folyadékokat, körülbelül 25 napon belül vizet (3. csoport) vagy MND hidrosolt (4. csoport) kaptak. Ezt a 25 napos periódust használták az állatok AfB1 kumulatív hatásának teljesebb megnyilvánulásához. A kísérlet teljes időtartama 35 nap volt.

Aflatoxin B1

A vizsgálatban használt AfB1 analitikai minőségű volt, és az «Ecolan» (Oroszország) szállította a HPLC standardjaként. Egy ampulla 10 μg mikotoxint tartalmazott 1 ml acetonitrilben oldva. Vizes AfB1 oldatot készítünk úgy, hogy desztillált vizet helyettesítünk acetonitrillel.

MND és MND előállítása AfB1-gyel

A kísérletekben 4–250 nm-es MND-t (RUDDM 0–0,25 márka) detonációval állítottak elő a „Real-Dzerzhinsk” Ltd.-ben (Oroszország). Az MND hidroszolt (0,4 tömeg%) úgy állítottuk elő, hogy desztillált vizet adtunk a nanorészecske porhoz. Az AfB1-tartalmú MND-hidroszt úgy állítottuk elő, hogy mikotoxin vizes oldatot adtunk a nanorészecske-hidroszolhoz. A nanorészecskékkel kötött szabad AfB1 és AfB1 mennyiségét spektrális analízissel határoztuk meg. Ebből a célból, miután AfB1 vizes oldatot adtunk az MND hidrosol mintákhoz, Vortex-Genie 2 g-560E-ben (Scientific Industries, Inc., USA) 10 másodpercig kevertük és 2 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. a részecskéket ezután centrifugálással (Centrifuge 5415R, Eppendorf, Németország) gyűjtöttük össze 14 100 g-nál 10 percig. A nanorészecskék koagulációs képességét használták teljesebb eltávolításukhoz. Erre a célra a mintákat centrifugálás előtt 80–100 mM koncentrációban NaCl-tal egészítettük ki. A kapott felülúszókat 200-500 nm tartományban végzett spektrális analízissel értékeltük UVIKON-943 UV/VIS spektrofotométerrel (Kontron Instruments, Olaszország).

Hematológiai és elektronmikroszkópos elemzések

A kísérlet befejezése után vérmintákat vettünk az állatokból hematológiai elemzés céljából. A hematológiai paramétereket ABX MICROS-60 hematológiai analizátorral értékeltük (Franciaország). Ezután a patkányokat leölték, az eutanázia elvének megfelelően, és májmintákat vettek transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) vizsgálatra. A májszövetmintákat 2,5% glutáraldehidben rögzítettük 0,1 M kakodilátpufferben, 7,2 pH mellett; majd ugyanabban a pufferben 1% -os OsO4 oldatban rögzítették őket. A mintákat dehidratáltuk etanollal és acetonnal; majd Epon 812-Araldite M epoxigyanta keverékbe („Serva”) ágyazzák. Az ultravékony metszeteket egy Reichert Um-03 ultramikróma (Ausztria) alkalmazásával vágtuk le, majd 3% uranil-acetáttal, 30% etanolos oldattal és 0,2% vizes ólom-citrát oldattal festettük, és a JEM 1400-ban (JEOL, Japán) vizsgáltuk.

Az adatokat statisztikailag a Microsoft Excel 2003 szoftver dolgozta fel. A megbízhatósági szint α = 0,05 volt.

Eredmények és vita

Korábbi in vitro kísérleteink kimutatták, hogy az MND hozzáadása gyors AfB1 adszorpcióhoz vezet nanorészecskék által, az inkubációs idő nem haladja meg a 2-3 percet. Az inkubációs idő néhány percről több órára történő növekedése nem emelte az adszorbeált mikotoxin mennyiségét [11]. Kimutatták (1. ábra (1. ábra) 1), hogy az MND AfB1 szorpciós kapacitása a mikotoxin és a szorbens arányától függ. Például az adatok azt mutatják, hogy a kis AfB1 mennyiségek adszorpciója eléri a 60% -ot 25 mg MND-nél a mintában (1 ml); azonban az MND szorpciós kapacitása ebben az esetben alacsony. A mikotoxin mennyiségének növekedésével a nanorészecskék szorpciós kapacitása egy nagyságrenddel megnő. Hasonlóképpen az MND mennyiségének növekedése a megkötött mikotoxin mennyiségének növekedéséhez vezet; azonban a szorpciós képesség ebben az esetben csökken.

Az MND szorpciós jellemzői a minta AfB1 tartalmától függően állandó mennyiségű nanorészecskében (a) és a mintában lévő nanorészecskék tartalmától függően állandó mennyiségű AfB1 (térfogat 1 ml) (b)

Köztudott, hogy az állatfajok különböző rezisztenciát mutatnak az AfB1 toxikus és karcinogén hatásával szemben. Ez volt az oka annak, hogy kísérleteket végeztünk patkányokkal: érzékenyebbek az AfB1-re, mint például az egerek [16]. A 3. csoport minden patkánya a kísérlet során 0,1 μg AfB1-t kapott tömegenként. Ugyanannyi mennyiségű AfB1-et adtak be orálisan az MND hidroszollal a 4. csoport minden állatához. Spektrális elemzés azt mutatta, hogy az MND hidroszolban található mikotoxin 81% -a nanorészecskéken volt adszorbeálva, 19% pedig szabad volt (ábra. 2 2).

Az AfB1 vizes oldatának és a felülúszónak a spektrális paraméterei, amelyek az AfB1 vizes oldat és az MND hidroszol összekeveréséből, majd a nanorészecskék adszorbeált mikotoxinnal történő eltávolításából következő centrifugálással származnak

A különböző csoportokból származó állatokból vett vérminták elemzése a hematológiai paraméterekben a következő különbségeket mutatta (3. ábra. 3. ábra). A 2. csoportba tartozó patkányok vére lényegesen magasabb leukocita szintet tartalmazott, mint a kontroll állatok vére (1. csoport), valószínűleg a granulociták jelentős növekedésének köszönhető. Korábban azt feltételeztük, hogy az orálisan MND-t kapó egerekben a fehérvérsejtek teljes szintjének növekedése a nanorészecskék és a gyomor-bélrendszeri makrofágok közötti kölcsönhatás következménye lehet [17]. A 3. csoportba tartozó patkányok alacsonyabb leukocita szinttel rendelkeznek, nyilvánvalóan a limfocita szám jelentős (több mint kétszeres) csökkenése miatt. Ez jelezheti az immunstátusz romlását e csoport patkányaiban az AfB1 toxikus hatására reagálva. Az irodalmi adatok arra utalnak, hogy az AfB1 különböző dózisai stimulálhatják vagy elnyomhatják a szervezet immunrendszerét [18-20]. A 4. csoportba tartozó állatok, amelyek AfB1-et kaptak MND hidrosollal, kevésbé hangsúlyos különbségeket mutattak a teljes leukocita szintben, ideértve a limfocita és granulocita számban mutatottakat is, az 1. csoport patkányainak megfelelő paramétereitől.

Leukocita szintek a patkányok vérében, amelyek orálisan kaptak vizet (kontroll), az MND hidrosolt, az AfB1 vizes oldatot és az AfB1 az MND hidrosollal. Megjegyzés: WBC leukociták, LYM limfociták, MON monociták, GRA granulociták. A hematológiai paramétereket a kísérlet végén határoztuk meg

Nem találtunk szignifikáns különbséget a kezelt patkányok és a kontrollcsoport vörösvértest-számai között (4.a ábra. 4a. Ábra). A vérlemezkeszám magasabb volt a 2. és 3. csoportba tartozó állatoknál (ábra (4b. Ábra). 4b). A 4. csoportba tartozó patkányok vérében azonban a vérlemezkeszám hasonló volt az 1. csoportba tartozó állatokéhoz. Véleményünk szerint ezek az eredmények utalhatnak az MND és az AfB1 (miután a mikotoxin nanorészecskékre adszorbeálódott) fehérvérsejtekre gyakorolt hatásainak kölcsönös enyhítésére. Ugyanez a magyarázat javasolható a vérlemezkeszám regisztrált különbségeire a kezelt állatok és a kontrollcsoport között.

Vörös vérsejtek (a) és a vérlemezkeszám (b) a kezelt csoportok patkányaiban és a kontroll állatokban. A hematológiai paramétereket a kísérlet végén határoztuk meg

Az állatok hepatocitáinak ultraszerkezete: a 1. csoportba tartozó patkányok, amelyek orálisan kaptak vizet, b A 2. csoportba tartozó patkányok, amelyek orálisan kapták az MND hidrosolt, c A 3. csoportba tartozó patkányok, amelyek orálisan kapták az AfB1 vizes oldatot, d A 4. csoportba tartozó patkányok, amelyek orálisan kapták az AfB1-et MND hidrosollal. Rúd - 2 μm. A nyilak a sima endoplazmatikus retikulum hiperpláziáját mutatják a hepatocita képen. Megjegyzés: n mag, m mitokondrium, lip lipid zárványok, ly lizoszómák

Következtetés

Így a vér hematológiai paramétereinek és a patkányok májsejtjeinek vizsgálatának eredményei arra utalhatnak, hogy az AfB1 orális beadása az MND hidrosollal együtt kevésbé toxikus hatást gyakorol az állatokra, mint az önmagában adott AfB1 orális beadása. Miután az AfB1 MND-n adszorbeálódott, a mikotoxin és a nanorészecskék hatásait kölcsönösen enyhíteni kell. Korábbi, in vitro kísérleteink igazolták, hogy az MND vizes oldatokból adszorbeálja az AfB1-et szubsav-, sav- és lúgos pH-értékkel, amelyek a gyomor-bél rendszer különböző szakaszaira jellemzőek [11]. Az MND, mint béladszorbens másik előnye az AfB1 magas adszorpciós aránya (a folyamat legfeljebb 2-3 percig tart) és a nanorészecskék nagyon jó biokompatibilitása, amelyet különféle fajok állatokkal végzett in vivo kísérletek bizonyítottak [14]. Ezért az MND javasolható bél adszorbensként a mikotoxinok, különösen az AfB1 megkötésére és semlegesítésére.

Köszönetnyilvánítás

A tanulmányt az Orosz Alapkutatás Alapítvány (RFBR) (06-04-90234. Sz. Támogatás) és a RAS Elnökség (27. program, 64. projekt) pénzügyileg támogatta.

Nyílt hozzáférésű

Ezt a cikket a Creative Commons Nevezd meg, nem kereskedelmi célú licenc feltételei szerint terjesztjük, amely bármilyen nem kereskedelmi célú felhasználást, terjesztést és sokszorosítást lehetővé tesz bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző (k) és a forrás jóváírásra kerülnek.