Szérum keringő mikroRNS profilozás a potenciális 2-es típusú cukorbetegség és elhízás biomarkerek azonosításához

Cukorbetegségekkel foglalkozó spanyol orvosbiológiai kutatóközpont (CIBERDEM), Madrid, Spanyolország, Instituto de Investigación Sanitaria del Clínico San Carlos Kórház (IdISSC), Madrid, Spanyolország

Társulás Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos (IdISSC), Madrid, Spanyolország

Nuria Pescador,
Milagros Pérez-Barba,
José María Ibarra,
Arturo Corbatón,
María Teresa Martínez-Larrad,
Manuel Serrano-Ríos

Ábrák

Absztrakt

Háttér és cél

A mikroRNS-ek kicsi, nem kódoló RNS-ek, amelyek fontos szabályozó szerepet játszanak számos biológiai folyamatban, beleértve az összetett anyagcsere-folyamatokat, például az energia- és a lipid-anyagcserét, amelyeket a cukorbetegség és az elhízás összefüggésében vizsgáltak. A közelmúltban bebizonyosodott, hogy egyes mikroRNS-ek bőségesen és stabilan léteznek a szérumban, és potenciálisan betegségspecifikusak. Ennek a profilalkotó vizsgálatnak az volt a célja, hogy jellemezze a miRNS expresszióját elhízott, nem elhízott diabéteszes és elhízott diabéteszes egyének szérummintáiban annak megállapítására, hogy a miRNS expressziója deregulálódott-e ezekben a szérummintákban, és annak azonosítása, hogy bármely megfigyelt dereguláció specifikus volt-e akár elhízásra, akár cukorbetegségre vagy cukorbetegséggel járó elhízás.

Betegek és módszerek

Tizenhárom 2-es típusú cukorbeteg, 20 elhízott, 16 elhízott 2-es típusú cukorbeteg és 20 egészséges kontrollt választottak ki ebbe a vizsgálatba. MiRNA PCR paneleket alkalmaztunk 739 miRNS szérumszintjének szűrésére e négy csoport összesített mintáiban. Összehasonlítottuk a keringő miRNS szintjét az egyes csoportok szérumkészletei között. Az ígéretes biomarkerként kiválasztott tizenkét mikroRNS egyedi validálását RT-qPCR alkalmazásával végeztük.

Eredmények

Három szérum mikroRNS-ről, a miR-138, miR-15b és miR-376a-ról kiderült, hogy képesek prediktív biomarkerként szolgálni az elhízásban. A miR-138 vagy miR-376a használata hatékony prediktív eszközt jelent az elhízott betegek és a normál egészséges kontrollok, a cukorbetegek és az elhízott cukorbetegek megkülönböztetésére. Ezenkívül a miR-503 és miR-138 kombinációja megkülönbözteti a cukorbetegeket az elhízott cukorbetegektől.

Következtetés

Ez a tanulmány az első, amely bemutatja az elhízás szérum miRNS-paneljét, és összehasonlítja azokat a miRNS-ekkel, amelyeket a szérumban azonosítottak cukorbetegség és elhízás esetén. Eredményeink alátámasztják a szérummintákból kivont miRNS-ek alkalmazását az elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség lehetséges prediktív eszközeként.

Idézet: Pescador N, Pérez-Barba M, Ibarra JM, Corbatón A, Martínez-Larrad MT, Serrano-Ríos M (2013) Serum Circulating microRNS Profiling for Identification of Potential 2 Type Diabetes and Obesity Biomarkers. PLoS ONE 8 (10): e77251. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077251

Szerkesztő: Qingyang Huang, Közép-Kínai Normál Egyetem, Kína

Fogadott: 2013. június 2 .; Elfogadott: 2013. szeptember 9 .; Közzétett: 2013. október 15

Finanszírozás: Ezt a munkát a CIBER finanszírozta a cukorbetegség és társult anyagcserezavarok (ISCIII, Ministerio de Ciencia e Innovación) és a madridi autonóm közösség (MOIR S2010/BMD-2423) finanszírozásában. Részleges támogatást kapott a spanyol Eli Lilly Lab oktatási támogatásai is. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők a következő érdeklődési körökkel rendelkeznek: ezt a munkát részben kereskedelmi forrás (Eli Lilly Lab) finanszírozta. Ez nem változtatja meg a szerzőknek az adatok és anyagok megosztására vonatkozó PLOS ONE irányelvek betartását.

Bevezetés

A profilalkotás célja az volt, hogy jellemezze a miRNS expresszióját elhízott, nem elhízott és elhízott cukorbetegek szérummintáiban. Meg akartuk állapítani, hogy a miRNS-expresszió deregulálódott-e ezekben a szérummintákban, és meg akartuk határozni, hogy bármely megfigyelt dereguláció specifikus volt-e akár elhízásra, akár cukorbetegségre, akár cukorbetegséggel járó elhízásra. Ez a tanulmány az első, amely egy panel szérum miRNS-t mutat be az elhízás szempontjából, és összehasonlítja azokat a miRNS-ekkel, amelyeket a szérumban azonosítottak a cukorbetegség és az elhízás cukorbetegségében.

Anyagok és metódusok

Vizsgálati populáció, vérvétel és szérum előkészítése miRNS vizsgálatokhoz

Vezérlők: DM2OBOB-DM2

Tárgyak M/F%	20; 50/50	13; 53/46	20; 15/85	16; 60/40
Életkor (év)	42,9 ± 12,13	69,40 ± 7,12 *	41,7 ± 11,18	67,55 ± 11 *
BMI (Kg/m 2)	22,7 ± 2,43	24,86 ± 1,49	42,73 ± 4,67 *	33,38 ± 2,86 *
Derék kerülete (cm)	79,45 ± 7,77	91,53 ± 6,75	110,56 ± 10,26 *	121,13 ± 7,26 *
Éhomi glükóz (mg/dl)	91,27 ± 7,25	126,57 ± 23,09 *	93,32 ± 6,25	148,45 ± 60,16 *
Inzulin	10,14 ± 5,56	21,25 ± 12,65 *	29,24 ± 13,2 *	29,78 ± 20,93 *
HOMA	2,38 ± 1,46	6,89 ± 5,81	6,22 ± 2,99	10,64 ± 8,66
Koleszterin (mg/dl)	185,8 ± 31,88	183,47 ± 38,38	197,33 ± 35,52	180,79 ± 37,2
LDL-C (mg/dl)	108,77 ± 24,59	84,22 ± 26,97 *	118,13 ± 29,95	71,86 ± 33,49 *
HDL-C (mg/dl)	61,85 ± 17,5	55,60 ± 10,9	49,13 ± 11,65 *	50,16 ± 7,87 *
SBP (Hgmm)	111,8 ± 12,63	131 ± 17	137 ± 14	131 ± 16
DBP (Hgmm)	71,5 ± 10,01	75 ± 10	77 ± 9,6	83 ± 12
Derékkörülmények (cm)	79,45 ± 7,77	91,53 ± 6,75	110,56 ± 10,26 *	121,13 ± 7,26 *

1. táblázat: Klinikai jellemzők.

miRNS izolálás és az RNS minőségellenőrzése

Az egyes miRNS-ek elemzése valós idejű kvantitatív PCR-rel

MiRCURY LNA ™ microRNS PCR rendszert (Exiqon) használtunk az egyes miRNS-ek szérumban való jelenlétének felmérésére. A cDNS-t templátként használtuk a qPCR reakcióhoz miRNS-specifikus LNA ™ PCR primer és Universal PCR primer alkalmazásával. A génexpressziós szinteket a 7900HT Fast Real-Time PCR rendszer (Applied Biosystems Inc.) segítségével számszerűsítettük 384 lyukú lemezeken. Az egyes kiterjesztett minták qRT-PCR elemzéséhez először a megnövekedett expressziós stabilitás és a GeNorm módszertan alapján megfelelő számú referencia miRNS-t értékeltünk. A GeNorm elemzés 4 referencia miRNS-t javasolt (miR-30C, miR-103, miR-191 és miR-423-3p). A különféle endogén kontrollok (referencia miRNS-ek) kiválasztását és hozzáadását a qRT-PCR-mérésekhez, és ennek a geometriai átlagnak a felhasználását a normalizálás legpontosabb és legerőteljesebb tényezői közé sorolták [15]. Így az összes kiválasztott belső kontroll geometriai átlagát használtuk normalizáló tényezőként. A relatív expressziót összehasonlító Ct módszerrel számoltuk.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzést az SPSS szoftver verziójával végeztük 15.0 (SPSS, Inc., Chicago, USA). A P-ΔΔCt értéke legalább 5 volt.

Validálás RT-qPCR segítségével egyedi szérummintákban

Az előzetes szűrési eredményekből azonosított potenciális biomarkerek validálásához ezen miRNS-ek szérumszintjét qRT-PCR vizsgálatokkal mértük. Az Anyagok és módszerek korábban leírtak szerint az összes kiválasztott belső kontroll (miR-30C, miR-103, miR-191 és miR-423-3p) geometriai átlagát használtuk normalizáló kontrollként a szérumban. A szérum miR-30C, miR-103, miR-191 és miR-423-3p szinteket minden alanyban (beteg és kontroll) értékeltük. Adataink azt mutatták, hogy ezeknek a miRNS-eknek a Ct-értékei között nem volt szignifikáns különbség a kontroll és a páciensminták között (S4. Táblázat). A 12 kiválasztott miRNS szérumszintjét qRT-PCR-rel validáltuk a 69 szérummintán (S2. Ábra; S5. Táblázat). Adataink azt mutatták, hogy mind a 12 miRNS-t kimutatták a szérumban, de az elhízott szérumban csak a miR-138 és a miR-376a szignifikánsan csökkent, és a szérum miR-15b szintje szignifikánsan magasabb volt a kontrollokhoz, a diabéteszes és elhízott cukorbetegekhez képest (az összes p-érték ábra 1. A miR-138 (A), miR-376a (B), miR-15b (C) és miR-503 (D) szérumszintjeinek összehasonlítása kontrollokban, DM2, OB és OB-DM2 csoportokban.

A grafikonok az interkvartilis tartomány mediánszintjét mutatják. A Kruskal-Wallis tesztet Dunn post tesztjével alkalmaztuk a csoportok közötti különbségek jelentőségének meghatározására. A szérumszinteket RT-PCR alkalmazásával határoztuk meg RNS extrakciót követően. Két technikai replikátumot végeztünk két cDNS-replikátumon.

A miR-138, miR-376a és miR-15b biomarker-potenciáljának értékelése az OB-betegek megkülönböztetése a normál egészséges kontrolltól

A vevő működési karakterisztikájának (ROC) görbe elemzése azt mutatta, hogy a miR-138, miR-376a és miR-15b ROC görbe területe önmagában 0,9950 (95% CI, 0,98310-1,0000), 0,8875 (95% CI, 0,78905-0,998595) és 0,9075 (95% CI, 0,6543-0,9404) (2A., 2B., 2C. Ábra). Bár a miR-15b és a miR-376a önmagában kielégítő ROC-értékeket eredményezett, a miR-138 (2A. Ábra) ROC-értékeket mutatott az OB-betegek egészséges kontrolltól való megkülönböztetéséhez. Ezért önmagában a miR-138 alkalmazása kiváló diszkriminációt biztosít az OB betegek és az egészséges alanyok között.

(AmiR-138, (B) miR-376a és (C) A miR-15b különbséget tud tenni az OB és a CTR között. (DmiR-138 (EmiR-376a (F) A miR-15b különbséget tehet OB és OB-DM2 között. (GmiR-138 (HmiR-376a (én) A miR-15b különbséget tud tenni OB és DM2 között.

A miR-138, miR-376a és miR-15b biomarker-potenciáljának értékelése az OB-betegek megkülönböztetésére az OB-DM2 és DM2 betegektől

Annak eldöntésére, hogy a szérum miRNS szintje felhasználható-e az elhízott betegek megkülönböztetésére az OB-DM2 és DM2 betegektől, ROC görbéket hoztunk létre a szérum miR-138, miR-376a és miR-15b szintek közötti különbségek elemzésére a csoportok között. Az OB-alanyokat az OB-DM2-vel összehasonlítva a miR-138, miR-376a és miR-15b ROC görbe területei 0,8758 (95% CI: 0,6838-0,9477), 0,8816 (95% CI, 0,7797-0,9835) és 0,7974 (95% CI, 0,6543-0,9404) (2D., 2E., 2F. Ábra). Ezek az eredmények egyértelműen megmutatták, hogy a szérum miR-138 és miR-376a szintje meg tudja különböztetni az OB-ben szenvedő betegeket az OB-DM2-től. Ezután összehasonlítottuk ezen szérum miRNS-ek szintjét az OB és a DM2 között. A miR-138, miR-376a és miR-15b ROC görbe területei 0,8538 (95% CI: 0,7165-0,09912), 0,8423 (95% CI, 0,7065-0,9781) és 0,8769 (95% CI, 0,7546-0,9992) ) (2G, 2H, 2I ábra). Ezek az eredmények azt is bizonyították, hogy e három miRNS szintje meg tudja különböztetni az OB-ben szenvedő betegeket a DM2-től. Ezek az eredmények együttesen azt mutatták, hogy a szérumban található miR-15b, miR-138 és miR-376a szintek felhasználhatók az OB megkülönböztetésére az OB-DM2-től, a DM2-től és az egészséges kontrolltól.

A miR-503 és miR-138 biomarker-potenciáljának értékelése kombinációban a DM2 megkülönböztetésére az OB-DM2 betegektől

Eredményeink azt mutatják, hogy az egyetlen miRNS nem képes megkülönböztetni a DM2 és az OB-DM2 között (1. ábra). A miR-503 csak egy volt, amely lehetővé tette a DM2 vagy az OB-DM2 megkülönböztetését az egészséges kontrolloktól (1D. ábra). A miR-503 és miR-138 többszörös logisztikus regressziós analízisében az eredményül kapott ROC görbe ésszerű elkülönülést mutat a két csoport között (AUC = 0,7773; CI 0,5886-0,9661) (3A. Ábra). A miR-503 és miR-376a többszörös logisztikus regressziós elemzése szintén képes megkülönböztetni (AUC = 0,7530; CI 0,5596-0,99465) (3B ábra). A miR-503 és miR-15b ezen elemzése azonban nem képes megkülönböztetni ezeket a körülményeket (3C. Ábra). Fontos, hogy a miRNS biomarkerek meg tudják különböztetni az elhízást és a cukorbetegségben szenvedőket az elhízástól vagy egészséges kontrolltól. Egy ilyen teszt hasznos lehet a cukorbetegség előrejelzésében.

A miR-503 és miR-138 (A) és miR-503 és miR-376a (B) különbséget tudott tenni a DM2 és az OB-DM2 betegek között. (C) A miR-503 és miR-15b kombinációja nem tehet különbséget a DM2 és az OB-DM2 betegek között.

Vita

A miR-376a elhízásban betöltött szerepéről azonban nincsenek jelentések. A májsejtes karcinóma sejtekben a HCC, a miR-376a jelentősen le van szabályozva, az emelkedett miRNS-376a pedig a p85α és közvetlenül a PIK3R1 redukciójával visszaszorította a sejtek proliferációját és apoptózist indukált a HCC sejtekben [31]. Az apoptózis a homeosztázis fenntartásának alapvető mechanizmusa a veszélyes és felesleges sejtek eltávolításával. Az adipociták azonban rezisztensek az apoptózissal az Akt/protein kináz B magas szintje és az anti-apoptotikus Bcl-2 faktor miatt. Az adipocitákat apoptotikus mechanizmusokkal lehet eltávolítani bizonyos kóros állapotokban, például elhízásban. Az apoptosis indukálása az adipocytákban a miR-376a szabályozásával lehetséges módszer lehet az adipocita szám csökkentésére.

Ezért ez a három, ebben a vizsgálatban azonosított miRNS szerepet játszhat az adipogenezisben, a hasnyálmirigy regenerációjában, a proliferációban és az apoptózisban. Mindezek a folyamatok fontosak az elhízás környezetében, de eredményeink azt mutatják, hogy ezek a miRNS-ek jelentős különbségeket mutatnak az OB és az egészséges kontroll között, és ami még fontosabb, ezek a miRNS-ek lehetővé teszik az OB és az OB-DM2 betegek megkülönböztetését. Az elhízott betegeknél a nyilvánvaló cukorbetegség előrehaladása nem mindig kiszámítható. Így míg egyes elhízott egyének 2-es típusú cukorbetegségbe kerülnek, másoknál csak enyhe anyagcserezavarok jelentkezhetnek, ami arra utal, hogy a tárolt zsír abszolút mennyisége nem lehet a legfontosabb tényező, amely meghatározza az elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség kapcsolatát [32]. Valójában más tényezőket, például a zsírszövet gyulladását tekintik a 2-es típusú cukorbetegség progressziójának kulcsfontosságú elősegítőinek [33]. A közelmúltban a miR-138-ról beszámoltak a nyelőcső laphámsejtes karcinómában (ESCC), és a lipid tutajok FLOT1, FLOT2 és caveolin-1 markereit azonosították célpontjaként, és az NF-kappaB aktiválódott [34]. Jövőbeni vizsgálatokra lesz szükség annak feltárására, hogy az elhízott betegek szérummintáiban a miR-138 csökkentése fontos szerepet játszhat-e az elhízás gyulladásos folyamatában is.

Ebben a vizsgálatban azonosítottak egy szérum 3-miRNS-alapú expressziós profilt, amely képes volt pontosan megkülönböztetni az OB egyedeket a normál kontrolloktól, valamint az OB-DM2 és DM2 betegeket. Az erősen expresszált miRNS-ek egy része azonban különbözött a korábbi vizsgálatokban találtaktól. Ez az inkonzisztencia főként a miRNS-források különbségeinek vagy az intracelluláris miRNS-ek és az extracelluláris miRNS-ek különbségének tudható be. Más tényezők, például a tanulmány megtervezése, a faj, a minta nagysága vagy a módszertan is befolyásolhatják a végeredményeket. Ezek a megállapítások kihatással lehetnek az OB megértésére, a kezelési stratégiák kialakítására és a prognózis becslésére.

Fontos kérdés merül fel a cukorbetegségben, az elhízásban és a kapcsolódó állapotokban alkalmazott farmakológiai kezelések bármelyik azonosított miRNS-re gyakorolt lehetséges hatásáról. Gyakorlatilag egyetlen tanulmány sem foglalkozott ezzel a kérdéssel klinikai körülmények között. Azonban csak Zampetaki et al. [8] hasonló szintű 13 miRNS-t mutatott a plazmában (miR-15a, miR-20b, miR-21, miR-24, miR-126, miR-191, miR-197, miR-223, miR-28-3p, miR-150, miR-29b, miR-320 és miR-486) cukorbetegeknél, főként szulfonilureákkal, gyógyszeres kezeléssel vagy anélkül. Valójában ajánlott olyan tanulmányok, amelyek értékelik a gyógyszerek szerepét a miRNS szabályozásában az anyagcserezavarokban.

Összegzésképpen: Ez a tanulmány az első, amely bemutatja az elhízás szérum miRNS-paneljét, és összehasonlítja azokat a miRNS-ekkel, amelyeket a szérumban azonosítottak cukorbetegség és elhízás esetén. Ezenkívül tanulmányunk a szérummintákból kivont miR-15b, miR-138 és miR-376a felhasználását támogatja az elhízás és a 2-es típusú cukorbetegség lehetséges prediktív eszközeként.