Szkvalén: A metabolikus hatások sokasága

Adela Ramírez-Torres, Clara Gabás-Rivera és Jesús Osada

Beküldve: 2015. november 23. Felülvizsgálat: 2016. május 24. Megjelenés: 2016. október 26

Absztrakt

Kulcsszavak

Apolipoprotein E-hiányos egerek
Szűz oliva olaj
Szkvalén
Lpin1
Thrsp
Mat1a
Akádok
Txndc5

fejezet és a szerző információi

Szerzői

Adela Ramírez-Torres

Biokémiai, Molekuláris és Sejtbiológiai Tanszék, Állatorvosi Iskola, Aragón Egészségügyi Kutatóintézet - Zaragoza Egyetem, Zaragoza, Spanyolország

Clara Gabás-Rivera

Biokémiai, Molekuláris és Sejtbiológiai Tanszék, Állatorvosi Iskola, Aragón Egészségügyi Kutatóintézet - Zaragoza Egyetem, Zaragoza, Spanyolország

Jesús Osada *

Biokémiai, Molekuláris és Sejtbiológiai Tanszék, Állatorvosi Iskola, Aragón Egészségügyi Kutatóintézet - Zaragoza Egyetem, Zaragoza, Spanyolország
Aragóni Mezőgazdasági és Élelmezési Intézet, CITA-Zaragozai Egyetem, Zaragoza, Spanyolország
Az elhízás és táplálkozás fiziopatológiájának CIBER-je, Carlos III Egészségügyi Intézet, Madrid, Spanyolország

* Az összes levelezést címezze: [email protected]

A szerkesztett kötetből

Szerkesztette: Dimitrios Boskou és Maria Lisa Clodoveo

1. Bemutatkozás

A „Hét ország” tanulmány bizonyította, hogy a szív- és érrendszeri mortalitás a mediterrán országokban volt a legalacsonyabb a tanulmányban részt vevő más régiókhoz képest [1]. A mediterrán táplálkozási szokások nemcsak az alacsonyabb kardiovaszkuláris mortalitással, hanem a teljes halálozással is összefüggenek [2]. A mediterrán étrendet alkalmazó diétás beavatkozások kedvező eredményeket hoztak mind az elsődleges [3], mind a másodlagos megelőzésben a koszorúér-események és az áldozatok számának csökkentésével [4]. Mindezek a bizonyítékok megalapozták a tudományos hátteret ahhoz, hogy a mediterrán étrendet az emberiség szellemi kulturális örökségeként javasolják (http://www.unesco.org/culture/ich/es/RL/00394).

A hagyományos mediterrán étrendben a fő zsírforrás az olívaolaj volt [5]. A szűz olívaolaj, a fizikai úton kivont olaj példája, funkcionális élelmiszer, mivel számos összetevőt tartalmaz, amelyek hozzájárulhatnak az általános biológiai tulajdonságokhoz. Az egyszeresen telítetlen zsírsavakat tartalmazó magas triacil-glicerin-szintekről ismert, jó fitokémiai anyagok, például szkvalén [6], fenolos vegyületek [7, 8], terpének, fitoszterolok és alfa-tokoferol [9, 10] jó forrása. A szkvaléntartalom a szűz olívaolajban nagy változékonyságot mutat, 1,5–9,6 g/kg között [11], és ligetfajták szerint változhat [12]. Ennek a változatosságnak a ellenére a szkvalén a szűz olívaolajok második leggyakoribb összetevőjét képviseli, és a legmagasabb a gyakran fogyasztott növényi olajokban [13]. Egyes finomítási folyamatokban a szkvalén veszteség elérheti a 20% -ot [6]. Ez a molekula azonban stabil marad a szűz olívaolajban, amelyet 180 ° C-on 36 órán át melegítenek [14]. Hőstabilitása alkalmassá teszi a szkvalént a bevitel biztosítására, mind főtt, mind nyers ételben fogyasztva. In vitro rendkívül hatékony oxigént elnyelő szer, és kimutatták, hogy kemopreventív hatású számos daganattal szemben [a leírt tulajdonságok részletes áttekintését a Ref. [13]].

Az Egyesült Államokban a szkvalén átlagos bevitele 30 mg/nap. Ha azonban az olívaolaj fogyasztása magas, a szkvalén bevitele elérheti a 200-400 mg/nap értéket, amint azt a mediterrán országokban megfigyelték [15], vagy akár napi 1 g is lehet [16]. Annak ellenére, hogy a plazma szkvalénszint az étrendi források mellett az endogén bioszintézisből származik, koncentrációja magasabb azokban az emberi populációkban, akik szűz olívaolajat vagy cápamájat fogyasztanak [17]. Stabilitása és biohasznosulása vonzó vegyületté teszi a szkvalént biológiai tulajdonságainak jellemzésére.

2. A máj: diétás tápanyagokra érzékeny szerv

A máj foszfolipideket, koleszterint és triacil-glicerint választ ki a plazmába lipoprotein-komplexként, ami lehetővé teszi ezen lipidek transzportját a vér vizes közegébe. Az apolipoproteinek, például az APOB100, az APOA1, az APOA2 és az APOE a lipoproteinek fő fehérjekomponensei. Továbbá ez a szerv szekretálja a lipoproteinek plazma-transzformációjában részt vevő enzimeket (máj lipáz, lecitin-koleszterin aciltranszferáz és foszfolipid transzfer fehérje) is [18].

3. Módszertani munkafolyamat

Két hónapos, hím, homozigóta Apoe-hiányos egereket alkalmaztunk C57BL/6J × Ola129 genetikai háttérrel. Két, azonos plazma koleszterinszintű vizsgálati csoportot hoztak létre: (a) egyikük chow-étrendet kapott, italja 1% (v/v) glicerin-oldatot (n = 8) tartalmazott, és (b) a másik ugyanazt a chow-étrendet kapta, de ivóoldatát szkvalénnel egészítettük ki, így 1 g/kg/nap dózist kaptunk (n = 9). 10 héten keresztül az egereket kísérleti étrendekkel etették, amelyeket jól toleráltak, mivel a túlélés, a fizikai megjelenés, valamint a szilárd és folyékony bevitel nem volt jellemző, amint azt korábban leírtuk [22]. Ez idő után az állatokat feláldoztuk és a májat eltávolítottuk. Az egyik semleges formaldehidben tárolt alikvotot használtuk a lipidcseppek mennyiségének értékelésére, a teljes májmetszet százalékában kifejezve, a fennmaradó részt pedig folyékony nitrogénben fagyasztva az összes RNS kivonására és a szubcelluláris frakciók izolálására használtuk.

Az Affymetrix GeneChip Murine Genome MOE430A tömbben ábrázolt 22 690 transzkriptum expressziójának változását elemeztük a szkvalén hatásának megismerésére. Ennek érdekében a chow-étrendben lévő nyolc egér összesített májmintáit összehasonlítottuk a vegyületet kapókkal, az 1. ábra szerint.

A mikrorácsok által nyújtott hatalmas mennyiségű információ további feldolgozást igényel annak érdekében, hogy értelmes és kezelhető adatokat kapjunk a munkához, például csak a legmagasabb expresszióváltozással rendelkező géneket vagy azokat, amelyek részt vesznek egy bizonyos anyagcsere-pályában [23]. Jelen munka során az első megközelítést alkalmaztuk, és csak azokat a géneket tekintettük nagy reagálóknak a szkvalén bevitelére, amelyek expressziója erősen módosult (jel log2 arány ≥ 1,5 vagy ≤ 1,5). A génexpressziót később kvantitatív reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakcióval (RT-qPCR) igazolták, hogy megerősítsék az eredmények érvényességét.

A mitokondriális és mikroszómális frakciók előállításához a májokat PBS-ben (4 ml/g szövet) homogenizáltuk proteáz inhibitor koktél tablettákkal (Roche). A szöveti törmeléket 200xg sebességgel 10 percig, 4 ° C-on végzett centrifugálással távolítottuk el. A homogenátumot 1000 x g-nél 15 percig centrifugáltuk. A felülúszót tartalmazó mitokondriumokat teljes sebességgel, 13 000 x g-vel 2 percig centrifugáltuk. A mitokondriális pelleteket ezután kétszer mostuk, ülepítettük, PBS-ben szuszpendáltuk és 1 percig centrifugáltuk. Mikroszómális frakciók keletkeztek a poszt-mitokondriális felülúszó centrifugálásával 105 000 x g-vel 90 percig. Ezeket a pelleteket kétszer mostuk, azonos sebességgel centrifugáltuk és végül újraszuszpendáltuk 0,5 ml PBS-ben [24, 25].

1.ábra.

Az alkalmazott megközelítés grafikus ábrázolása. A folyamat magában foglalja az RNS előállítását, a mikroarray feldolgozást az expresszió változásainak kiválasztására és az egyes minták kvantitatív reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakcióval (RT-qPCR) történő megerősítését.

A differenciális fehérje expressziót DIGE analízissel elemeztük. Azokat a foltokat, amelyek sűrűsége jelentősen különbözött a kezelések között, kivágtuk a preparatív gélből, és triptikus emésztésnek vetettük alá őket, és tömegspektrometriával azonosítottuk őket [24, 25].

4. A szkvalén által kiváltott globális változások a máj gén expressziójában

Asztal 1.

A szkvalén beadásával differenciálisan szabályozott májgének hím Apoe-hiányos egerekben log2 jel ≥ 1,5 vagy ≤ 1,5 jelszint mellett.

Az adatok jelzik az Affymetrix chip minden egyes állapotának jelintenzitását.

A legrelevánsabb kiválasztáshoz csak azokat a differenciálisan szabályozott géneket vettük figyelembe, amelyek szignál log2 aránya ≥ 1,5 (azokra a génekre, amelyekre fel van állítva) vagy ≤ 1,5 (azokra a génekre vonatkozik, amelyek fel vannak szorítva). Az 1. táblázat felsorolja azokat a géneket, amelyek mRNS-e tükrözte ezeket a változásokat. Öt olyan gén, amely fokozott expressziót mutat a szkvalén beadására adott válaszként. Ezen gének közül kettő transzkripciós faktorokat (Dbp és Tff3) kódolt, három pedig különféle funkciójú fehérjéket (egyikük részt vett a lipid anyagcserében [Lpin1], a második egy jelző molekula [Rgs16], a harmadik pedig egy nukleáris fehérje volt. [Thrsp]). Öt gén felelt meg annak a kritériumnak, hogy a szkvalén beadására adott válaszként csökkent expresszió mutatható ki (1. táblázat). Ezek közül kettő részt vett az immunitásban (H2-Aa és H2-Eb1), az egyik transzkripciós faktor (Arntl), egy részt vett a sejtciklusban (G0s2), végül pedig egy a sejtjelzésben szerepet játszó enzimet kódolt (Pde -4b).

Chow (n = 8)Szkvalén (n = 9)Fold változásSL2R

Felszabályozott gének
Rgs16	0,91 ± 0,16	11,64 ± 1,5 **	12.8	3.7
Thrsp	0,92 ± 0,13	4,00 ± 0,65 **	4.3	2.1
Lpin1	0,96 ± 0,19	9,77 ± 2,00 **	10.2	3.3
Tff3	0,85 ± 0,11	1,26 ± 0,29	1.6	0.6
Dbp	0,92 ± 0,20	3,76 ± 0,72 **	4.08	2.0
Alulszabályozott gének
G0s2	0,56 ± 0,19	0,13 ± 0,02 *	0.2	−2.3
Arntl	1,19 ± 0,25	0,46 ± 0,07 **	0.4	−1.3
Pde4b	1,11 ± 0,17	1,22 ± 0,27	1.1	0.1
H2-Aa	0,94 ± 0,18	0,92 ± 0,18	1.0	0,0
H2-Eb1	1,01 ± 0,16	0,75 ± 0,23	0.7	−0,5

2. táblázat.

A szkvalén hatása a máj génexpressziójára hím Apoe-hiányos egerekben.

Az adatok (átlag ± SEM) tetszőleges egységeket képviselnek, normalizálva a Cyclophilin B expresszióra, minden állapotra az RT-qPCR segítségével. A statisztikai elemzést Mann-Whitney U teszttel végeztük. ** P ≤ 0,01 vs chow, * P ≥ 0,05 vs chow.

A mikroszkóppal kapott eredmények érvényesítéséhez a fenti gének - Arntl, Dbp, G0s2, H2-Aa, H2-Eb1, Lpin1, Pde-4b, Rgs16, Tff3 és Thrsp - expresszióját fel- vagy lefelé szabályozták. külön-külön elemezve specifikus RT-qPCR vizsgálatokkal. Az eredmények normalizálásához a ciklofilin B volt a referencia gén (2. táblázat).

A validációs elemzésbe bevont öt felülszabályozott gén közül négyet - az Rgs16, Thrsp, Lpin1 és Dbp - a szkvalén beadás megerősítette, hogy expresszióikban jelentősen megnőtt. Az öt szelektált gén közül kettő - G0s2 és Arntl - szignifikánsan csökkent a szkvalént kapó hím egerekben. Ezen eljárások között jó megállapodás született (r = 0,94, P

2. ábra.

Asociációs elemzés a hím ApoE-hiányos egerek májzsírtartalmában és a máj mRNS-szintjeiben. A korrelációkat Spearman tesztje alapján számoltuk ki, és az összes kísérleti csoportnak megfelelő értékeket belefoglaltuk. A négyzetek és a háromszögek a chow, illetve a szkvalén csoportoknak felelnek meg.

Az acil-CoA dehidrogenázok családja, beleértve az ACADS-t is, amelynek funkciója rövid szénláncú acil-CoA-n van [35], katalizálja a zsírsav-β-oxidáció kezdeti lépését. A genom egészére kiterjedő asszociációs tanulmány megállapította, hogy ennek a génnek néhány változata károsodott zsírsav-β-oxidációval társult, és a máj steatosisának jelzőjének tűnt [36]. Így az ACADS változások szerepet játszhatnak ennek az állapotnak a szkvalén által kiváltott enyhülésében. Ezek a két fehérje, a MAT1A és az ACADS, mint a szkvalénhatás célpontjai és az előrehaladott májbetegségekben betöltött szerepük arra utalnak, hogy a szkvalén szerepet játszhat ezen patológiák megelőzésében.

3. ábra.

A szkvalén hatása a máj Mat1a és Acads mRNS szintjére hím ApoE-hiányos egerekben. (A) Máj mRNS szintek. Az RT-qPCR analízissel kapott ciklofilin B gén expresszióra utaló, tetszőleges abszorbancia egységekben kifejezett adatokat átlag ± SEM értékként adjuk meg. A statisztikai elemzéseket Mann-Whitney U teszttel végeztük. ** P

6. A szkvalén által kiváltott változások a mikroszóma fehérjékben

A mikrosomális proteom elemzése azt mutatta, hogy a szkvalén indukálta a lipidben (MUP8 és SCP2) és a vezikuláris transzportban (NIPSNAP1 és VCP), a fehérje minőségellenőrzésében (PSMA7, PDIA3, HYOU1 és HSPA5), kalciumtárolásban (CALR) szerepet játszó fehérjék expresszióját. és a redox homeosztázis (TXNDC5 és PYROXD2). Míg a PDIA3 szerepe a VLDL intracelluláris dinamikájában bebizonyosodott, ez nem igaz az olyan fehérjékre, mint a GRP78/HSPA5 és a TXNDC5 [25]. A TXNDC5 fehérje és mRNS szintje azonban fordított és statisztikailag szignifikáns összefüggést mutatott a lipidcseppek területével, amint azt a 4. ábra is tükrözi.

4. ábra.

Az asszociáció elemzi a máj zsírtartalmát, a máj mRNS-ét és a fehérje szintjét a kontroll és a szkvalénnel kezelt Apoe-hiányos egerek között. (A) Korrelációs elemzés a máj zsírtartalma és a fehérje szintje között, (B) Korrelációs elemzés a Txndc5 mRNS szint és a máj zsírtartalma között. A fekete négyzetek a chow-val táplált egereket és a szürke háromszögek a skvalénnel kezelt egereket jelölik.

A TXNDC5, a tioredoxin család tagja, úgy tekinthető, hogy katalizálja a diszulfid képződést a fehérje hajtogatásában, megvédi a fehérjéket az oxidatív károsodásoktól és megakadályozza az endoplazmatikus retikulum stresszt [37]. Az oxidatív stressz csökkenését, amelyet 8-izoprostaglandin F2α-ként értékeltek, szkvalén beadását követően találtunk egerekben [22], más szerzőkkel egyetértésben [38]. Ebben a tanulmányban a megfigyelt TXNDC5 változások hozzájárulhatnak az alacsonyabb oxidatív stresszhez. Figyelembe véve, hogy ez az APOB degradációját kiváltó tényező [39], és következésképpen csökkenti a VLDL szekréciót, a TXNDC5 növekedése stabilizálhatja az APOB-t és elősegítheti a VLDL szekrécióját. Ez a hipotetikus mechanizmus megmagyarázhatja a TXNDC5 szintek és a zsírmáj mértéke közötti megfigyelt összefüggést, és új szerepet képvisel ennek a fehérjének. Ezenkívül a szkvalén hatását mRNS-szinten hajtották végre. Úgy tűnik, hogy a TXNDC5 az APOE hiányában kialakult máj steatosis markere, és szerepet játszhat ennek az állapotnak a szkvalén által kiváltott enyhülésében. Meg kell határozni a TXNDC5 ezen szerepét a lipid anyagcsere és a lipid cseppek szempontjából.

7. A szkvalén hatásának kísérleti modellje

Összességében a szkvalén csökkenti a lipidek májtartalmát azáltal, hogy megkönnyíti a triacil-glicerinek kibocsátását a VLDL-ben és elősegíti a zsírsav-oxidációt, amint az 5. ábrán látható. Ezeket a mechanizmusokat a bazális máj steatózist mutató hím egereknél figyelték meg, mint az apolipoprotein E hiány.

5. ábra.

Szkvalénhatás Apoe-hiányos egerek hepatocitáiban. A szkvalén csökkenti a zsírmáj mértékét azáltal, hogy elősegíti a VLDL szekrécióját és stimulálja a mitokondriális β-oxidációt.

Ezenkívül az étrendben alkalmazott szkvalén összetett szerepe hozzájárul a máj lipiddinamikájának jobb megértéséhez. A szkvalén hatása segíthet megmagyarázni a szűz olívaolaj protektív szerepét, ahol a pálmaolajat kapó egerekhez képest alacsonyabb oxidatív stresszel [40] és kisebb mértékű ateroszklerózis kialakulásával figyeltek meg steatosist [41].

Az akut toxikológiában 58 g/kg (NOAEL) nem észlelt káros hatást (egyszeri orális dózis után) és 29 g/kg-ot detektáltak intramuszkuláris beadás után egerekben [42]. Naponta 20 g/kg/nap mennyiséget használva Gajkowska és mtsai. patkányokban az encephaloneuropathia kialakulásáról számoltak be [43]. Egerekben az 50-es halálos dózist 5 g/kg/napnak tekintik [44], és 10 g-os adagolási rend szerint napi 2 g/kg NOAEL-t találtak [42]. A munkánk során alkalmazott 1 g/kg/nap szkvalén dózis tökéletesen biztonságos, és valójában nem figyeltek meg másodlagos hatásokat. Mivel az egereknél nagyobb az anyagcsere sebessége, mint az embernél [45], ez a dózis megfelel a 100 mg/kg/nap emberi dózisnak. Nyilvánvaló, hogy ez az adag magasabb, mint az emberi táplálkozási vizsgálatokban jelentettek (15 mg/kg/nap) [46], de nem éri el a nőknél alkalmazott 185 és 385 mg/kg/nap dózist [47]. Ezért a jelen tanulmány vonzó dózist tár fel, amelyet el lehet érni a dúsított élelmiszerekben, és javaslatot tesz egy potenciális szkvalén dózisra, amely funkcionális táplálékként vagy zsírmáj terápiájaként használható.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a kutatást a spanyol Ministerio de Economía y Competitividad (Európai Regionális Fejlesztési Alap) 2013-41651-R támogatásai finanszírozták; B-69 az Európai Szociális Alaptól, Gobierno de Aragón; és a CB06/03/1012. sz. CIBER Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición (CIBEROBN), az ISCIII kezdeményezése.