Antioxidáns és α-glükozidáz gátló aktivitásai Achillea tenorii

Eredeti cikk

Teljes cikk
Ábrák és adatok
Hivatkozások
Idézetek
Metrikák
Újranyomtatások és engedélyek
PDF

Absztrakt

Kontextus: Szükség van újszerű gyógymódok felfedezésére olyan anyagcserezavarok megelőzésére és kezelésére, mint a hiperglikémia, a II. Típusú nem inzulinfüggő diabetes mellitus és az elhízás. Számos Achillea fajokat évszázadok óta használják az egész világon, és általában hipoglikémiásnak tekintik őket.

Célkitűzés: A. Etnobotanikai felhasználásának figyelembevétele Achillea nemzetség, értékeltük a in vitro gátló aktivitása Achillea tenorii Grande (Asteraceae) kivonat az α-glükozidázon, amely értékes célpont az anyagcserezavarok megelőzésében és kezelésében. Teszteltük antioxidáns aktivitását is. Ezenkívül a fitokémiai profilt kemotaxonómiai szempontból tárgyalták.

Anyagok és metódusok: In vitro Megvizsgáltuk a légrészekből nyert nyers etanolos extraktum α-glükozidáz gátlását, valamint a in vitro antioxidáns aktivitást (ABTS, DPPH és FRAP-FZ tesztek) mértünk. Az extraktumot fitokémiai szempontból spektroszkópiai elemzéssel jellemeztük.

Eredmények: Az extraktum eredményei α-glükozidáz gátló aktivitással (IC50 32 µg/ml) rendelkeznek, egy olyan specifikus hatásmechanizmussal, amely versenyképtelennek minősül, amely különbözik a legismertebb α-glükozidáz inhibitor (akarbóz és miglitol) megfigyelt mechanizmusától. . Ezenkívül jelentős antioxidáns potenciált találtak a A. tenorii kivonat, amelynek eredményét főleg fenolos vegyületek, például koffeinkin-savak és flavonoidok alkotják.

Megbeszélés és következtetések: Ezek az eredmények arra utalnak, hogy A. tenorii mint lehetséges természetes gyógymód a szénhidrátok anyagcserezavarainak megelőzésére és kezelésére.

Bevezetés

Célkitűzés

Ebben a munkában megvilágítottuk a fitokémiai összetételét A. tenorii poláris frakció, az eredmények kemotaxonómiai szempontból történő megvitatása. Továbbá annak érdekében, hogy információkat nyújtsunk a A. tenorii hidroalkoholos kivonat antioxidánsként ABTS, DPPH és FRAP-FZ teszteket végeztünk. Sőt, figyelembe véve a különböző etnobotanikai használatát Achillea fajok cukorbetegség kezelésében, valamint e növények hipoglikémiás hatásának különböző vizsgálata (Al-Hindawi et al., 1989; Yazdanparast et al., 2007), teszteltük a A. tenorii kivonat az α-glükozidázon, a GH31 család membránhoz kötött enzimén, amely kulcsszerepet játszik a szénhidrát felszívódásában. Valójában ez az enzim katalizálja a szénhidrátok emésztési folyamatának utolsó lépését a poliszacharidok glükózzá és hasonló monoszacharidokká történő hidrolízisével, amelyek könnyen felszívódhatnak (El-Kaissi & Sherbeeni, 2011). Ezért ez az enzim értékes célpontnak tekinthető az étkezés utáni glükóz véremelkedés csökkentése érdekében, az α-glükozidáz inhibitorok pedig hasznosak lehetnek olyan anyagcserezavarok megelőzésére és kezelésére, mint például a II. Típusú nem inzulinfüggő diabetes mellitus, elhízás és hiperglikémia ( Baron, 1998; Taylor & Johnson, 1996).

Anyagok és metódusok

Tábornok

Az NMR-spektrumokat Varian Mercury 300 MHz-es műszerrel rögzítettük, deuterált oldószerként CD3OD vagy D2O felhasználásával; a kémiai eltolódásokat ppm-ben fejeztük ki tetrametil-szilánból (TMS).

Az MS-spektrumokat Q-TOF MICRO spektrométeren (Waters, Manchester, UK) végeztük, amely ESI-forrással volt felszerelve, amelyet negatív és/vagy pozitív ion módban működtettünk. A minta infúziójának áramlási sebessége 10 μL/perc volt, spektrumonként 100 felvétel volt. Az adatokat elemeztük a Waters által fejlesztett MassLynx szoftverrel (Manchester, Egyesült Királyság).

RPE minőségű oldószereket Sigma Aldrich-től (Milánó, Olaszország) vagy Carlo Erba Reagentitől (Milánó, Olaszország) vásároltak; a szilikagél 60 (70–230 mesh ASTM) a Fluka cégtől (Drezda, Németország) származik; az összes többi reagenst Sigma Aldrich-től (Milánó, Olaszország) szerezték be.

Növényi anyagok

Növényi anyagokat gyűjtöttek a Majella Nemzeti Parkból 2011. júniusában, és a botanikai azonosítást a Park botanikusai végezték (Dr. Mirella Di Cecco és Dr. Giampiero Ciaschetti). A vizsgált növény mintáját laboratóriumunkban az AT03062011 regisztrációs szám alatt tároljuk.

Poláris vegyületek kivonása és izolálása

Négy egymást követő extrakciót végeztünk A. tenorii légi részeket (400 g) etanol/víz keverékével (3 liter minden extrakcióhoz, 48 órás infúziós idő). Különösen az első extrakcióhoz 96 térfogatszázalékos etanolt, míg a következő három extrakcióban 80 térfogatszázalékos etanolt használtunk. A kapott kivonatokat külön gyűjtöttük, és a szerves oldószer bepárlása után az extraktumokat lefagyasztottuk és liofilizáltuk. Az elsőtől a negyedik extrakcióig 10,12, 1,87, 1,52 és 0,89 g nyers extraktumot kaptunk.

A kromatográfiás szűrés TLC-n kimutatta a fenolos vegyületek rengetegségét, amit a FeCl3 permetező reagenssel folytatott erős pozitív reakció is bizonyít. A négy kivonat minőségi szempontból hasonlónak tűnt, miközben a mennyiségi különbségek nyilvánvalóak voltak, különösen a harmadik és a negyedik kivonat főleg olyan vegyületekből állt, amelyek Rf. d-glükopiranozid (6.) (17,3 mg) és luteolin-7-O-β-d-glükopiranozid (7) (29,1 mg), a polárisabb frakciókból, és a megfelelő flavon aglikonok apigenin (4) (8,2 mg), luteolin (5.) (5,6 mg) a kevésbé poláros frakciókból (1. ábra). Az összes izolált anyagot a kísérleti spektroszkópiai adatok és az irodalomban közölt adatok összehasonlításával, valamint a laboratóriumunkban kapható standard anyagokkal történő közvetlen összehasonlítással azonosítottuk.

Online közzététel:

1. ábra A poláris frakció azonosított vegyületei.

3-O-Koffein-kininsav (klorogénsav) (11H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7,55 (1H, d, J = 15,9 Hz, Hp), 7,04 (1H, d, J = 1,9 Hz, H2 '), 6,95 (1H, dd, J = 8,2, 1,9 Hz, H6 '), 6,77 (1H, d, J = 8,2 Hz, H5 '), 6,26 (1H, d, J = 15,9 Hz, Hα), 5,33 (1H, td, J = 9,1, 4,5 Hz, H3), 4,22–4,12 (1H, m, H4), 3,72 (1H, dd, J = 8,5, 3,1 Hz, H5), 2,29–1,97 (4H, m, H2, H6). 13C-NMR 75 MHz, D20, δ: 179,7 (COOH quin.), 168,9 (COO kb.), 147,5 (C4 '), 146,1 (Cβ), 144,2 (C3'), 129,7 (C1 '), 122,6 (C6'), 116,2 (C5 '), 115,3 (C2 '), 114,2 (Ca), 77,1 (C1), 75,9 (C3), 74,3 (C4), 72,9 (C5), 38,9 (C6), 37,0 (C2). ESI-MS: m/z [M + Na] + = 377,02; m/z [M - H] - = 352,85.

5.-O-Koffein-kininsav (neoklorogénsav) (21H-NMR: 300 MHz, D20 δ: 7,31 (1H, d, J = 15,9 Hz, Hp), 6,76 (1H, d, J = 1,8 Hz, H2 '); 6,64 (1H, d, J = 1,8 Hz, H6 '); 6,06 (1H, d, J = 15,9 Hz, Ha); 5,05 (1H, s, H5); 4,08 (1H, bd, H3); 3,81 (1H, bd, H4); 2,00 (1H, m, H6); 1,886 (1H, m, H2). 13C-NMR 75 MHz, D20 δ: 180,8 (COOH quin.), 169,8 (COO kb.), 147,9 (C4 '), 146,9 (Cβ), 145,09 (C3'), 127,8 (C1 '), 123,5 (C6'), 117,05 (C5 '), 115,96 (C2 '), 115,4 (Ca), 77,59 (C1), 73,73 (C4), 72,49 (C5), 71,9 (C3), 38,9 (C6), 37,9 (C2). ESI-MS: m/z [M + Na] + = 377,02; m/z [M - H] - = 352,85.

Koffeinsav (31H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7,54 (1H, d, J = 15,9 Hz, Hp), 7,04 (1H, d, J = 1,9 Hz, H2), 6,93 (1H, dd, J = 8,2; 1,9 Hz, H6), 6,78 (1H, d, J = 8,2 Hz, H5), 6,22 (1H, d, J = 15,9 Hz, Ha). 13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 171,08 (COOH), 149,36 (Cp), 147,06 (C4), 146,69 (C3), 127,72 (C1), 122,87 (C6), 116,44 (C5), 115,42 (C2), 115,05 (Ca). ESI-MS: m/z 179,05 [M - H] - .

Apigenin (41H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7,84 (2H, d, J = 8,6 Hz, H2 ', H6', 7,12 (2H, d, J = 8,5 Hz, H3 ', H5'), 6,82 (1H, s, H3), 6,68 (1H, d, J = 2,0 Hz, H8), 6,57 (1H, d J = 2,0 Hz, H6). 13C-NMR (75 MHz, CD3OD) 8: 182,0 (C4), 165,7 (C7), 163,2 (C5), 162,5 (C2), 162,2 (C4 '), 157,6 (C9), 129,1 (C2', C6 ') Mért: 122,0 (C1 '), 116,8 (C3', C5 '), 105,3 (C10), 103,3 (C3), 99,0 (C6), 94,6 (C8). ESI-MS: m/z 269,03 [M - H] - .

Luteolin (5.1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7,41 (1H, dd, J = 8; 2 Hz, H6 '), 7,37 (1H, d, J = 2 Hz, H6 '), 6,90 (1H, d, J = 8,2 Hz, H5 '), 6,68 (1H, s, H3), 6,47 (1H, d, J = 1,8 Hz, H8), 6,28 (1H, d, J = 1,8 Hz, H6). 13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 182,4 (C4), 164,7 (C7), 164,4 (C2), 162,5 (C5), 150,4 (C4 '), 146,6 (C3'), 123,1 (C6 '), 119,5 (C1'), 116,8 (C5 ') Mért: 104,7 (C10), 99,6 (C6), 96,2 (C8). ESI-MS: m/z 287,15 [M - H] -; m/z 309,27 [M + Na] + .

Apigenin-7-O-β-d-glükopiranozid (kozmetin) (6.1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H3 ', H5'), 6,92 (2H, d, J = 8,6 Hz, H2 ', H6', 6,79 (1H, s, H8), 6,62 (1H, s, H3), 6,48 (1H, s, H6), 5,07 (1H, d, J = 7,0 Hz, H1 ″), 4,12–3,50 (átfedésben lévő cukorjelek). 13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ 184,0 (C4), 166,7 (C7), 164,7 (C5), 163,8 (C2), 162,8 (C4 '), 158,9 (C9), 129,6 (C2', C6 '), 123,0 (C1'), 117,0 (C3 '), C5 ′), 107,0 (C10), 105,3 (C3), 104,1 (C6), 101,6 (C1 ″), 78,5 (C5 ″), 77,3 (C3 ″), 74,7 (C2 ″), 71,3 (C4 ″), 62,5 (C6 "). ESI-MS: m/z 431,26 [M - H] - .

Luteolin-7-O-β-d-glükopiranozid (cynaroside) (71H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 7,42 (2H, bd, J = 8,2, H6 ', H2', 6,89 (1H, d, J = 8,5, H5 '), 6,79 (1H, bs, H8), 6,68 (1H, bs, H3), 6,47 (1H, s, H6), 5,09 (1H, d, J = 7,2, H1 "). 13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ 184,2 (C4), 166,7 (C7), 164,8 (C2), 162,8 (C5), 151,0 (C4 '), 147,1 (C3'), 124,1 (C6 '), 120,5 (C1'), 117,1 (C5 '), 104,2 (C10), 101,2 (C1 ″), 99,5 (C6), 96,1 (C8), 77,9 (C5 ″), 75,4 (C3 ″), 74,7 (C2 ″), 72,9 (C4 ″), 62,51 (C6 ″) . ESI-MS: m/z 471,14 [M + Na] +; m/z 447,23 [M - H] - .

Biológiai tevékenységek

DPPH és ABTS

A DPPH vizsgálatot Brand-Williams és mtsai. (1995), némi módosítással. Különböző növényi kivonat törzsoldatokat készítettünk etanol/víz (20 térfogat%/térfogat) elegyben, hogy az IC50-érték kiszámításához különböző végkoncentrációk legyenek (5, 10, 30, 50 és 100 pg/ml a vizsgálatban). A kivonat különböző koncentrációihoz DPPH-metanol-oldatot adunk, és hagyjuk szobahőmérsékleten reagálni. A vizsgálatot 2,0 ml végtérfogatban hajtottuk végre. 20 perc elteltével az abszorbancia (Abs) értékeket 517 nm-en mértük, és az alábbi képlettel alakítottuk át az antioxidáns aktivitás százalékára:

Csak DPPH oldatot és metanolt használtunk negatív kontrollként, különböző koncentrációjú (5-50 µM) Trolox-ot (Tr) használtunk pozitív kontrollként, és Tr-t használtunk az összes antioxidáns kapacitás (TAC) kiszámításához, mmol-ban kifejezve. Tr ekv./G kivonat.

Az ABTS vizsgálatot Arnao és mtsai. (2001), néhány módosítással. Az ABTS • + gyököt úgy állítottuk elő, hogy egy 2,0 mM ABTS oldatot összekevertünk 7,0 mM K2S2O8-mal és sötétben inkubáltuk 24 órán át szobahőmérsékleten. Használat előtt az ABTS • + oldatot hígítottuk (1–25 ml metanol), így 7,3 nm-nél 0,7 abszolút értéket kaptunk. 0,9 ml hígított ABTS • + oldatot adunk 10 µl Tr (pozitív kontroll) vagy extraktum törzsoldatokhoz, hogy a végső koncentrációja 5, 10, 15, 20, 50 és 100 µg/ml legyen. Az 734 nm-en mért Abs értékeket 1,0 perc múlva regisztráltuk. Az IC50 értékeket mind ABTS-ben, mind DPPH-ban kiszámítottuk a diagramok lineáris regressziójával, ahol x-tengely a minta vagy a Tr koncentrációját jelöli, és y-tengely a három párhuzamos mintával végzett független kísérletből származó szennyeződés átlagos százalékos arányát mutatja.

FRAP-ferrozin assay

A kolorimetriás módszert alkalmaztuk annak meghatározására, hogy az extraktum mennyiben képes redukálni a vas (III) ionjait (Fe 3+) a vas (III) ionokban (Fe 2+), amelyet Beker és munkatársai által javasolt módszer szerint állítottak elő. (2010) néhány módosítással.

Kalibrációs görbét készítettünk a Fe 2+/ferrozin (FZ) komplex számára, növekvő FeCl2 (0-100 µM) és 0,5 mM FZ (desztillált víz) koncentrációk felhasználásával 1 ml végtérfogatban. 200 µl FeCl3-ot (1 mM) és FZ-t (5 mM) tartalmazó, korábban elkészített elegyet hozzáadunk 100 µl Tr-hez (a koncentrációk 6,0-300 µM-ig terjednek) vagy az extraktumhoz (a koncentrációk 10-50 µg/ml-ig terjednek). Az Abs-t a mikrolemez-olvasóban 570 nm-en olvastuk le, 5 percig szobahőmérsékleten végzett inkubálás után. A FeCl3/FZ keverék Abs-jét levontuk a Tr-vel vagy mintákkal kapott értékből. A Tr dózis-válasz görbéjének összeállításához a kalibrációs görbéből kiszámolták az antioxidáns különböző koncentrációi által termelt Fe 2+ mennyiséget.

A dózis-válasz görbe alapján kiszámítottuk az FRAP egységet, amely a 100 µM Fe 2+ előállítására képes minta mennyiségét képviseli. A TAC (mmol Tr/g extraktum) értékét kiszámítottuk, összehasonlítva az extraktumból kapott eredményt a Tr. A vizsgálatot két példányban hajtottuk végre, és háromszor megismételtük.

α-glükozidáz gátló vizsgálat

a-glükozidáz Saccharomyces cerevisiae (E.C. 3.2.1.20) a Sigma Aldrich Co-tól (St. Louis, MO) szereztük be, és az a-glükozidáz gátlási vizsgálatot Li és mtsai. (2005) kis módosításokkal. 3 mU enzim (egy egységből 1,0 µmol d-glükóz szabadul fel o-0,1 M foszfátpufferben (pH = 6,8) előállított nitrofenil-α-d-glükopiranozidot percenként (pH 6,8, 37 ° C-on) 10 percig inkubáltunk különböző koncentrációjú vizsgálati mintákkal: 5-100 µg/ml vagy tiszta standard vegyületek (luteolin), klorogénsav) 0,01-1,5 mM, 100 µL végtérfogatig. A szintetikus szubsztrát o-Pufferben előállított nitrofenil-a-d-glükopiranozidot (p-NPG) adunk az előinkubált keverékhez 2 mM végkoncentrációban, hogy a reakciót 200 ul végtérfogattal kezdjük. 5 perc múlva (t(5), 50 ul 0,1 M NaOH-ot adunk hozzá, és az abszorbanciát 405 nm-nél rögzítjük a mikrolemez-olvasóban állandó, 30 ° C-os hőmérsékleten. A minták kezdeti abszorbanciája tA 0-t üres (az enzimet kivéve az összes reagenst tartalmazó) vakanyagukon keresztül állapítottuk meg. Az említett enzim specifikus aktivitása o-Az NPG 14 U/mg volt a vásárló jelentése szerint.

Az IC50 értéket (az 50% -os gátláshoz szükséges koncentrációt) kiszámítottuk egy logaritmikus görbe elkészítésével, amely a mintakoncentrációkat mutatja x-tengelyek és a százalékos gátlás y-tengelyeket. Az enzimaktivitás gátlásának százalékát a következő képlettel számítottuk:

Negatív kontrollt kaptunk víz hozzáadásával minták helyett, és az ΔAbs értékeket Abs-ként számítottuk ki t10 - Absz t0 és 1 percre vonatkozik.

A Lineweaver – Burk (L – B) görbét a kinetikai paraméterek kiszámításához (Km mM-ben kifejezve vmax. nkat-ban) az enzimreakció mintákkal és anélkül IC50 koncentrációk mellett. Különböző o-Az NPG-koncentrációkat 2–0,25 mM tartományban használtuk; az µkat-ban kifejezett enzimatikus reakció sebességét ΔAbs min-ből számítottuk, figyelembe véve a p-nitrofenolátot 405 nm = 18,5 mM -1 cm -1 és a fényút hossza = 0,8 cm.