Az USA-ból származó fertőző laryngotracheitis vírus izolátumok jellemzése polimeráz láncreakcióval és több genom régió restrikciós fragmens hosszúságú polimorfizmusával

Eredeti cikkek

Teljes cikk
Ábrák és adatok
Hivatkozások
Idézetek
Metrikák
Újranyomtatások és engedélyek
PDF

Absztrakt

Caractérisation de souches du virus de la laryngotrachéite Infectieuse Aviaire (VLTI) isolées aux USA par la réaction de polymérisation en chaîne és le polymorphisme de taille des fragments de restriktion (PCR-RFLP) de régions génomiques multiplices

Characterisierung von Isolaten des infektiösen Laryngotracheitisvirus (ILTV) aus den Vereinigten Staaten ujjatlan Polymerasekettenreaktion und Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (PCR-RFLP) mehrerer Genomregionen

Caracterización de aislamientos de virus de laringotraqueítis infecciosa (ILTV) de Estados Unidos mediante reacción en cadena de la polimerasa y polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP) de genoma múltiples regions.

Bevezetés

Anyag és módszerek

Törzsek, izolátumok és vírusszaporítás

Hét ILTV vakcina törzset használtak ebben a vizsgálatban: hat vezérigazgató vakcinát - Biotrach (Intervert Inc., Millsboro, Delaware, USA), Broilertrake-M (American Scientific Laboratories, Inc., Millsboro, Delaware, USA), BioTrach (TrioBio Laboratories, State College, Pennsylvania, USA), Trachivax (Schering-Plough Animal Health, Kenilworth, New Jersey, USA), Laryngo-Vac (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa, USA) és Fowl Laryngotracheitis vakcina (Lohmann, Animal Health, Winslow, Maine, USA) - és a TCO vakcina LT-IVAX (Schering-Plough Animal Health). Ebben a vizsgálatban összesen 25 mezei izolátumot elemeztünk 1988 és 2005 között, kilenc állapotból; 22 izolátumot nyertek kereskedelmi baromfiból, három izolátumot pedig a háztáji állományokból (1. táblázat). A 22 kereskedelmi baromfi izolátum közül 19-et brojlerből, hármat pedig brojlertenyésztő állományból nyertek ki. Az izolátumokat a minta számával azonosítottuk, majd egy betű (minden betű más származási állapotot jelöl, A-tól I-ig), az elkülönítés éve és az a madár típus, amelyből az izolátumot gyűjtötték.

Online közzététel:

1. táblázat: PCR-RFLP-hez használt fertőző laryngotracheitis vírus izolátumok

Az összes vírust elkülönítettük a madarak felső légúti traktusából, és az előbb leírtak szerint szaporítottuk (Garcia & Riblet, 2001). Röviden, az ILTV izolátumokat szaporítottuk a 9–11 napos specifikus kórokozótól mentes, csirke embrionált peték chorioallantoicus membránjában (CAM). Az embriókat 5 napig inkubáltuk 37 ° C-on, és naponta ellenőriztük. Inkubálás után a CAM-okat megvizsgáltuk az ILTV replikációjára jellemző plakkok jelenlétére. Az izolált plakkokat 100 µl foszfáttal pufferolt sóoldatba daráltuk, és háromszor lefagyasztottuk/felolvasztottuk. A DNS-extrakcióhoz egyetlen plakkokat alkalmaztunk, és vírusállományként -80 ° C-on tartottuk őket. Az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériumának (USDA) ILTV referencia törzsét (ATCC # N-71851) szaporítottuk az előbb leírtak szerint előállított csirke embrió vese (CEK) sejtekben (Tripathy, 1998), és a fertőzött tenyészetet -80 ° C-on tartottuk a DNS számára. kitermelés. A kísérletileg beoltott madarak vírusizolációját felnőtt madarak csirkevese sejtjeiben hajtották végre (Hughes & Jones, 1988).

Oltási kísérletek

Vírusos DNS kivonása

A szántóföldi izolátumokból származó DNS-t az egyedi CAM-plakkokból, míg a kereskedelmi oltásokból származó DNS-t közvetlenül vakcinakészítményekből vagy fertőzött csirkeembrió vese felülúszókból - a QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, Kalifornia, USA) felhasználásával - a gyártó közleménye szerint. ajánlások. A DNS-t 50 µl elúciós pufferben hígítottuk és -20 ° C-on tároltuk.

Alapozók és PCR

Az ebben a vizsgálatban felhasznált primerek egy részét a korábban publikált munkák közül választották ki, más részeket pedig az ILTV genomszekvenciával (GenBank hozzáférési szám U28832) terveztek Primer Select szoftverrel (DNASTAR, Madison, Wisconsin, USA) (2. táblázat). Az összes amplifikációt nagy pontosságú Platinum alkalmazásával hajtottuk végre Taq DNS-polimeráz (Invitrogen). Mindegyik amplifikációs reakciót 50 µl térfogatban hajtottuk végre, amely 200 µM dNTP-ket, 2 mM MgS04-et, 250 µM minden primert, 1 U Taq polimerázt, 5 µl puffert és 5 µl templát DNS-t tartalmazott. Valamennyi amplifikációs reakció során egy kezdeti denaturálási lépést alkalmaztunk 94 ° C-on 1 percig, majd 35 percig tartó 94 ° C-os amplifikációs ciklust folytattunk 1 percig, 54 és 60 ° C közötti hőkezelési hőmérséklet mellett (2. táblázat) 30 másodpercig (gM/UL9), 45 mp (ORF B-TK, ICP4, TK és gD/gI/gE) vagy 1 perc (UL47gG és UL0/UL-1). A meghosszabbítást 68 ° C-on hajtottuk végre, az hosszabbítási időknek megfelelően, az amplifikált célrégió méretének megfelelően (UL0/UL-1, TK és UL47/gG 3 percig; gM/UL9 2 percig; ICP4, gD/gI/gE és ORF B-TK 7 percig), és végső meghosszabbítás 68 ° C-on 7 percig (UL0/UL-1, TK, UL47/gG és gM/UL9) vagy 10 percig (ICP4, gD/gI/gE és ORF B-TK). A PCR-termékeket elektroforézissel elválasztottuk 1% agarózgélben, etidium-bromiddal festettük és ultraibolya fénynek tettük ki őket a megjelenítés érdekében.

Online közzététel:

2. táblázat: A PCR-RFLP elemzésben használt primerek és genom régiók

RFLP elemzés

Eredmények

A genom régiók és a restrikciós endonukleázok kiválasztása

A kezdeti hét genom régió és 36 vizsgált RE közül négy genom régiót és 10 RE-t választottunk ki, hogy képesek legyenek megkülönböztetni a reprezentatív amerikai ILTV törzseket és izolátumokat. A kiválasztott genom régiók a következők voltak: ORFB-TK emésztve RE-vel BstF5ÉN; Az ICP4 emésztése RE-kkel történt HaeIII HinP1Én (Chang et al., 1997), Alwén és AvaÉN; UL47/gG emésztése RE-vel Mspén, AflII, NlaIV, Fspén és HaeIII; és a gM/UL9 régiót emésztjük RE-vel Meteorológiai figyelő hivatalI. Az UL0/UL-1, gD/E/I és TK genom régiók nem mutattak RFLP mintázatbeli különbségeket a tesztelt RE-k egyikével sem (az adatokat nem mutatjuk be).

ORFB-TK, gM/UL9, ICP4 és UL47/Gg PCR-amplifikációja

Az USDA törzshez kapott ICP4 amplifikációs termékek és a TCO vakcina kivételével minden amplifikációs reakció a várt PCR termékméretet eredményezte (2. táblázat). Az USDA törzs és a TCO vakcina két ICP4 amplifikációs terméket termelt, az egyik a várt méretet (4980 bázispár [bp]) és egy nagyobb, körülbelül 5800 bp méretű fragmentumot (az adatokat nem mutatjuk be). Két amplifikációs termék jelenléte tükrözheti az USDA és a TCO törzsek genomjában jelenlévő két ICP4 gén kópia közötti méretbeli különbségeket. Mindkét ICP4 PCR termék további szekvenciaelemzése igazolja vagy cáfolja ezt a sejtést.

RFLP minták az ICP4 régióhoz

Online közzététel:

1.ábra. Az ICP4 genom régió enzimmel történő restrikciós endonukleáz emésztésével előállított DNS-fragmensek poliakrilamid gél elektroforézise HaeIII (1a), HinP1I (1b), AlwI (1c) és AvaI (1d). A betűk az USDA referencia törzséhez képest eltérő mintázatot jeleznek. A további sávokat nyilakkal, a hiányzó sávokat csillagok jelzik, összehasonlítva a referencia törzzsel. Az emésztett TCO-szerű törzsek ICP4-től B0 és B minták várhatók HaeIII, az 500 bázispár méretű fragmenst előállító hely stabilitásának hiánya miatt.

Online közzététel:

3. táblázat: Különböző ILTV izolátumokból és törzsekből kiválasztott régiók PCR-RFLP-jével generált minták összehasonlítása

RFLP minták az ORFB-TK és a gM/UL9 régiókhoz

Az ORFB-TK régió RE emésztése a BstUI enzim azonos mintákat produkált az összes vizsgált amerikai ILTV törzs és izolátum esetében (az adatokat nem mutatjuk be); emésztés azonban a BstF51 enzim két különböző mintázatot produkált (2a. ábra és 3. táblázat). Az A minta körülbelül 2422, 931, 513, 352, 232, 156 és 65 bp méretű fragmenseket tartalmazott. Ez a mintázat jellemző volt az USDA törzsre, a vakcina törzsekre (TCO és vezérigazgató) és az összes kereskedelmi célú baromfi izolátumra. A B mintából hiányzik a 930 bp-os töredék, és 400 bp-os töredéke van. A B minta a háztáji állomány három izolátumára volt jellemző. GM/UL9 régió RE emésztése a Meteorológiai figyelő hivatalAz enzim három különböző mintát generált (2b. Ábra és 3. táblázat). Az A minta kb. 429, 312, 180, 107, 97, 86, 71, 61 és 48 bp méretű fragmensekből állt. Ez a minta jellemző volt az USDA törzsre, a TCO vakcinára, 11 kereskedelmi baromfi izolátumra és három háztáji nyáj izolátumra. A B mintából hiányzik a 71 és 61 bp töredék, 130 bp fragmentum van. Ez a minta a vezérigazgató vakcinákra és hat kereskedelmi baromfi izolátumra volt jellemző. A C mintából hiányzik a 86 bp-os töredék, és 55 bp-os töredéke van. A C minta öt kereskedelmi baromfi izolátumra jellemző.

Online közzététel:

2. ábra. Restrikciós endonukleáz emésztéssel előállított DNS-fragmensek poliakrilamid-gél elektroforézise. 2a: ORF B-TK BstF5I enzimmel emésztve; 2b: gM/UL9 MwoI enzimmel emésztve; 2c: UL47/gG emésztve AflII enzimmel; 2d .: UL47/gG emésztve NlaIV enzimmel; 2e: UL47/gG emésztve FspI enzimmel; 2f: UL47/gG emésztve HaeIII enzimmel; 2g: MspI enzimmel emésztett UL47/gG. A betűk az USDA referencia törzséhez képest eltérő mintázatot jeleznek. A további sávokat nyilakkal, a hiányzó sávokat csillagok jelzik, összehasonlítva a referencia törzzsel.

2. ábra. Restrikciós endonukleáz emésztéssel előállított DNS-fragmensek poliakrilamid-gél elektroforézise. 2a: BstF5I enzimmel emésztett ORF B-TK; 2b: gM/UL9 MwoI enzimmel emésztve; 2c: UL47/gG emésztve AflII enzimmel; 2d .: UL47/gG emésztve NlaIV enzimmel; 2e: UL47/gG emésztve FspI enzimmel; 2f: Ull47/gG emésztve HaeIII enzimmel; 2g: MspI enzimmel emésztett UL47/gG. A betűk az USDA referencia törzséhez képest eltérő mintázatot jeleznek. A további sávokat nyilakkal, a hiányzó sávokat csillagok jelzik, összehasonlítva a referencia törzzsel.

RFLP minták az UL47/gG régióhoz

A PCR-RFLP stabilitása

A PCR-RFLP minták stabilitását értékeltük öt vezérigazgatói és hat TCO vírus után, amelyek a madarakból nyertek ki 10 nappal az oltás után. A kísérleti úton beoltott madarakból kinyert öt vezérigazgató-oltóvírusra kapott PCR-RFLP minták megegyeztek a közvetlenül a vakcina fiolából kivont DNS-ből származó mintákkal (az adatokat nem mutatjuk be). A TCO vakcina esetében a kísérletileg beoltott madarakból kinyert hat vírusból előállított 11 PCR-RFLP mintából 10 azonos volt a TCO vakcinakészítményhez előállított mintákkal. Ugyanakkor az ICP4 régió PCR-RFLP mintázata emésztett a HaeA TCO vakcina előállításához használt III enzim további 500 bázispár méretű fragmenst mutatott (1a. Ábra, B 0 minta). Ezt az 500 bp méretű fragmentumot nem találták a madarakból kinyert vírusokban a TCO vakcinával végzett vakcinázást követő 10 nappal. Ez az ICP4 /HaeA III mintát B-vel jelöltük (1a. Ábra).

Többszörös PCR-RFLP elemzés

A kombinált RFLP minták elemzése összesen kilenc csoportot eredményezett (3. táblázat). Az USDA törzs és a TCO vakcina csak egy mintázatban különbözött egymástól, és az I. és II. Csoportba sorolták. Két ILTV izolátum kereskedelmi tenyésztőkből 10 azonos PCR-RFLP mintázattal rendelkezik, mint a kereskedelmi TCO vakcina RFLP minták, és a III. Csoportba sorolták. A kereskedelmi baromfi hat ILTV-izolátumának PCR-RFLP mintázata megegyezett a kereskedelmi vezérigazgató vakcináival, öt mintázatban különbözött az USDA törzstől és négy mintázatban a TCO vakcinától, és a IV. Csoportba sorolták. Kilenc ILTV izolátum 10 mintával megegyezett a vezérigazgató vakcináival. Ezek az izolátumok csak egy mintázatban különböztek a vezérigazgatótól, és ezt a mintát az USDA törzzsel és a TCO vakcinával osztották meg, és V. csoportként azonosították őket. A kereskedelmi baromfi öt izolátumának két mintája volt az USDA törzsével és a TCO vakcinával, öt mintázat a vezérigazgatói oltásokkal négy minta, az egyik háztáji nyáj izolátummal, és három egyedi minta volt; ezeket az izolátumokat a VI. csoportba sorolták. A háztáji állomány-izolátumok legalább hét mintázatban különböztek az USDA törzstől és a vakcinatörzsektől (vezérigazgató és TCO) képest, és külön-külön a VII, VIII és IX csoportokba sorolták őket.

ILTV PCR-RFLP csoportok klaszteranalízise

Az RFLP minták kombinálásával létrehozott kilenc csoportot három fő klaszterben különítettük el, klaszter és bootstrapping elemzéssel meghatározva (3. ábra). Az első klaszter az I. csoportból (USDA referencia törzs), a II. Csoportból (TCO vakcina) és a III. Csoportból állt (két kereskedelmi baromfi izolátum). A második klaszter a szorosan kapcsolódó IV. Csoportból (vezérigazgatói oltások és kereskedelmi baromfi-izolátumok) és az V. csoportból (kereskedelmi baromfi-izolátumok) állt. A harmadik klaszter a kereskedelmi baromfi VI. Csoportjából, a háztáji állományból pedig a VII., VIII. És IX. Csoportból állt. Csizmadia-elemzés kimutatta, hogy a kereskedelmi baromfiból származó VI csoport izolátumok szorosabban kapcsolódnak a háztáji állományok VII, VIII és IX csoportjához, mint más kereskedelmi baromfi izolátumokhoz és vakcinatörzsekhez.

Online közzététel:

3. ábra. Dendogram az ILTV izolátumok és törzsek kilenc csoportjának PCR-RFLP minta kombinációjának klaszteranalízisén alapul. A hasonlósági együtthatókat Nei & Li (1978) módszerével számoltuk. Az elágazáshosszak a csoportok közötti genetikai távolságot képviselik, az ágakon lévő számok pedig a bootstrap értékek, a belső csomópontok százalékában (500 újramintavétel). I. csoport, USDA vakcina törzs; II. Csoport, TCO vakcina törzs; III. Csoport, két kereskedelmi baromfi-izolátum; IV. Csoport, vezérigazgató vakcinatörzsek és hat kereskedelmi baromfi izolátum; V. csoport: kilenc kereskedelmi baromfi-izolátum; VI. Csoport: öt kereskedelmi baromfi-izolátum; A VII., VIII. És IX. Csoport, három háztáji állományi izolátum.

3. ábra. Dendogram az ILTV izolátumok és törzsek kilenc csoportjának PCR-RFLP mintázat kombinációjának klaszteranalízisén alapul. A hasonlósági együtthatókat Nei & Li (1978) módszerével számoltuk. Az elágazáshosszak a csoportok közötti genetikai távolságot képviselik, az ágakon lévő számok pedig a bootstrap értékek, a belső csomópontok százalékában (500 újramintavétel). I. csoport, USDA vakcina törzs; II. Csoport, TCO vakcina törzs; III. Csoport, két kereskedelmi baromfi-izolátum; IV. Csoport, vezérigazgató vakcinatörzsek és hat kereskedelmi baromfi izolátum; V. csoport: kilenc kereskedelmi baromfi-izolátum; VI. Csoport: öt kereskedelmi baromfi-izolátum; A VII., VIII. És IX. Csoport, három háztáji állomány-izolátum.

Vita

Ez a tanulmány bemutatja az ILTV izolátumok genetikai jellemzését az 1988 és 2005 között, a sűrű baromfitermelés különböző régióiból az Egyesült Államokban. Huszonkét izolátumot gyűjtöttek kereskedelmi baromfiból, három izolátumot pedig a háztáji állományokból. A négy genom régió 10 RE-vel történő emésztésével előállított 11 PCR-RFLP mintakombináció az amerikai izolátumokat kilenc csoportba sorolta (3. táblázat). A kereskedelmi baromfiból származó ILTV izolátumokat négy csoportba (III, IV, V és VI), a háztáji állomány izolátumokat pedig három külön csoportba (VII, VIII és IX csoportba) sorolták. A 11 PCR-RFLP mintázat stabilitását a vakcinatörzseknél csirkékben végzett replikáció után teszteltük. Kimutatták, hogy egy vezérigazgató vakcina PCR-RFLP mintái stabilak a vakcinatörzs csirkékben történő replikálása után. A TCO vakcina esetében a 11 mintázat közül 10 stabilnak bizonyult a vakcinatörzs csirkékben történő replikálása után. Az ICP4 /HaeA TCO vakcina III emésztési mintázatát (B 0 minta, 1a. Ábra) egy további 500 bp-os fragmens jellemezte, amelyet a csirkékben replikált TCO vakcina törzs után nem észleltek (B mintázat, 1a. Ábra), jelezve, hogy ez a hely nem stabil és nem tekinthető markernek a TCO-val kapcsolatos törzsek azonosítására.

Az UL47/gG régió PCR-RFLP elemzése enzimekkel AflII, Fspén és NlaA IV különböző eltéréseket eredményezett a kereskedelmi baromfi-izolátumok (VI. Csoport) és a háztáji állomány-izolátumok (VII., VIII. És IX. Csoport) között. Az ILTV gG deléciós mutánsának felépítése bizonyítékot szolgáltatott arra, hogy a gG hozzájárulhat a vírus virulenciájához (Devlin et al., 2006). Ezért a gG gén SNP-i az amerikai izolátumok között relevánssá válnak, mivel befolyásolhatják a vírus virulenciáját. Genetikai sokféleséget detektáltak a gM/UL9 régióban is, ahol a gM-ben az SNP felismerte az SNP-t Meteorológiai figyelő hivatalEnzimmel választottam el a kereskedelmi baromfi izolátumokat (V. csoport) a vezérigazgató vakcináktól.

Noha az ebben a vizsgálatban generált PCR-RFLP kategóriák módosíthatók, amikor intenzívebb szekvenálási elemzést végeznek ezeknél az izolátumoknál, ez a jelentés azonosítja az amerikai ILTV izolátumok genetikai sokféleségének genomrégióit, bemutatja az izolátumok különféle csoportjának első átfogó genotípus-jellemzését. az Egyesült Államokban, és keretet biztosít a további szekvenálás elemzéséhez. A szekvenálás elemzése mellett a jövőbeni munka magában foglalja a jelen vizsgálatban azonosított különböző PCR-RFLP csoportok reprezentatív izolátumainak patotípus-vizsgálatát.