Új stratégia a fejlett ateroszklerózis és az alacsonyabb vércukorszint megelőzésére a metabolikus szindróma egérmodelljében

Absztrakt

Bevezetés

A metabolikus szindróma és a 2-es típusú cukorbetegség (T2DM) fokozott szív- és érrendszeri betegségek (CVD) kockázatával jár. Becslések szerint az amerikai lakosság körülbelül egyharmadának metabolikus szindróma vagy prediabétese van, ami viszont növeli a T2DM kialakulásának kockázatát. Ezeket az állapotokat gyakran centrális elhízás, megnövekedett éhomi vércukor- és inzulinrezisztencia, megemelkedett vérnyomás és diszlipidémia jellemzi, amelyek mindegyike közvetlen vagy közvetett szerepet játszik a CVD súlyosbodásában. A hagyományos rizikófaktorok mellett a leukocytosis/monocytosis társul a CVD-vel (1,2). Nemrégiben bebizonyítottuk, hogy az elhízás és az inzulinrezisztencia myelopoiesist okoz (3).

A T2DM-re és a metabolikus szindrómára az inzulin-célszövetekben az inzulinérzékenység zavara, a T2DM esetében pedig a szigeti β-sejtek képtelenek kompenzálni a csökkent inzulinérzékenységet (4). Az inzulinkezelésre gyakran szükség van a glikémiás kontroll javításához. Az inzulinreceptor (IR) szignálozásnak nemcsak az inzulin célszöveteire, például a májra, a zsírszövetre és a vázizomra van mélyreható hatása, szabályozva a vércukorszintet és a plazma lipideket, hanem az érelmeszesedésben közvetlenül érintett sejtekre is. Egérmodellekkel végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy az IR-k elvesztése több mechanizmus és több sejttípus révén megváltoztathatja az érelmeszesedést. Így a máj IR-k elvesztése dyslipidaemia révén fokozott ateroszklerózist eredményez (5), míg a máj IR alacsony szintje és az IR-expresszió elvesztése az összes többi szövetben ellentétes hatást fejt ki (6). Az IR hiánya az endothel sejtekben (7) súlyosbítja az érelmeszesedést, míg az IR hiánya a mieloid sejtekben a modelltől függően különböző hatásokkal jár (8,9).

Az IR-ek pro- és antiaterogén hatásainak eltérései a különböző szövetekben azzal magyarázhatók, hogy az IR az aktiválás után külön jelzési utakat indukál. Az IR két fő jelzési utat aktivál: az Akt tengelyt és az Erk tengelyt. Bár kimutatták, hogy az Akt irányában a jelátviteli események funkcionális bifurkációja szabályozza a máj lipogenezist a glükoneogenezissel szemben (10), az IR által indukált Akt és Erk útvonalak relatív szerepe az érelmeszesedésben nem ismert.

Ennek a kérdésnek a megválaszolásához egy szelektív IR agonistát használtunk ki, inzulinnal való strukturális homológia nélkül, S597 néven (Ac-SLEEEWAQIECEVYGRGCPSESFYDWFERQL-amid). Az IR dimereként van jelen a sejteken. Minden receptormonomer egy ligandumkötő alegységből (az a-alegység), egy transzmembrán doménből és egy tirozin-kináz aktivitású intracelluláris β-alegységből áll (11). Kísérleti adatokat használtak kifinomult modellek előállításához, hogy megmagyarázzák az inzulin kölcsönhatásának mechanizmusát a receptorával. Ezek a modellek két különböző helyet írnak le minden IR a-alegységen (12,13). Az inzulin úgy aktiválja az IR-t, hogy kötődik az egyik a-alegység egyik helyéhez, és a másik a-alegység másik helyéhez. A peptidszűrési stratégiák kimutatták, hogy az egyik vagy másik helyhez specifikusan kötődő peptidszekvenciákból álló heterodimerek eltérő biológiai tulajdonságokkal rendelkeznek, a peptidkötés sorrendjétől függően (13). Ezen azonosított inzulin-utánzó peptidek egyike (13) az S597. Az S597 IR-kötési mechanizmusa hatékonyan kapcsolja össze az IR-Akt jelátvitelt, de kevésbé hatékony az IR-Erk tengely aktiválásában az emberi IR-vel stabilan transzfektált sejtvonalakban (14, 15).

Ezzel a peptiddel bebizonyítottuk, hogy az IR-Akt tengely szelektív aktiválása, amely az IR-Erk útvonalat nagyrészt inaktívvá teszi, csökkenti a vércukorszintet és véd az előrehaladott érelmeszesedés ellen a metabolikus szindróma LDL receptorhiányos (Ldlr -/-) egér modelljében.

Kutatási tervezés és módszerek

Állatok és kezelések

A 4 hétig injektált egereket 7,5 vagy 15 perccel eutanizálták az utolsó injekció után az Akt (p-Akt) és Erk (p-Erk) foszforilezésének értékelésére a májban, a vázizomban (quadriceps), az epididymális zsírszövetben, az aortában és a vér leukocitáiban. Alpha SureFire ELISA-kat (PerkinElmer, Waltham, MA) használva. Az S597-gyel kezelt csoportból további egereket injektáltunk először S597-el, majd 7,5 perc múlva inzulint és 7,5 perc múlva eutanizáltuk. A 18 hetes vizsgálat során az S597 és az inzulin adagját hetente módosították a testtömeg alapján, és az inzulin és az S597 vércukorszint-csökkentő hatását 4 hetente értékelték. A vizsgálat megkezdése előtt meghatározták a kizárási kritériumokat: kizárták azokat a DDC-vel táplált egereket, amelyek kevesebb súlyt híztak, mint a 18 hetes vizsgálat során a chow-vel táplált egerek átlagos súlygyarapodása (115%). Ezeket a kritériumokat alkalmazták öt egér kizárására a vizsgálatból (kettő az inzulincsoportban, kettő az S597 csoportban és egy a hordozóanyag-csoportban). Az egerek harmadik kohorszában a Ly6C hi monocitákat jelöltük, és 10 napos vivőanyag, inzulin vagy S597 injekció után megállapított ateroszklerotikus elváltozásokra bukkantuk.

Áramlási citometria

Az áramlási citometriához használt antitesteket a Kiegészítő adatreagensek táblázatok ismertetik. Közvetlenül a CD16/CD32 blokk után antitestek kombinációját (FITC-CD45, PE-CD115, PE-Cy7-GR1, APC-B220, APC-CD3e és PerCy5.5-CD11B) adtuk a vér leukocitáihoz és inkubáltuk. 30 perc jégen. A sejteket ezután kétszer mostuk és 1% semleges pufferolt paraformaldehidben rögzítettük 15 percig. A sejteket BD FACSCanto RUO-n (BD Biosciences, San Jose, CA) analizáltuk. A monocitákat CD45 + B220 - CD3e - CD115 + sejtként azonosítottuk. A GR1 hi és GR1 lo sejtek azonosították a két Ly6C hi és Ly6C lo monocita populációt (Kiegészítő 1A. És B. Ábra). A neutrofileket CD115 - GR1 + B220 - CD3e - sejtként azonosítottuk. A csontvelő progenitor sejtek populációit a korábban leírtak szerint elemeztük (18). A sürgősségi granulocita-makrofág progenitorokat (eGMP) Lineage - CD117 + Sca-1 + CD16/32 hi CD34 + sejtként azonosítottuk (Kiegészítő 1C. Ábra). Egyes kísérletek során az LSK (Lineage - CD117 + Sca-1 +) sejteket egy BD FACSAria-n rendeztük, majd 7,5 percig stimuláltuk vivőanyaggal, inzulinnal vagy S597-gyel. A sejteket intracelluláris p-Erk-re (Thr202/Tyr204) festettük és BD LSR II-vel elemeztük.

Monocita nyomkövetési vizsgálatok

Emberi vérképző őssejtek

Négy külön donor (PromoCell, Heidelberg, Németország) CD34 + progenitor sejtjeit 10-14 napig terjesztjük, majd vivőanyaggal, inzulinnal (100 nmol/l) vagy S597 (200 nmol/l) 7,5 percig stimuláljuk. A sejteket azonnal rögzítettük, permeabilizáltuk, festettük az intracelluláris p-Erk és a sejtfelszín CD34 és CD38 elemeit, és Canto RUO-n elemeztük. Az egyes donorok átlagát (n = 2–5 replikátum/donor) elemeztük.

Western Blots, ELISA és S597 kötő vizsgálatok

A Western blotokhoz használt antitesteket a Kiegészítő adatok ismertetik. Az összes Erk1/2 antitest nyúl poliklonális volt (20). A p-Akt1/2/3 ELISA-k a Cell Signaling cégtől származnak. Az endotelin 1 ELISA az Enzo Life Sciences-től (Farmingdale, NY) származott. A plazma szérum amiloid A szintjét a korábban leírtak szerint mértük (21). Az S597 ligandumok receptorokról és kötőhelyekről való kiszorításának képességét a Ricerca Biosciences, LLC (Tajpej, Tajvan) végezte. Az IR és IGF-I receptor szintek Western blot-analíziséhez minden egyes gélhez standard görbét készítettünk, ismert sejtek IR-t és IGF-I receptorokat expresszáló sejtvonalakat használva (22). A Hepa 1-6 sejteket (ATTC CRL-1830TM) az American Type Culture Collection-től (Manassas, VA) szereztük be.

Az ateroszklerózis elemzése

Az egereket 24 hét után eutanizáltuk, és finoman perfundáltuk PBS-sel, majd az aortát és a brachiocephalic artériát (BCA) boncoltuk. A BCA eltávolítása után az aortát RNAlaterrel (Life Technologies, Grand Island, NY) átöblítettük, majd RNAlaterbe helyeztük. Az aortákat hosszanti irányban kinyitottuk, és az ateroszklerózist álarcosan meghatároztuk az arcán. Az aorta lipideket és az RNS-t extraháltuk Akopian és Medh leírása szerint (23). Az aorta koleszterinszintjét és trigliceridjeit fluoreszcens és kolorimetriás vizsgálatokkal mértük (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, és Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). A BCA teljes hosszát sorozatosan metszettük, és 30 μm-enként két keresztmetszetet festettünk Movat pentakróm festéssel (24) a maximális elváltozás területének számszerűsítéséhez és az elváltozás morfológiai elemzéséhez. A maximális elváltozási hely mellett szomszédos BCA keresztmetszeteket antitestekkel és reagensekkel festettük, amelyeket a Kiegészítő adatreagens táblázatokban vagy a korábbi vizsgálatokban (24–26) írtak le. Valós idejű kvantitatív PCR-t a leírás szerint hajtottunk végre (26). Az alapozó szekvenciákat a Kiegészítő adatok alapozó táblázata sorolja fel.

Plazma- és vérelemzések

Az egér plazma inzulinszintjét ultraibolygó patkány ELISA (kat. Sz. 90600; Crystal Chem, Downers Grove, IL) alkalmazásával mértük, amely 100% keresztreaktivitást mutat az egér inzulinnal. Az interleukin (IL) 6, az MCP-1 és a tumor nekrózis faktor-a (TNF-a) plazmaszintjét Milliplex multiplex assay (EMD Millipore, Billerica, MA) alkalmazásával mértük. A vér és a plazma koleszterinszintjét, a plazma trigliceridek, a glükóz és a lipoprotein profilokat a korábban leírtak szerint elemeztük (21, 24). A plazma koleszterinszintjét és a glikohemoglobint a Wako (Richmond, VA) és a Fisher Scientific kolorimetriás kitjeivel mértük. Humán LDL-t izoláltunk és acetiláltunk a korábban leírt módszerekkel (27).

A sejtek in vitro stimulálása

Statisztikai analízis

Teljesítményszámításokkal határoztuk meg az állatok csoportonkénti számát. A nyomozókat elvakították a csoportok kiosztása miatt. A statisztikai elemzést kétfarkú, nem párosított Student t tesztekkel vagy egyirányú ANOVA-val, Tukey többszörös összehasonlító post hoc tesztekkel vagy kétutas ANOVA-val végeztük a normálisan elosztott adatokhoz. A nem paraméteres paraméterekhez Kruskal-Wallis vagy Dunn többszörös összehasonlító teszteket alkalmaztunk, adott esetben. A t teszttel elemzett csoportok hasonló szórással rendelkeztek. A chow-val vagy DDC-vel táplált -/- egerek valószínűségét naponta kétszer vivőanyag, inzulin (40 nmol/kg) vagy S597 (80 nmol/kg) injekcióval kezeltük 18 héten keresztül (1A. Ábra). Az érelmeszesedés mértékét az aortában és a BCA-ban értékelték, mely helyről ismert, hogy fejlett elváltozások alakulnak ki (31). A DDC-vel táplált egereknek több volt az aortájuk ateroszklerózisa, mint a chow-val táplált egereknek, az en face analízissel meghatározva (reprezentatív aortákat az 1B. Az inzulinkezelés nem változtatta meg az aorta érelmeszesedését. az S597 kezelt egereknél azonban jelentősen csökkent az érelmeszesedés mértéke, valamint az aorta koleszterin és koleszteril észter akkumulációja, az aorta trigliceridek közötti különbségek nélkül (1B – G ábra). A DDC-vel táplált egerek nagy előrehaladott BCA elváltozásokat is mutattak (1H – J. Ábra). Az aortához hasonlóan az S597 csökkentette a BCA elváltozás méretét a vivőanyaghoz és az inzulinhoz képest (1H és I ábra).

Ezzel szemben az inzulin és az S597 hasonló mértékben aktiválta az Akt foszforilációját a zsírszövetben és a vázizmokban, és az S597 a p-Akt-ot is stimulálta a májban, bár nem azonos mértékben. Fontos, hogy az S597 nem akadályozta meg az inzulin azon képességét, hogy aktiválja az Akt-ot (5E – G. Ábra). Az aortában sem az inzulin, sem az S597 nem stimulálta a p-Erkot (5H. Ábra). Az inzulin jelentősen stimulálta a p-Akt-ot, míg az S597 nem (51. ábra), összhangban az izolált endothelsejtekben és makrofágokban (2O és P ábra) talált eredményeinkkel, és az S597 az aortában még az inzulin p-Akt-ra gyakorolt hatását is gátolta. szövet. Az inzulin és az S597 nem befolyásolta a p-Erk-et vagy a p-Akt-ot az egyesített vér leukocitákban (5J és K ábra).

Az IR volt az egyetlen detektált receptor, amelyhez az S597 nagy affinitással kötődik a szkrínelt 163 receptorhoz és transzporterhez (1. kiegészítő táblázat). Így az S597 előnyösen aktiválja az IR-Akt jelző karját az Erk jelzés felett az inzulin célszövetekben, és ezen felül megakadályozza az inzulin által kiváltott Erk aktivációt.

Az S597 megakadályozza a leukocitózist és a metabolikus szindróma fenotípusához kapcsolódó Ly6C hi monociták szintjének emelkedését

Van összefüggés a megnövekedett leukocitózis/monocitózis és a CVD között emberekben és egerekben (1,36,37), az inzulinrezisztencia és az elhízás a fokozott zsírszöveti gyulladás révén elősegíti a leukocitózist (3,38–40). Következetesen a DDC-táplálás markáns leukocitózist váltott ki (6A – E. Ábra és kiegészítő 7A – C. Ábra). A DDC táplálás fő stimuláló hatását a Ly6C hi monociták esetében figyelték meg. Az S597 kezelés megakadályozta a DDC által kiváltott leukocitózist, míg az inzulinnak nem volt hatása. Érdekes módon az S597 által kiváltott redukció a legegyértelműbben a gyulladásos Ly6C hi monocita populációban volt megfigyelhető, amelyben az S597 normalizálta a szintet a chow-vel táplált egereknél (6C ábra).

Annak tesztelésére, hogy kevesebb keringő Ly6C hi monocita eredményez-e kevesebb monocyta felhalmozódását az elváltozásokban, szelektíven jelöltük az újonnan képződött Ly6C hi monocitákat mikroszféra gyöngyök felhasználásával, és aorta elváltozásokká követtük őket (6F és G ábra). Négy nappal a monocita kimerülése után a vér Ly6C hi monocita szintje normalizálódott, de alacsonyabb maradt az S597-tel kezelt egereknél. Ennek megfelelően az S597-vel kezelt egerek elváltozásai kevesebb toborzott gyöngyjelölt makrofágot mutattak (6H ábra).

Mivel az ateroszklerózissal összefüggő leukocytosis/monocytosis összefüggésbe hozható a csontvelő hematopoiesissel (2,37,41), a következőkben azt vizsgáltuk, hogy az S597 csökkentette-e a hematopoiesist. A csontvelő hosszú távú hematopoietikus őssejtjeinek száma alacsonyabb volt az S597-tel kezelt egereknél, mint az inzulinnal kezelt egereknél (6I. Ábra). Ezenkívül az S597-gyel kezelt egereknél alacsonyabb volt a gyulladás által kiváltott, nagy differenciálódási képességű granulocita-makrofág progenitor, az eGMP (18), összehasonlítva az inzulinnal kezelt egerekkel (Kiegészítő 7D. Ábra). Ezzel egyidejűleg az S597 csökkentette a p-Erk értéket az egér hematopoietikus őssejtekben (6J ábra és 7E kiegészítő ábra), és szerény szuppresszív hatást mutatott humán CD34 + hematopoietikus őssejtekben (7F. Kiegészítő ábra), ami arra utal, hogy az S597 hatása emberi vonatkozásúak legyenek.

Vita

Ez a tanulmány feltárja, hogy az S597 inzulinmimetikus peptid az IR-Akt differenciális aktiválódását okozza az IR-Erk felett, és ennek következtében gátolja az inzulin által kiváltott Erk aktiválódást, csökkenti a vércukorszintet és véd az előrehaladott ateroszklerózis kialakulásától a metabolikus egér modelljében. szindróma. Az S597 in vivo hatásairól szóló egyetlen korábbi vizsgálat során ozmotikus minipumpákat alkalmaztak az S597 folyamatos adagolására Zucker diabéteszes zsíros patkányoknak 7 napos időtartam alatt, hogy értékeljék annak hatását a vércukorszintre, a máj lipidanyagcseréjére, az adipozitásra és a plazma lipidjeire (34 ). Ez a tanulmány azt találta, hogy az S597 csökkentette a vércukorszintet és a plazma trigliceridszintet, súlygyarapodást okozott és csökkentette a zsírsavak máj újszerű szintézisét (34). A vizsgálattal összhangban megállapítottuk, hogy az S597 kezelés átmeneti hatást fejt ki a plazma trigliceridekre, és nincs hatással a plazma koleszterinszintjére. Az S597 testtömegre gyakorolt hatásának hiánya a jelenlegi vizsgálatban valószínűleg a napi kétszeri szubkután injekciók átmeneti hatásainak és valószínűleg a vizsgálat hosszabb időtartamának eredménye. Az ozmotikus mini-szivattyúk alkalmazása nem volt kivitelezhető a jelenlegi 18 hetes érelmeszesedési vizsgálatban. Ez az első tanulmány, amelyben értékelték az S597 érrendszerre gyakorolt hatásait.

Az S597 jótékony hatásainak egy része valószínűleg az Akt-aktivációnak köszönhető az inzulin célszöveteiben, például annak képessége, hogy utánozza az inzulin vércukorszint-csökkentő hatásait. Az S597 egyéb jótékony hatása valószínűleg annak eredménye, hogy képes megakadályozni az IR-Erk inzulin általi aktiválódását. Az a koncepció, miszerint az IR-Akt aktiváció antiaterogén hatásokat eredményez, míg az IR-Erk aktiváció proaterogén, összhangban áll King et al. (42) Így bemutatjuk, hogy az S597 megakadályozza az előrehaladott érelmeszesedést a metabolikus szindróma egérmodelljében, egyidejűleg ebben a modellben a Ly6C hi monocytosis elleni jelentős védelemmel. Egyrészt a Ly6C hi monociták olyan monociták, amelyeket a csontvelőből toboroznak a gyulladásos ingerekre reagálva, és ez a populáció könnyen belép az ateroszklerózis elváltozásaiba (19). A Ly6C lo monociták viszont járőröznek a szövetek helyreállításában részt vevő monocitákban (43).

Összefoglalva: az IR-Akt tengely szelektív aktiválása új koncepcionális keretet nyújt arra vonatkozóan, hogy az IR-irányú lefelé irányuló differenciális jelzés miként nyújthat új kezelési stratégiákat a metabolikus szindróma, a T2DM és a kapcsolódó CVD számára.

Cikk információk

Köszönetnyilvánítás. A szerzők köszönetet mondanak Ricky Rualónak és Shari Wangnak (Washingtoni Egyetem) és Marianne Schiødt-nak (Novo Nordisk A/S) a kísérletek elemzéséért. Köszönetet mondanak Dr. Lauge Schäffernek (Novo Nordisk A/S) az S597 gyártásáért.