Újszerű megközelítés az adenin által kiváltott krónikus vesebetegséggel összefüggő vérszegénységben rágcsálóknál

Szerepek Konceptualizálás, adatkezelés, hivatalos elemzés, vizsgálat, módszertan, írás - eredeti tervezet

Jelenlegi cím: Nemzetközi Egészségügyi és Jóléti Egyetem Orvostudományi Karának Farmakológiai Tanszék, Narita, Japán.

Kagawa Egyetem, Japán Kagawa Egyetem, Orvostudományi Kar, Farmakológiai Tanszék

Szerepek Adatmegőrzés, vizsgálat

Kagawa Egyetem, Japán Kagawa Egyetem, Orvostudományi Kar, Farmakológiai Tanszék

Szerepek Adatmegőrzés, vizsgálat

Kagawa Egyetem, Japán Kagawa Egyetem, Orvostudományi Kar, Farmakológiai Tanszék

Szerepek konceptualizálás, adatgondozás

Jelenlegi cím: Klinikai Farmakológiai Osztály, Vanderbilt University School of Medicine, Nashville, Tennessee, Amerikai Egyesült Államok.

Kagawa Egyetem, Japán Kagawa Egyetem, Orvostudományi Kar, Farmakológiai Tanszék

Szerepek Konceptualizálás, írás - áttekintés és szerkesztés

Kagawa Egyetem, Japán, Kagawa Egyetem, Orvostudományi Kar, Farmakológiai Tanszék

Szerepek Módszertan, írás - áttekintés és szerkesztés

Kagawa Egyetem, Japán Kagawa Egyetem, Orvostudományi Kar, Farmakológiai Tanszék

Szerepek konceptualizálás, finanszírozás megszerzése, módszertan, felügyelet, validálás, írás - áttekintés és szerkesztés

Kagawa Egyetem, Japán Kagawa Egyetem, Orvostudományi Kar, Farmakológiai Tanszék

Asadur Rahman,
Daisuke Yamazaki,
Abu Sufiun,
Kento Kitada,
Hirofumi Hitomi,
Daisuke Nakano,
Akira Nishiyama

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Rahman A, Yamazaki D, Sufiun A, Kitada K, Hitomi H, Nakano D és mtsai. (2018) Újszerű megközelítés az adenin által kiváltott krónikus vesebetegséghez kapcsolódó anaemia rágcsálókban. PLoS ONE 13 (2): e0192531. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192531

Szerkesztő: Hideharu Abe, Tokushima Egyetem Végzős Iskola, Japán

Fogadott: 2017. január 20 .; Elfogadott: 2018. január 25 .; Közzétett: 2018. február 7

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Ezt a munkát a Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) segélyek a tudományos kutatáshoz (KAKENHI) (26460343 Akira Nishiyama számára) és a Hoansha Alapítvány (Akira Nishiyama) támogatták. A finanszírozóknak azonban nem volt szerepük a tanulmány tervezésében, az adatgyűjtésben és -elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A vérszegénység a krónikus vesebetegségek (CKD) gyakori jellemzője, amely összefügg az életminőség csökkenésével és a megnövekedett szív- és érrendszeri betegségekkel (CVD), kórházi ápolással, kognitív károsodással és mortalitással [1]. Kimutatták azt is, hogy a vérszegénység független prediktora az ischaemiás kardiális eseményeknek [2]. Ezért a vérszegénység fontos szerepet játszik abban, hogy további komplexitási réteget adjon a CKD és a CVD kapcsolatához [3]. A vérszegénység kezelése rekombináns humán eritropoietin (rhEPO) vagy eritropoézist stimuláló szerek (ESA) révén nagy előnyökkel jár a CKD-ben szenvedő betegek számára azáltal, hogy javítja gyengítő tüneteiket és mentesíti őket a vérátömlesztéstől való függőségtől [4]. A vesebetegségben szenvedő betegek jelenlegi kezelési és terápiás megközelítése azonban ellentmondásos a megnövekedett morbiditás és mortalitás miatt [5–7]. Ezért kétségbeesett szükség van olyan tanulmányokra, amelyek meghatározzák a vese anaemia pontos mechanizmusát új terápiák vagy terápiás stratégiák kidolgozása érdekében.

Jelen vizsgálat célja egy új módszer létrehozása az adenin adagolására rágcsálókban a vese vérszegénységének stabil kiváltására. Az adenin hatásának változékonyságának elkerülése érdekében naponta megmértük az egerek testtömegét, és a kiszámított adeninmennyiséget orális szondával pontosan beadtuk. Kevés olyan jelentés készült, amely megvizsgálta volna az adenin orális szoptatásának hatását patkányokban; a vérszegénységről azonban nem áll rendelkezésre információ [21]. Ennek megfelelően egy korábbi jelentést is követtünk [21] a CKD kiváltására patkányokban, és megvizsgáltuk az ezt követő vérszegénységet.

Anyagok és metódusok

Állatok

Ebben a vizsgálatban az állatokat érintő összes kísérleti eljárást a japán Kagawa Egyetem etikai normáinak és a Helsinki Nyilatkozat (S1 File) elveinek megfelelően hajtották végre. A tanulmány protokollját a japán Kagawa Egyetem helyi intézményi bizottsága felülvizsgálta és jóváhagyta. Öt hetes C57BL/6 egereket és Wistar patkányokat vásároltunk a Japan SLC Inc.-től (Shizuoka, Japán). A hím rágcsálókat előnyben részesítették ebben a vizsgálatban, mert a nőstény rágcsálók rezisztensek a vesekárosodással szemben [22, 23], és kevésbé valószínű, hogy adeninnel kiváltott CKD-t fejlesztenek ki [24]. Az állatokat specifikus kórokozóktól mentes állattartó helyiségekben tartottuk ellenőrzött hőmérsékletű (24 ± 2 ° C) és páratartalmi (55 ± 5%) körülmények között, 12 órás világos-sötét ciklus mellett, standard chow-t kaptak és vízhez jutottak ad libitum.

Kábítószerek

Az adenint a Sigma-Aldrich, Inc.-től (Saint Louis, MO, USA) szereztük be. A karboxi-metil-cellulózt (CMC) a Wako Pure Chemical Industries Ltd.-től (Oszaka, Japán) vásárolták.

Kísérleti protokollok

Egy hetes akklimatizáció után a 6 hetes C57BL/6 egereket és a Wistar patkányokat három-három csoportra osztották (S1 ábra) a kreatinin és a hematokrit adatok kiindulási plazmaszintje alapján. A kontrollcsoportban mind az egereknek (0,2 ml/20 g testtömeg; n = 20), mind a patkányoknak (2 ml/200 g testtömeg, n = 20) 0,5% CMC-t adtunk szájon át történő szoptatással. Adenint adtunk egereknek 25 (n = 30) és 50 (n = 30) mg/testtömeg-kg 0,5% CMC-ben orális szondával (mivel az egerek nem szívesen fogyasztottak adenintartalmú chow-t) 28 napig. Továbbá patkányokban 200 (n = 30) és 600 (n = 30) mg/testtömeg-kg adenint adtak 0,5% CMC-ben orális szondával 10 napig. A megfigyelési periódus során minden egyes időpontban 5–6 állatot sevofluránnal eutanizáltunk precíziós párologtatóval a vesefunkcióval és az anaemiával kapcsolatos paraméterek mérésére, a fennmaradó állatokat pedig a megfigyelési időszak végén eutanizáltuk. Ezen túlmenően annak megerősítésére, hogy ez az adenin-indukálta vesekárosodás modell alkalmas a vese vérszegénységének vizsgálatára, az rhEPO-t (5 NE) kétnaponta, 35 napig subcutan injektálták egerekben, 28 napos 50 mg/kg adenin orális beadása után további 7 napos gyógyulás.

Minta kollekció

Vérmintákat gyűjtöttünk a farokvénából a hematológiai paraméterek mérésére egerekben és patkányokban egyaránt. Vérmintákat gyűjtöttünk az adenin beadásának befejezése után, valamint a megfigyelési időszak különböző időpontjaiban (S1 ábra).

Biokémiai és hematológiai paraméterek

A plazma kreatinint egy kereskedelemben kapható készlettel (LabAssay Creatinine, Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japán) mértük. A hematokrit méréséhez a vért hematokrit csövekbe vettük, majd a mikrohematocrit centrifugálást végeztük. Megmértük a vörösvértestekkel töltött oszlop hosszát, elosztva a teljes vér oszlopának hosszával és megszorozva 100% -kal. A plazma BUN és a hemoglobin (Hb) szintjét, valamint a vizelet összes fehérjéjét automatizált analizátorral (7020-Automatic Analyzer; Hitachi High-Technologies, Tokió, Japán) mértük. A plazma eritropoietin (EPO) szintjét mind egerekben, mind patkányokban ELISA-val mértük (Epo Mouse ELISA Kit, Kat. No. KA1998, Abnova, Tapei City, Tajvan; Legend Max Rat Erythropoietin ELISA Kit, Cat. No. 442807, BioLegend, San Diego, Kalifornia, USA) a gyártó utasításainak megfelelően. A ferritin és a gamma-glutamil-transzferáz (γ-GT) szintjét a patkány plazmájában is megvizsgáltuk kereskedelmi forgalomban kapható ELISA készletekkel (Ferritin (Rat) ELISA kit, Kat. KA1949, Abnova; Rat γ-GT1 ELISA Kit, Kat. E -EL-RO404, Elabscience, Wuhan, Kína, ill.

Szövettani elemzés

Az egerek és a patkányok eutanáziáját követően a veséket összegyűjtöttük és 0,9% -os sóoldattal perfundáltuk, majd a vese darabokat 10% semleges pufferelt formalinban rögzítettük, etanol koncentrációgradiensben dehidráltuk, xilollal megtisztítottuk és paraffinba ágyazottuk. A szövetmintákat 5 μm vastag szakaszokra vágtuk, és azánnal festettük, a korábban leírtak szerint [25].

Gén expresszió a veseszövetben

Az RNS-t izoláltuk a patkányok vese kérgi szövetéből fenol-kloroform extrakciós módszerrel, és a korábban leírt módon készített cDNS-t [26]. Az α-simaizom-aktin (Sma) és a fibroblaszt növekedési faktor (Fgf) 23 mRNS-expresszióját valós idejű PCR-rel elemeztük ABI Prism 7000 rendszerrel, Power SYBR Green PCR Master Mix alkalmazásával (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ). Patkányoknál alkalmazott oligonukleotid-primerek a következők voltak (előre, illetve hátra): 5'-ACGGCGGCTTCGTCTT CT-3 'és 5'-CCAGCTGACTCCATGCCAAT-3' az α-Sma esetében [27]; 5′-TTGGATCGTATC ACTTCAGC-3 ’és 5′-TGCTTCGGTGACAGGTAG-3’ az Fgf23 esetében [28]; 5'-CCCTG GCTCCTAGCACCAT-3 ', és 5'-CCTGCTTGCTGATCCACAT CT-3' a β-aktin esetében [27]. A célgének bőségét normalizáltuk β-Actinra (belső kontrollként), és a korábban leírt 2 -ΔΔCt módszerrel elemeztük [29].

Statisztikai analízis

Az adatok az átlag ± SEM. Egyirányú varianciaanalízist, majd Dunnett többszörös összehasonlító tesztjét alkalmazták az összes keresztmetszeti egyfaktoros adatra (plazma BUN, Hb, ferritin, γ-GT, vizeletfehérje, mRNS expresszió). A longitudinális (testsúly, plazma kreatinin, hematokrit és EPO) adatokat kétirányú varianciaanalízissel elemeztük, amelyet Bonferroni post-hoc teszt követett, hogy meghatározzuk a csoportok közötti különbségeket, kivéve az egér plazma kreatinin és EPO adatait (a variancia, amelyet Bonferroni post-hoc teszt követ). Az adeninnel beadott patkányok és egerek adatait összehasonlítottuk a megfelelő vivőanyaggal kezelt csoport adataival. A P értéke P 1. ábra. Az adenin nagy dózisa szájon át történő adagolással csökkenti az egerek és patkányok testtömegét.

A testtömeg változása az adenin beadása és a megfigyelési időszak alatt (A) egerekben és (B) patkányokban. * P 1. táblázat: Plazma biokémiai, hematológiai, metabolikus és vizelési paraméterek adenin okozta vesekárosodásban szenvedő rágcsálóknál.

Az adenin szájon át történő adása csökkenti a vesefunkciót és olyan kóros tulajdonságokat mutat, mint a CKD

Egerekben az adenin orális adagolása 25 mg/kg dózisban kissé, de jelentősen megemelte a plazma kreatinin (0,8 ± 0,10 mg/dl) szintet a 28. napon (2A. Ábra). Ezzel szemben 50 mg/kg adenin a plazma kreatininszint hozzávetőlegesen ötszörös növekedését (1,9 ± 0,10 mg/dl) okozta a hordozóval kezelt egerekhez képest (0,4 ± 0,02 mg/dl). A megfigyelési időszak alatt a plazma kreatinin szintje csökkent, de az 50 mg/kg adeninnel kezelt csoportban szignifikánsan magasabb maradt, mint a hordozóval kezelt egereknél a 28. napon. Következésképpen a BUN szintje a plazmában is szignifikánsan magasabb volt az egerekben a 70. napon 50 mg/kg adeninnel kezelték (2.C ábra).

A plazma kreatininszint változása az adenin beadása után és a megfigyelési időszak alatt (A) egerekben és (B) patkányokban. A plazma BUN szintje (C) egerekben és (D) patkányokban a 70., illetve a 66. napon. * P † P †† P 3. ábra: Adenin szájon át történő adagolása csökkenti a hematokrit és a Hb szintjét.

A hematokrit szint változásai az adenin beadása után és a megfigyelési időszak alatt (A) egerekben és (B) patkányokban. A plazma Hb szintje (C) egerekben és (D) patkányokban a 70., illetve a 66. napon. *** P 4. ábra: Adenin szájon át történő bevitele a plazma eritropoietin és ferritin szintre.

A plazma eritropoietin (EPO) szintjének változásai az adenin beadása után és a megfigyelési időszak alatt (A) egerekben és (B) patkányokban. A plazma ferritin szintje (c) patkányokban a 66. napon. * P †† P ††† P 5. ábra. Az adeninnel történő szájon át történő kezelés tubulusinterstitialis fibrózist vált ki.

Reprezentatív fotomikrográf a veseszövetek kérgi szakaszainak azánfestéséről a tubulointerstitialis fibrózis kimutatására (A) egerekben és (B) patkányokban vivőanyaggal vagy adeninnel történő kezelés után (50 mg/kg egereknél és 600 mg/kg patkányoknál) különböző időpontokban . 100-szoros nagyítású fényképfelvétel.

Patkányokban ezek a durva morfológiai változások a vesében a 600 mg/kg adeninnel kezelt csoportban is nyilvánvalóak voltak (S2B ábra). A súlyos tubulointerstitialis fibrózis, ciszta kialakulásával és tubuláris károsodással, nyilvánvaló volt 42 és 84 nappal az adenin 600 mg/kg dózisban történő orális beadása után patkányokban (5B. Ábra). Következetesen az a-Sma (a fibrózis kritikus mediátora) mRNS-expressziós szintje drasztikusan emelkedett a kortikális veseszövetekben a 84. napon (6A. Ábra). Továbbá az Fgf23 mRNS magas expressziót mutatott ki adeninnel kezelt patkányok vese szöveteiben 600 mg/kg dózisban, mert ez a CKD progresszióját jósolta meg a csont átalakulásának zavarásával (6B. Ábra).

Az (A) α-Sma és (B) Fgf23 mRNS-expressziójának relatív változásai patkányok vese kérgi szövetében a 84. napon. * P 7. ábra. Az eritropoietin-kezelés javítja a vese vérszegénységét az adenin által kiváltott vesekárosodás modelljében.

Az (A) BUN, (B) hematokrit és (C) Hb plazmaszintje rhEPO (5 NE) szubkután injekció után, 2 napos intervallumban, 5 héten át egerekben, akik adenin okozta vesekárosodást szenvedtek (50 mg/kg adenin 4 hétig) ). *** P §§ P §§§ P 2+ koncentráció, oxidatív stressz és ceramid. Ezért a rágcsálókban az adenin által kiváltott súlyos vérszegénység az eryptosishoz is társulhat.

Így a jelen vizsgálat bebizonyította, hogy az adenin 50 mg/kg-os orális adagolása 28 napig egerekben vagy 600 mg/kg-os adagolás 10 napig patkányokban szignifikáns vérszegénységet vált ki, amelyet veseszöveti sérülés és diszfunkció kísér. Összefoglalva, újszerű megközelítést hoztunk létre a vese vérszegénységének modelljeiben mind egerekben, mind patkányokban. Ezek az állatmodellek fontos és hasznos eszközök lennének az emberek vese vérszegénységének transzlációs kutatásához.

Segítő információ

S1 ábra Kísérleti séma.

Adenin orális adagolása (A) 25 vagy 50 mg/testtömeg-kg 28 napig egerekben vagy (B) 200 vagy 600 mg/testtömeg-kg 10 napig patkányokban. Egerekben a megfigyelési időszak legfeljebb 70 nap volt, patkányokban pedig akár 84 nap. Nyilak (↑) jelzik a vérvétel időpontját.

S2 ábra. A vesemorfológia bruttó változásai az adenin kezelés után.

A vese méretének és színének változása a megfigyelési időszak alatt (A) egerekben és (B) patkányokban vivőanyaggal (0,5% CMC) vagy adeninnel (50 mg/kg egereknél és 600 mg/kg patkányok) végzett kezelés után különböző időpontokban pontokat.

S1 fájl. Az ARRIVE irányelvek ellenőrzőlistája.

Köszönetnyilvánítás

Szeretnénk megköszönni Yumi Sakane kiváló technikai segítségét.

Hivatkozások

Tárgyterületek

A PLOS tárgyterületeivel kapcsolatos további információkért kattintson ide.

Szeretnénk visszajelzését. Van-e értelme ezeknek a tárgyköröknek a cikk számára? Kattintson a célra a helytelen Tárgy mellett, és tudassa velünk. Köszönöm a segítséget!

A tárgykör "Adenine" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Anémia" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Krónikus vesebetegség" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Szóbeli beadás" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Kreatinin" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Hematokrit" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Egér modellek" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Vese" alkalmazható erre a cikkre? igen nem