A fehérje molekulatömegének meghatározása SDS-PAGE segítségével: A folyamat áttekintése

Kérdés:

Hogyan lehet meghatározni a fehérje molekulatömegét SDS-Page segítségével?

folyamat

A fehérje ember azt mondja:

Hogyan lehet megbecsülni egy ismeretlen fehérje molekulatömegét? Nos, megteheti az SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid-gélelektroforézis) módszerrel. Noha vannak más módszerek (azaz analitikai ultracentrifugálás és fényszórás) egy ismeretlen fehérje méretének vagy molekulatömegének (MW) kiszámítására, ezeket általában nem használják erre a célra, mivel nagy mennyiségben nagy tisztaságú fehérjéket használnak, és költséges berendezéseket igényelnek.

SDS-PAGE a molekulatömeg meghatározásához: A folyamat áttekintése

Az ismeretlen fehérje molekulatömegének meghatározásához el kell különíteni a mintát ugyanazon a gélen egy molekulatömeg-standarddal. A standardok és az ismeretlen fehérjeminta futtatása után a gélt a kívánt festéssel dolgozzuk fel, majd kb. 12–14 órán át festetlenítjük a fehérje sávok megjelenítésére.

A gél futtatása után meg kell határoznia a fehérje standardok és az ismeretlen fehérje relatív migrációs távolságát (Rf). A migrációs távolság a következő egyenlet segítségével határozható meg:

Rf = a fehérje vándorlási távolsága
A festékfront migrációs távolsága

Megjegyzés: Vonalzóval megmérheti a migrációs távolságot (centiméterben) a gél tetejétől a gél minden nagyobb sávjáig. Alternatív megoldásként megfelelő szoftver is használható a kapott sávok Rf-értékeinek meghatározására.

A standardban a sávokra kapott értékek alapján az SDS-denaturált polipeptid molekulatömegének és relatív migrációs távolságának (Rf) logaritmusát ábrázoljuk. Kérjük, vegye figyelembe, hogy akkor hoz létre lineáris ábrát a legtöbb fehérje számára, ha a mintái teljesen denaturáltak, és a gélszázalék megfelel a minta molekulatömeg-tartományának. Ha sigmoid görbét kap, ez azt jelenti, hogy a mátrix szitáló hatása vagy túl nagy ahhoz, hogy korlátozza a molekulák behatolását a gélbe, vagy szinte elhanyagolható, hogy a fehérjemolekuláknak szinte szabad mozgásuknál fogva vándorolniuk.

Az e grafikonon szereplő érték interpolálásával megkapja az ismeretlen fehérje sáv molekulatömegét. Felhívjuk figyelmét, hogy ennek a módszernek a pontossága egy ismeretlen fehérje molekulatömegének meghatározásakor általában 5% és 10% között mozog. A polipeptidek, például a glikol- és lipoproteinek jelenléte általában hibás eredményekhez vezet, mivel ezek nincsenek teljesen bevonva SDS-kel, és így nem viselkednének a várt módon.

Tehát a képen látható példa esetében az ismeretlen fehérje Rf értéke 0,7084. A lineáris diagram egyenletének felhasználásával kiszámíthatjuk a Log (MW) értéket. (-2,0742 x 0,7084) +2,8 = 1,3305. Tehát az inverz log 10 ^ 1,3305 = 21,4 kDa az ismeretlen fehérje molekulatömegére.

Ideális elválasztási feltételek megteremtése: Néhány figyelembe veendő tényező

Tekintettel annak fontosságára egy ismeretlen fehérjeminta molekulatömegének meghatározásában, a kísérlet során ki kell választania a megfelelő elválasztási körülményeket. Ehhez a következő tényezőket kell figyelembe vennie:

A standard fehérjét és az ismeretlen fehérjét ugyanazon a gélen azonos körülmények között elektroforézisnek kell alávetni.

Több adatpontot kell létrehozni annak biztosítására, hogy az adatok statisztikai szignifikanciát hordozzanak. A legjobb eredmény érdekében próbáljon meg legalább három gélt használni.

A fehérjék szolubilizálásakor a mintapuffernek redukálószereket, például ditiotreitolt vagy B-merkaptoetanolt kell tartalmaznia a diszulfidkötések megszakadásának biztosítása érdekében. Mint már tudhatod, a diszulfid-kötések csökkentik a másodlagos szerkezet migrációra gyakorolt ​​hatását.

A mintapuffernek tartalmaznia kell SDS-t is. Az SDS a hidrofób fehérjerégiókhoz kötődik a szekunder, tercier és kvaterner struktúrák denaturálásához, és nettó negatív töltést ad a fehérjéknek. Az SDS hatására a fehérjék véletlenszerű, rúdszerű láncokká bontakoznak ki, anélkül, hogy a folyamat során kovalens kötéseket bontanának meg. Ez azt eredményezi, hogy a fehérjék elveszítik biológiai funkcióikat anélkül, hogy károsítanák elsődleges struktúrájukat.

Ne feledje, hogy az ismeretlen fehérjének a standard görbe lineáris tartományán belül kell lennie, hogy lehetővé tegye a molekulatömegének pontos meghatározását. Ezenkívül az ismeretlen fehérje mennyiségének meg kell egyeznie a megfelelő standarddal az eredmények pontosságának növelése érdekében.