A foszfatidilkolin adipocita-specifikus lipolízist és apoptózist okoz a zsír- és izomszövetekben

Csatlakozási Gyógyszerészeti Tanszék, Orvostudományi Főiskola, Csung-Ang Egyetem, Heuksuk-dong, Dongjak-gu, Szöul, Koreai Köztársaság

Szerepek Formális elemzés

Gyógyszerészeti Főiskola, Gyógyszerészeti Főiskola, Farmakológiai Tanszék, Daegu Katolikus Egyetem, Gyeongsan, Koreai Köztársaság

Szerepek Formális elemzés

Koreai Egyetem, Koreai Egészségtudományi Főiskola Fizikoterápiás Tanszéke, Szöul, Koreai Köztársaság

Szerepek Formális elemzés

Gyógyszerészeti és biotechnológiai tagozat, Konyang Egyetem, Daejeon, Koreai Köztársaság

Szerepek írása - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás Farmakológiai Tanszék, Állatorvosi Kar, Kairói Egyetem, Giza, Egyiptom, Orvosi Farmakológiai Tanszék, Orvostudományi Kar, Atatürki Egyetem, Erzurum, Törökország

Csatlakozási Gyógyszerészeti Tanszék, Orvostudományi Főiskola, Csung-Ang Egyetem, Heuksuk-dong, Dongjak-gu, Szöul, Koreai Köztársaság

Társulási neuropszichofarmakológiai és toxikológiai program, Gyógyszerészeti Főiskola, Kangwon Nemzeti Egyetem, Chunchon, Koreai Köztársaság

Csatlakozási Gyógyszerészeti Tanszék, Orvostudományi Főiskola, Csung-Ang Egyetem, Heuksuk-dong, Dongjak-gu, Szöul, Koreai Köztársaság

Szerepek Konceptualizálás, Írás - eredeti vázlat, Írás - áttekintés és szerkesztés

Csatlakozási Gyógyszerészeti Tanszék, Orvostudományi Főiskola, Csung-Ang Egyetem, Heuksuk-dong, Dongjak-gu, Szöul, Koreai Köztársaság

Tae Woo Jung,
Taekwang Park,
Jinwoo Park,
Uiseok Kim,
Hyun Dong Je,
Hyeong-Dong Kim,
Seong-Wan Cho,
A. M. Abd El-Aty,
Jin-Ho Song,
Hyoung-Chun Kim

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Jung TW, Park T, Park J, Kim U, Je HD, Kim H-D és mtsai. (2019) A foszfatidilkolin adipocita-specifikus lipolízist és apoptózist okoz a zsír- és izomszövetekben. PLoS ONE 14 (4): e0214760. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0214760

Szerkesztő: Makoto Kanzaki, Tohoku Egyetem, Japán

Fogadott: 2018. december 27 .; Elfogadott: 2019. március 19 .; Közzétett: 2019. április 8

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a kéziratban és annak kiegészítő információs fájljaiban található.

Finanszírozás: Ezt a tanulmányt a szerzők (TWJ: 2016R1C1B2012674; JHJ: 2017R1D1A1B03028892) által a Koreai Nemzeti Kutatási Alapítványtól (NRF) elnyert támogatások támogatták, https://www.nrf.re.kr/index. A finanszírozók nem játszottak szerepet a tanulmány megtervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Rövidítések: PPC, foszfatidilkolin; siRNS, kis interferáló RNS; TNFa, tumor nekrózis faktor alfa; IL-1β, interleukin 1 béta

Bevezetés

A mezoterápia egy nem műtéti, minimálisan invazív technikája a mezodermába történő gyógyszer bejuttatásának a helyi régiók kezelésére [1]. Ennek a rendszernek a fő feladata a gyógyszer dózisának növelése, és számos terápiás hatást mutat, például zsírembóliát, hiperlipidémiát, helyi fájdalmat és májproblémákat [2]. A foszfatidilkolin (PPC) egy lecitin eredetű foszfolipid, amely természetesen megtalálható a tojássárgájában, a szójababban és a tejben [3]. Ez a komponens elnyomja a lipidfelhalmozódást és enyhíti a máj lipidfelhalmozódása, a szívizom ischaemia és a demencia által okozott májbetegségeket [3–5]. Jelenleg a PPC-alapú formulát alkalmazták a helyi lipidfelhalmozódás kezelésére a zsír lipolízisének szabályozásával [6]. Sőt, a lipoma mérete csökken a PPC intralesionális injektálása után [7].

Epesókat, például nátrium-dezoxi-kolátot (SD) használtak a PPC hidrofilicitásának javítására [8], mielőtt nyílt klinikai vizsgálatokban használták volna őket [9]. A zsírleszívás helyett a részleges zsírszövet csökkentésére PPC alapú készítményt alkalmaztak, mint nem műtéti módszert [10]. Korábban számos tanulmány kimutatta, hogy a PPC-alapú képlet szubkután injekciója zsíroldódást eredményezhet [11, 12]. Felületaktív tulajdonságai miatt azonban az SD súlyos fájdalmat okoz (nekrózis és gyulladás révén), és nem specifikus módon stimulálja a zsír lebontását [13]. Korábbi vizsgálatunkban beszámoltunk az SD nélküli PPC-alapú készítmény hatásáról, valamint annak lipolitikus aktivitásáról 3T3-L1 adipocitákban TNFα-közvetített útvonalon keresztül [14]. Meg kell jegyezni, hogy a PPC-alapú készítmény SD nélküli szelektivitása a különféle sejttípusokkal szemben továbbra sem egyértelmű, bár kiderült, hogy a PPC-t tartalmazó formula specifikusan befolyásolja az adipocitákat, és kevésbé befolyásolja a preadipocyták életképességét [15].

A jelen vizsgálatot együttesen arra terveztük, hogy tisztázzuk egy SD-t nem tartalmazó PPC-t tartalmazó formula hatását a lipolitikus citokinek expressziójára, beleértve az alfa tumor nekrózis faktor (TNFα), az interleukin 1 béta (IL-1β) és a gamma interferon (IFNγ) expresszióját, és apoptózis különböző sejttípusokban (adipociták, miociták, vaszkuláris endothelium és fibroblaszt sejtek). Tovább vizsgáltuk a TNFα és az IL-1β szerepét a PPC által közvetített lipolízisben és az adipociták apoptózisában.

Anyagok és metódusok

Sejtkultúrák és reagensek

Western-blot elemzés és antitestek

A 3T3-L1 adipociták fehérjéit lízispufferrel (PRO-PREP; Intron Biotechnology, Szöul, Koreai Köztársaság) extraháltuk 90 percig, 4 ° C-on. A fehérjemintákat (30 μg) 10% SDS-PAGE-ra töltöttük, nitrocellulóz membránra (Amersham Bioscience, Westborough, MA, USA) vittük át, és primer antitesttel, majd ló retek peroxidázzal konjugált másodlagos antitesttel (Santa Cruz Biotechnology) szondáztattuk. . A mintákat fokozott kemolumineszcencia (ECL) készlettel detektáltuk [14, 16]. Anti-TNFα (1: 1000), anti-IL-1β (1: 1000), anti-NFκB (1: 1000) és anti-β-aktin (1: 3000) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornia, USA) használták.

Teljes RNS extrakció és kvantitatív valós idejű PCR

MTT assay

3- (4, 5-dimetil-tiazolil-2) -2,5-difenil-tetrazolium-bromidot (MTT) foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS; Invitrogen) oldunk, így 2 mg/ml munkaoldatot készítünk; Minden üregbe 100 μl MTT-t adtunk. A sejteket 37 ° C-on, 5% CO2, 95% levegő és 100% páratartalom mellett inkubáltuk. 3 óra elteltével az MTT oldatot 100 μl DMSO-val helyettesítettük. Az alapos keverés érdekében a lemezeket szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk, és az optikai sűrűséget (OD) többlemezes leolvasóval mértük 570 nm vizsgálati hullámhosszon és 630 nm referencia hullámhosszon.

Caspase 3 aktivitásvizsgálat

A Caspase 3 aktivitási vizsgálatot a gyártó protokollja szerint végeztük Caspase 3 Assay Kit (Colorimetric) alkalmazásával (Abcam, San Jose, Kalifornia, USA).

Enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat (ELISA)

A sejtek által szekretált TNFα (kat. Sz .: MTA00B), IL-1β (kat. Sz .: DY401-05) és IFNγ (kat. Sz .: MIF00) szinteket a megfelelő ELISA készletekkel (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) a gyártó utasításainak betartásával.

Géncsendesítés siRNS-ek alkalmazásával

A TNFα, IL-1β és NFκB-t célzó kis interferáló (si) RNS oligonukleotidokat (0–20 nmol/L) a Santa Cruz Biotechnology cégtől vásároltuk, és transzfektáltuk a génexpresszió elnyomására. A transzfekciót lipofectamine 3000 (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint hajtottuk végre

Lipolízis vizsgálat

A lipolízist kolorimetriás vizsgálattal Abcam lipolízis vizsgálati készlet alkalmazásával hajtottuk végre, a gyártó útmutatásait követve.

Statisztikai analízis

Az összes statisztikai elemzést SPSS/PC statisztikai program (13.0 verzió for Windows; SPSS, Chicago, IL, USA) segítségével végeztük. Az eredményeket a legmagasabb értékek szorzataként (átlag ± SEM) mutatjuk be. Valamennyi kísérletet három példányban hajtottuk végre. A statisztikai elemzéshez Student t tesztet vagy egyirányú ANOVA-t használtunk.

Eredmények

A PPC hatása az apoptózisra különféle sejttípusokban

A PPC apoptózisra gyakorolt hatásának értékeléséhez különféle sejttípusokban 3T3-L1 adipocitákat, C2C12 miocitákat, HUVEC-et és fibroblasztokat kezeltünk PPC-vel (0-10 mg/ml, 24 óra). A sejtek életképességét MTT assay alkalmazásával mértük. A PPC-alapú formula dózisfüggő módon csökkentette a 3T3-L1 sejtek életképességét és fokozta a kaszpáz 3 aktivitását. Érdekes módon a PPC kezelés nem befolyásolta a sejtek életképességét és a kaszpáz 3 aktivitását a C2C12 miocitákban, a HUVEC-ben és a fibroblasztokban (1. ábra).

A 3T3-L1 adipocitákat, a C2C12 myocytákat, a HUVEC-t és a fibroblaszt sejteket különböző koncentrációjú (0-10 mg/ml) PPC-vel kezeltük 24 órán át. A sejteket MTT vizsgálattal értékeltük az életképesség (A) és a kaszpáz 3 aktivitás (B) meghatározása céljából. A ± SEM értékeket három független kísérletből számoltuk ki. *** P 2. ábra. A PPC specifikusan indukálja a TNFα és az IL-1β szekrécióját és expresszióját adipocitákban, de nem adipocytákban.

A 3T3-L1 adipocitákat, a C2C12 myocytákat, a HUVEC-t és a fibroblaszt sejteket különböző koncentrációjú (0-10 mg/ml) PPC-vel kezeltük 24 órán át. A TNFa (A) és az IL-1β (B) szekréciójának mérésére táptalajokat használtunk. A TNFα és IL-1β mRNS expresszióját kvantitatív valós idejű PCR analízissel (C) határoztuk meg. A sejtkivonatokat Western-blottolással elemeztük, hogy meghatározzuk a TNFa és az IL-1β expressziót (D). Tenyésztő táptalajokat használtunk az IFNy (E) szekréciójának mérésére. Az átlag ± SEM értéket három független kísérletből számoltuk ki. *** P 3. ábra. A TNFα és az IL-1β hozzájárul a PPC által közvetített lipolízishez és az apiptosishoz az adipocytákban.

(A) A 3T3-L1 adipocitákat különböző koncentrációjú (0-10 mg/ml) PPC-vel kezeltük 24 órán át. A sejteket lipolízissel vizsgáltuk. A tülekedést és a TNFa vagy IL-1β siRNS-eket transzfektált 3T3-L1 adipocitákat 24 órán át PPC-vel (10 mg/ml) kezeltük. A sejtkivonatokat lipolízis vizsgálattal (B), MTT vizsgálattal mértük a sejt életképességének (C) és a kaszpáz 3 aktivitásának (D) meghatározására. A ± SEM értékeket három független kísérletből számoltuk ki. *** P! P ! P 4. ábra. A PPC szabályozza a TNFα és az IL-1β expresszióját az NFκB nukleáris transzlokáció révén.

(A) A 3T3-L1 adipocitákat különböző koncentrációjú (0-10 mg/ml) PPC-vel kezeltük 24 órán át. A sejtkivonatokat Western-blot-analízissel analizáltuk. (B) Scramble és NFκB siRNS-ekkel transzfektált 3T3-L1 adipocitákat 24 órán át PPC-vel (10 mg/ml) kezeltünk. A sejtkivonatokat Western-blottolással elemeztük. A ± SEM értékeket három független kísérletből számoltuk ki. *** P. P ! P 5. ábra. A PPC 3T3-L1 adipociták lipolízisére és apoptózisára gyakorolt hatásának sematikus diagramja.

Segítő információ

S1. Ábra. A 3T3-L1 sejtek differenciálása.

S2. A PPC a lipolízist és az apoptózist elősegíti az adipociták NFκB által közvetített jelátvitelén keresztül.

Tárgyterületek

A PLOS tárgyterületeivel kapcsolatos további információkért kattintson ide.

Szeretnénk visszajelzését. Van-e értelme ezeknek a tárgyköröknek a cikk számára? Kattintson a célra a helytelen Tárgy mellett, és tudassa velünk. Köszönöm a segítséget!

A tárgykör "Adipociták" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Lipolízis" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Apoptózis" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Fibroblastok" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "MTT assay" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Izomsejtek" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Zsírszövet" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Kolorimetriás vizsgálatok" alkalmazható erre a cikkre? igen nem