A gemcitabin és az ínymasztix kombinációja hatásos növekedésgátlást és apoptózist okoz a hasnyálmirigyrák sejtjeiben

Absztrakt

A gemcitabin és az ínymasztixis kombinációjának antiproliferatív és apoptotikus hatásainak, valamint az emberi hasnyálmirigy rákos sejtvonalak mögöttes mechanizmusainak vizsgálata.

Mód:

A sejtproliferációt és az apoptózist metil-tiazolil-tetrazolium (MTT) vizsgálattal, illetve propídium-jód festéssel vizsgáltuk. A Bcl-2, Bax, NF-KB p65 alegység és IκBα fehérje expresszióját Western-blot alkalmazásával mértük.

Eredmények:

A 0,01−100 μg/ml gemcitabin gátolta a sejtproliferációt és apoptózist indukált mind a hasnyálmirigyrák BxPC-3, mind a COLO 357 sejtekben. A 40 μg/ml mézgamasztix jelentősen felerősítette a 10 μg/ml gemcitabin antiproliferatív és apoptotikus hatásait 72 órás kezelés után. Amikor a sejteket gemcitabinnal és gumimasztikussal kombinálva kezeltük, az IκBα szint megemelkedett, míg az NF-KB aktivációja blokkolt volt; a Bax fehérje expressziója lényegesen megnövekedett, de a Bcl-2 fehérje alacsonyan szabályozott.

Következtetés:

A gemcitabin az ínymasztikussal kombinálva erős apoptózist okoz a hasnyálmirigyrák sejtjeiben. A kombináció hatékony terápiás stratégia lehet a hasnyálmirigyrák kezelésében.

Bevezetés

A hasnyálmirigyrák világszerte a negyedik vezető daganatos halálozási ok, egyéves túlélési aránya mindössze 10%, és a betegek csak 5% -a él túl öt évet 1. Az 5 éves túlélés a gyógyító reszekció után is csak 10–20% 2. A hagyományos kemoterápia és sugárterápia, akár önmagában, akár kombinációban, korlátozott hatást gyakorol a hasnyálmirigyrákban szenvedő betegek teljes túlélésére 3. Az elmúlt évtizedben számos terápiás szer elérhetősége ellenére a gemcitabin (2 ′, 2′-difluorodeoxycytidin) továbbra is a lokálisan előrehaladott és áttétes hasnyálmirigyrák 4, 5, 6, 7, 8 első vonalbeli kezelése. A gemcitabint egyetlen daganatellenes szerként vagy más citotoxikus szerekkel kombinálva alkalmazzák szilárd daganatokban, például petefészek-, nem kissejtes tüdő- és hasnyálmirigyrákokban 9, 10, 11. A gemcitabin hatékonysága azonban nem kielégítő 12, 13, és daganatellenes citotoxikus hatásainak javítása az elmúlt években nagy érdeklődést váltott ki.

Gumimasztix, természetes gyanta, amelyet a szárából és leveleiből nyernek Pistacia lentiscus fák, évszázadok óta széles körben használják a mediterrán és a közel-keleti országokban, mind étrend-kiegészítőként, mind gyógynövényként. Orvosi vizsgálatok azt mutatják, hogy az ínymasztikusoknak citoprotektív vagy savcsökkentő hatása lehet a gyomor-bél rendszerre. Azt is beszámolták róla, hogy antioxidáns 14 és antibakteriális 15 aktivitással rendelkezik. Nemrégiben a sejtproliferáció és a sejtciklus progressziójának hatékony gátlójaként azonosították a humán prosztatarák 16, 17 sejtjeiben, valamint az apoptózis induktoraként a humán HCT116 vastagbélrákos sejtekben 18 .

Jelen tanulmányban a in vitro a gemcitabin antiproliferatív és apoptotikus hatásai és mechanizmusai kombinálva az ínymasztikussal az emberi hasnyálmirigy sejtvonalaiban.

Anyagok és metódusok

Sejtkultúra

Humán BxPC-3 és COLO 357 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) hasnyálmirigy sejtvonalakat növesztettünk RPMI-1640-ben, illetve DMEM-ben, és kiegészítettük 10% hő-inaktivált szarvasmarha-magzati szérummal (FBS) 37 ° C-on. C 5% szén-dioxiddal. A sejteket hetente kétszer passzáltuk az exponenciális növekedés biztosítása érdekében.

Sejtproliferációs vizsgálat

3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium-bromid (MTT) vizsgálatokat végeztünk a sejtnövekedés és a sejtek életképességének értékelésére gemcitabinnal (Lilly, Franciaország) és/vagy gumimaszttal (Sigma) való kezelés után. (St Louis, MO, USA, G0878 sz.). A sejteket beoltottuk (BxPC-3, 1 × 104 sejt/üreg; COLO 357, 5 × 104 sejt/mélyedés) 96-lyukú lemezekre RPMI-1640-ben 10% FBS-sel 72 órán át 37 ° C-on, 5% -kal. CO2. MTT (Sigma Chemicals) reagenst (5 mg/ml) adtunk a sejtnövekedés kiértékelésekor, és az inkubálást további 4 órán át folytattuk. A reakciót lyukanként 150 μl dimetil-szulfoxiddal (DMSO, Sigma Chemicals) fejeztük be. Az abszorbancia értékeket ELISA olvasóval (Model 680, Bio-Rad) határoztuk meg 490 nm-en.

A sejt apoptózisának elemzése áramlási citometriával

A sejteket (4x105 sejt/üreg) oltottuk 6 lyukú lemezeken RPMI-1640 táptalajban 24 órán át. A táptalajt eltávolítottuk, a sejteket PBS-sel mostuk, majd gemcitabint (10 μg/ml) és/vagy gumimasztixot (40 μg/ml) adtunk hozzá. 48 óra elteltével a sejteket tripszinezzük és egy éjszakán át fixáljuk 70% jéghideg etanolban 4 ° C-on. Az áramlási citometriás elemzés előtt a rögzített sejteket centrifugáltuk, kétszer PBS-sel mostuk, és 5 μg/ml PI-t és 250 μg/ml RNáz A-t tartalmazó (PI Sigma Chemicals) PI-festőoldatban újraszuszpendáltuk. FACSCalibur áramlási citométer (FCM-500, Beckman Coulter) alkalmazásával a sejtciklus analízist minden mintán 10 000 sejten végeztük. A sejtciklus eloszlás számszerűsítését CellQuest szoftverrel végeztük.

Western blot elemzés

A sejtes lizátumokat 10% SDS-PAGE-vel elválasztottuk és elektrotranszferrel vittük át nitrocellulóz membránokra. Miután 5% zsírmentes tejjel blokkoltuk TBST-ben (20 mmol/l Tris, 150 mmol/l NaCl, 0,2% Tween-20, pH 7,6), a membránokat specifikus anti-NF-κB p65, anti-anti-N Bcl-2, anti-Bax, anti-IBBα vagy anti-β-aktin (Santa Cruz) antitestek szobahőmérsékleten 2 órán át, majd 1: 4000 tormaperoxidáz (HRP) -konjugált második antitesttel (Santa Cruz) 1 órán át. h. Az immunreaktív sávokat egy fokozott kemilumineszcens készlet segítségével (ECL, Santa Cruz Biotechnology Inc, USA) tettük láthatóvá. β-aktint használtunk a fehérje mennyiségének normalizálására a bloton.

Statisztikai analízis

Minden kísérletet legalább háromszor hajtottak végre. Az adatokat adott esetben átlag ± SD-ként tüntettük fel, és a különbségeket Student-ek segítségével értékeltük t-tesztek. A valószínűsége P

Eredmények

A gemcitabin és a gumimasztix hatása a sejtproliferációra

A gemcitabin és az ínymasztix sejtnövekedésre gyakorolt hatásának kimutatására a humán BxPC-3 és COLO 357 hasnyálmirigyrák sejtvonalakat gemcitabin (0,01-100 μg/ml) vagy gumimasztix (10-50 μg/ml) fokozatos koncentrációival kezeltük. 72 órán át. Amint az 1A. Ábra mutatja, a sejtproliferációt dózisfüggő módon gemcitabin vagy gumi masztix kezelés gátolta. Összességében 10 μg/ml gemcitabin vagy 40 μg/ml gumimasztix okozta maximális növekedésgátlást 55,55% (P 1.ábra

A gemcitabin és a gumimasztix hatása a sejt apoptózisára

A BxPC-3 és COLO 357 sejteket gemcitabinnal (10 μg/ml) és gumimaszttal (40 μg/ml) kezeltük külön-külön vagy kombinációban. A sejtek apoptózisát az Annexin V-PI kettős jelöléssel és FACS analízissel vizsgáltuk. Amint a 2. ábra mutatja, a BxPC-3 sejtekben a sejtek 30,40% ± 3,477% és 31,37% ± 1,662% -a volt apoptotikus a gumimasztix csoportban, illetve a gemcitabin csoportokban. A COLO 357 sejtekben a sejtek 29,45% ± 1,750% és 30,07% ± 1,358% -a volt apoptotikus a két csoportban. Egyszeres kezeléssel összehasonlítva a gemcitabin és a gumimasztix kombinációja sokkal nagyobb százalékban eredményezett apoptózist (BxPC-3, 45,13% ± 4,005%, P 2. ábra

Az NF-κB aktiváció gátolható gemcitabin és gumimasztix kombinációjával

A legújabb, 19. és 20. jelentésből kiderült, hogy a hasnyálmirigyrák sejtjeiben a gemcitabin indukálhatja az NF-κB aktiválódását. A kísérletet megismételtük, és ugyanazokat az eredményeket kaptuk (3A-3B. Ábra, 2. sáv). Annak kimutatására, hogy az ínymasztix BxPC-3 sejtproliferációra gyakorolt gátló hatását az NF-κB inaktiválása okozta-e, Western-blot-vizsgálatot végeztünk az NF-κB p65 fehérje expressziójának változásainak tesztelésére. Amint a 3B. Ábrán látható (3. sáv), a gumi masztix önmagában elnyomta az NF-KB expressziót. Ami a legfontosabb, hogy az ínymasztikussal való együttes kezelés gátolta a gemcitabin által kiváltott NF-KB aktivációt (3B. Ábra, 4. sáv). Hasonló jelenséget találtunk a COLO 357 sejtekben (3B. Ábra).

Az NF-κB aktiváció gátolható gemcitabinnal és gumimaszttal kombinált kezeléssel. (A) Western blot-analízis az NF-κB-re 10xg/ml gemcitabinnal kezelt BxPC-3 sejtek magkivonataiban különböző időpontokban. (B) Western blot-analízis mind az NF-KB p65 alegységre mind a BxPC-3, mind a COLO 357 sejtek magkivonataiban 48 órás kezelés után sejtközeggel (1. sáv), gumimasztix (2. sáv), gemcitabin (3. sáv) vagy ezek kombináció (4. sáv). Belső kontrollként a β-aktin fehérjét használtuk. Az NF-KB p65 fehérjeszintek denzitometriai mérését a belső kontrollra normalizáltuk, és relatív értékként fejeztük ki.

A gemcitabin kezelése gumimaszttal kombinálva csökkentette a Bcl-2 expresszióját, növelte a Bax expresszióját és megakadályozta az IκBα lebomlását.

Mivel az NF-κB-nek központi szerepe van a hasnyálmirigyrák apoptotikus útjának szabályozásában, az IκBα, Bcl-2 (NF-κB downstream anti-apoptotikus molekulák) és Bax (NF-κB downstream pro-apoptotikus molekulák) expressziója észlelték. A Western blot kimutatta, hogy a Bcl-2 expressziója szignifikánsan alacsonyabban volt szabályozva a kombinációs csoportban, összehasonlítva az egyedi szerrel és a kontrollal végzett kezelésselP 4. ábra

A gemcitabin kezelése gumimasztikussal kombinálva megváltoztatja a Bcl-2, Bax és IκBα expresszióját. A Bcl-2, Bax és IκBα expresszióját Western-blot-analízissel analizáltuk. A BxPC-3 sejteket sejtközeggel, 40 μg/ml gumi maszttal, 10 μg/ml gemicitabinnal vagy ezek kombinációjával 48 órán át kezeltük. Belső kontrollként β-aktint használtunk. Ezen fehérjeszintek denzitometriai mérését a belső kontrollra normalizáltuk, és relatív értékként fejeztük ki.

Vita

Az elmúlt évtizedben a lokálisan előrehaladott és áttétes hasnyálmirigyrák kezelésének alapszere továbbra is a gemcitabin 21. Hatékonysága azonban gyakran korlátozott. Daganatellenes citotoxikus hatásának javítása és a hasnyálmirigyrák kezelésének új kezelési módjainak azonosítása érdekében megvizsgáltuk a gemcitabin és egy új szer, a gumimasztix kombinációjának hatását a sejtproliferációra, valamint az apoptózisra az emberi hasnyálmirigyrák sejtvonalaiban, és feltártuk a mechanizmust. ezekre a hatásokra.

A gyógyszer daganatellenes aktivitása a tumorsejtek proliferációjának gátlásával, a sejtek differenciálódásának elősegítésével és az apoptózis indukciójával jár együtt. Az ínymasztix természetes kivonata Pistacia lentiscus fák, és rákellenes tulajdonságait újonnan azonosították 16, 17, 18, 22 . In vitro, az ínymasztix bizonyítottan gátolja a prosztatarák sejtjeinek növekedését és a vastagbélrák sejtjeinek apoptózisát indukálja. Ebben a tanulmányban értékeltük az ínymasztix hatásait a hasnyálmirigyrák sejtjeiben. Megtaláltuk azt az ínymasztikát, in vitro, antiproliferatív és apoptotikus hatással volt az emberi hasnyálmirigyrák sejtjeire (BxPC-3). Ami a legfontosabb, hogy az ínymasztikumok szinergikusak voltak, amikor gemcitabinnal alkalmazták. Ezzel a két ágenssel egyidejű kezelés után a sejtek szaporodása nagymértékben elnyomódott, és a sejtek apoptózisának aránya szignifikánsan magasabb volt, összehasonlítva a bármelyik szerrel önmagában kezelt sejtekkel.

Hasonlóképpen, a BxPC-3 és COLO357 sejtvonalakban az NF-κB gumi masztix gátlása a gemcitabin fokozott apoptotikus hatásával járt együtt. Megállapítottuk, hogy amikor a sejteket gemcitabinnal és gumimasztixmal kezelték, az NF-KB p65 expressziója erősen elnyomódott, míg az IκBα expresszió növekedett. A Bcl-2 expressziója szignifikánsan csökkent, a Bax pedig felfelé szabályozott volt a kombinációs csoportban, összehasonlítva az egyedi szerkezeléssel és a kezeletlen kontrollal. Tehát feltételezhető, hogy a gumimasztix hozzáadása a gemcitabinhoz növelte az NF-KB jelátviteli út gátlását a sejtnövekedésen és a BxPC-3 sejtek apoptózisát. A megnövekedett IκBα expresszió gátolhatja az NF-κB expressziót és aktivációt, amely sejt apoptózist indukál. Az NF-κB útvonal gátlása lefelé szabályozott anti-apoptotikus Bcl-2-t, de felfelé szabályozta a pro-apoptotikus Bax expresszióját.

Ezért a gemcitabin az ínymasztikussal kombinálva a hasnyálmirigyrák sejtjeinek proliferációját és apoptózisát hatékonyan elnyomja. Azt azonban, hogy gyakori jelenség-e, több hasnyálmirigy-sejtvonal, például a PANC-1 29, 30 tesztelésével kell meghatározni. Eredményeink azt sugallják, hogy a gemcitabin és a gumimasztix együttes alkalmazása potenciális klinikai értékkel bír, és hatékony terápiás stratégiaként működhet a hasnyálmirigyrák klinikai kezelésében.

Szerző hozzájárulás

Xin-yu HUANG felügyelte a projektet és megtervezte a kísérleteket; Hong-cheng WANG, Zhou YUAN, Ang LI, Mei-lan HE és Kai-xing AI végezték a kísérleteket; Qi ZHENG és Huan-long QIN írta a lapot; Az LI kritikus átdolgozta a kéziratot.

Hivatkozások

Fryer RA, Galustian C, Dalgleish AG. A hasnyálmirigyrák elleni kezelési stratégiák legújabb fejleményei és fejleményei. Curr Clin Pharmacol 2009; 4: 102–12.

Yokoyama Y, Nimura Y, Nagino M. A hasnyálmirigyrák kezelésében elért eredmények: a műtét korlátai és az új terápiás stratégiák értékelése. Surg ma 2009; 39: 466–75.

Lockhart AC, Rothenberg ML, Berlin JD. A hasnyálmirigyrák kezelése: a jelenlegi terápia és a folyamatos fejlődés. Gasztroenterológia 2005; 128: 1642–54.

Burris HA, Moore MJ, Andersen J, Green MR, Rothenberg ML, Modiano MR, et al. A túlélés és a klinikai haszon javulása a gemcitabin, mint első vonalbeli terápia előrehaladott hasnyálmirigyrákban szenvedő betegeknél: randomizált vizsgálat. J Clin Oncol 1997; 15: 2403–13.

Burris HA, Storniolo AM. A hasnyálmirigyrák kezelésének klinikai előnyeinek értékelése: a gemcitabin az 5-fluorouracillal összehasonlítva. Eur J Cancer 1997; 33: 18–22.

Mackenzie RP, McCollum AD. Új szerek a hasnyálmirigy adenokarcinóma kezelésére. Szakértő rákellenes terápia 2009; 9.: 1473–85.

Igarashi H, Ito T, Kawabe K, Hisano T, Arita Y, Kaku T, et al. Kemoradioterápia hetente kétszer alacsony dózisú gemcitabin alkalmazásával lokálisan előrehaladott hasnyálmirigyrák esetén. Világ J Gasztroenterol 2008; 14: 5311–5.

Boeck S, Hinke A, Wilkowski R, Heinemann V. A teljesítmény állapotának fontossága a fejlett hasnyálmirigyrák kezelési eredményében. Világ J Gasztroenterol 2007; 13.: 224–7.

Abratt RP, Bezwoda WR, Falkson G, Goedhals L, Hacking D, Rugg TA. A gemcitabin hatékonysági és biztonsági profilja nem kissejtes tüdőrákban. II. Fázisú vizsgálat. J Clin Oncol 1994; 12.: 1535–40.

Lund B, Hansen OP, Theilade K, Hansen M, Neijit JP. A gemcitabin (2 ′, 2′-difluorodeoxycytidin) II. Fázisú vizsgálata korábban kezelt petefészekrákos betegeknél. J Natl Cancer Inst 1994; 86: 1530–3.

Heinemann V. Gemcitabin: előrehaladás a hasnyálmirigyrák kezelésében. Onkológia 2001; 60: 8–18.

Nieto J, Grossbard ML, Kozuch P. Metasztatikus hasnyálmirigyrák 2008: kevésbé üres a pohár? Onkológus 2008; 13.: 562–76.

Custodio A, Puente J, Sastre J, Díaz-Rubio E. A fejlett hasnyálmirigyrák második vonalbeli terápiája: az irodalom és a jövőbeni irányok áttekintése. Cancer Treat Rev 2009; 35: 676–84.

Dedoussis GV, Kaliora AC, Psarras S, Chiou A, Mylona A, Papadopoulos NG, et al. Antiatherogén hatása Pistacia lentiscus a CD36 mRNS expressziójának GSH helyreállításával és csökkentésével. Atherosclerosis 2004; 174: 293–303.

Huwez FU, Thirlwell D, Cockayne A, Ala'Aldeen DA. A rágógumi megöli Helicobacter pylori. N Engl J Med 1998; 339: 1946.

ML, Yuan főhadiszállás, Jiang AL, Gong AY, Chen WW, Zhang PJ, et al. Az ínymasztikus gátolja az androgén receptor expresszióját és működését a prosztatarák sejtjeiben. Rák 2006; 106.: 2547–55.

ML, Li A, Xu CS, Wang SL, Zhang MJ, Gu H, et al. Az antiprosztata rák mechanizmusai gumimasztikussal: NF-kappaB jel mint cél. Acta Pharmacol Sin 2007; 28.: 446–52.

Balan KV, Demetzos C, J herceg, Dimas K, Cladaras M, Han Z, et al. Apoptózis kiváltása emberi vastagbélrákos HCT116 sejtekben, amelyeket a növényi termék kivonatával, a Chios mastics gumival kezeltek. In Vivo 2005; 19.: 93–102.

Li Y, Ellis KL, Ali S, El-Rayes BF, Nedeljkovic-Kurepa A, Kucuk O, et al. A kemoterápiás szerek apoptózist kiváltó hatását a szója izoflavon genistein, az NF-κB természetes inhibitora erősíti a BxPC-3 hasnyálmirigyrák sejtvonalban. Hasnyálmirigy 2004; 4: 90–5.

Banerjee S, Zhang YX, Ali S, Bhuiyan M, Wang ZW, Chiao PJ, et al. Molekuláris bizonyíték a gemcitabin fokozott daganatellenes aktivitására a genistein által in vitro és in vivo hasnyálmirigyrák ortotopikus modelljének felhasználásával. Cancer Res 2005; 65: 9064–72.

O'Reilly EM. Hasnyálmirigy adenokarcinóma: új stratégiák a sikerhez. Gastrointest Cancer Res 2009; 3: S11–5.

Dimas K, Hatziantoniou S, Wyche JH, Pantazis P. A rágógumi kivonat immunhiányos egerekben indukálja a humán kolorektális tumor xenograftok növekedésének elnyomását. In Vivo 2009; 23: 63–8.

Baltimore D, AA könyörgő. DNS-kötő fehérjék. Egy pillangó repked. Természet 1995; 373: 278–87.

Gilmore TD, Koedood M, Piffat KA, Fehér DW. Rel/NF-kappaB/IkappaB fehérjék és rák. Onkogén 1996; 13.: 1367–78.

Boise LH, Gottschalk AR, Quintáns J, Thompson CB. Bcl-2 és Bcl-2-rokon fehérjék az apoptózis szabályozásában. Curr Top Microbiol Immunol 1995; 200: 107–21.

Korsmeyer SJ, Shutter JR, Veis DJ, Merry DE, Oltvai ZN. Bcl-2/Bax: reosztát, amely szabályozza az antioxidáns útvonalat és a sejthalált. Semin Cancer Biol 1993; 4: 327–32.

Chao DT, Korsmeyer SJ. BCL-2 család: a sejthalál szabályozói. Annu Rev Immunol 1998; 16.: 395–419.

Fahy BN, Schlieman MG, Mortenson MM, Virudachalam S, Bold RJ. A BCL-2 túlzott expressziójának megcélzása különböző emberi rosszindulatú daganatokban a bortezomib proteaszóma gátló NF-κB gátlásán keresztül. Cancer Chemother Pharmacol 2005; 56: 46–54.

Jiang PH, Motoo Y, Sawabu N, Minamoto T. A gemcitabin hatása az apoptózissal kapcsolatos gének expressziójára az emberi hasnyálmirigyrák sejtjeiben. Világ J Gasztroenterol 2006; 12.: 1597–602.

Johnson SK, Haun RS. Az inzulinszerű növekedési faktort kötő fehérje-5 befolyásolja a hasnyálmirigyrák sejtjeinek növekedését. Világ J Gasztroenterol 2009; 15: 3355–66.