A Gryllus bimaculatus por glükózcsökkentő hatása a streptozotocin által kiváltott cukorbetegségre az AKT/mTOR úton

Seon ‐ Ah Park

1 Nem klinikai értékelő központ, Orvosbiológiai Kutatóintézet, Chonbuk Nemzeti Egyetemi Kórház, Jeonju Chonbuk Dél-Korea,

Geum ‐ Hwa Lee

1 Nem klinikai értékelő központ, Orvosbiológiai Kutatóintézet, Chonbuk Nemzeti Egyetemi Kórház, Jeonju Chonbuk Dél-Korea,

Hwa ‐ Young Lee

1 Nem klinikai értékelő központ, Orvosbiológiai Kutatóintézet, Chonbuk Nemzeti Egyetemi Kórház, Jeonju Chonbuk Dél-Korea,

2 Farmakológiai Tanszék és Új Gyógyszerfejlesztési Intézet, Orvostudományi Kar, Chonbuk Nemzeti Egyetem, Jeonju Chonbuk Dél-Korea,

A Hiep Hoang

1 Nem klinikai értékelő központ, Orvosbiológiai Kutatóintézet, Chonbuk Nemzeti Egyetemi Kórház, Jeonju Chonbuk Dél-Korea,

2 Farmakológiai Tanszék és Új Gyógyszerfejlesztési Intézet, Orvostudományi Kar, Chonbuk Nemzeti Egyetem, Jeonju Chonbuk Dél-Korea,

Han ‐ Jung Chae

1 Nem klinikai értékelő központ, Orvosbiológiai Kutatóintézet, Chonbuk Nemzeti Egyetemi Kórház, Jeonju Chonbuk Dél-Korea,

2 Farmakológiai Tanszék és Új Gyógyszerfejlesztési Intézet, Orvostudományi Kar, Chonbuk Nemzeti Egyetem, Jeonju Chonbuk Dél-Korea,

Társított adatok

Absztrakt

Ezt a vizsgálatot a Gryllus bimaculatus por antidiabetikus hatásainak tisztázására végezték, I. típusú cukorbetegség streptozotocin (STZ) által indukált patkánymodelljével. A rovarpor beadása jelentősen megmentette a reprezentatív cukorbetegség markereit (azaz az inzulint és a C-peptidet) STZ-vel kezelt patkányokban. Javított glükóz tolerancia teszt (GTT) és inzulin tolerancia teszt (ITT) eredmények is megfigyelhetők, jelezve, hogy a Gryllus bimaculatus por antidiabetikus hatást fejt ki. A Gryllus bimaculatus por beadása megmentette az STZ által kiváltott változásokat a szigetek morfológiájában és az inzulinfestési mintákban. Az extraktum fokozta az antiapoptotikus Bcl2 expressziót és csökkentette a proapoptotikus Bax és az aktív kaszpáz 3 expressziót. Ezenkívül a Gryllus bimaculatus porpótlás fokozta az AKT/mTOR útvonalat, amely az anabolikus anyagcsere állapotának kulcsjelzője, és annak lefelé irányuló effektorát, az mTOR-t. Eredményeink összességében azt sugallják, hogy a Gryllus bimaculatus az apoptózis és az anabolikus anyagcsere elleni szabályozás révén hozzájárul a hasnyálmirigy β-sejtek működésének és morfológiájának fenntartásához a diabéteszes állapot ellen.

Absztrakt

Ez a tanulmány a Gryllus bimaculatus por antidiabetikus hatásait sugallja streptozotocin által indukált patkánymodellben. A Gryllus bimaculatus por javítja a cukorbetegség állapotát az AKT/mTOR útvonal útján egy streptozotocin által kiváltott diabéteszes állatmodellben. Ez a tanulmány azt sugallja, hogy a G. bimaculatus por hozzájárul a hasnyálmirigy β-sejtjeinek és morfológiájának fenntartásához egy streptozotocin által kiváltott diabéteszes állatmodellben.

1. BEMUTATKOZÁS

A cukorbetegség olyan anyagcsere-rendellenességek csoportjára utal, amelyek magukban foglalják azokat a betegségeket, amelyeknél a nem megfelelő inzulinszekréció vagy az inzulinrezisztencia miatt megnövekedett vércukorszint van (Novikova et al., 2013; van Belle, Coppieters és Herrath, 2011). Az 1-es típusú cukorbetegség (T1D) krónikus autoimmun betegség, amelyet a hasnyálmirigy-szigetek β-sejtjeinek szelektív autoimmun-közvetített pusztulása jellemez, fokozatosan abszolút inzulinhiányhoz vezetve (Novikova et al., 2013; van Belle et al., 2011). Az egész életen át tartó inzulin beadása T1D-ben szenvedő betegek számára szükséges. A cukorbetegség kezelésének elősegítése, valamint a T1D-betegek életminőségének és táplálkozási egyensúlyának javítása érdekében táplálkozásalapú funkcionális ételek ajánlottak.

Streptozotocin (STZ) által indukált állatmodellt javasoltak megfelelő módszerként a T1D-t enyhíteni képes élelmiszerek hatékonyságának vizsgálatára (Deeds et al., 2011; Shen et al., 2012; Zhang et al., 2014). Az STZ egy glükózamin – nitrozokarbamid vegyület, amely oxidációval jut be a hasnyálmirigy β-sejtjeibe, ami szuperoxid gyökök kialakulásához vezet; ennek eredményeként hidrogén-peroxid és hidroxil gyökök keletkeznek (Eleazu, Eleazu, Chukwuma és Essien, 2013; Lenzen, 2008), és az STZ gátolja az akonitáz aktivitást, és mérgező nitrogén-oxidok felszabadulását okozza, amelyek károsítják a DNS-t. Ami a legfontosabb, hogy az STZ toxicitás hasnyálmirigy β-sejt nekrózist eredményez (Lenzen, 2008; Sakuraba et al., 2002).

A rendkívül tápláló funkcionális táplálékforrások közül a rovarok, például a tücskök világszerte a 4. helyet foglalják el. A kriketttermelés hatékonysága viszonylag magas (80%) a marhahúshoz (40%), a sertéshúshoz (55%) és a baromfihoz (55%) képest. Továbbá a rovarok jelennek meg az állati fehérje alternatívájaként (Kouřimská & Adámková, 2016). Ahn és mtsai. (2005) arról számolt be, hogy a tücsök Gryllus bimaculatus telítetlen zsírsavakat tartalmaz, amelyek mind táplálékként, mind láz, hasmenés, vesekövek és magas vérnyomás kezelésére használhatók. Ezenkívül a jelentések szerint a Gryllus bimaculatus etanol-kivonata nem mérgező az emberre (Lee és mtsai, 2016; Ryu és mtsai, 2016). Következésképpen ezt a vizsgálatot annak megállapítására végezték, hogy a Gryllus bimaculatus por bevitele hozzájárulhat-e a hasnyálmirigy-sejtek működésének és a kapcsolódó antidiabetikus állapotok helyreállításához a T1D STZ-indukálta patkánymodelljében.

2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

2.1. Anyagok

Az STZ-t, a glükózt, az inzulint, a hematoxilint és az eozin Y-oldatot Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) szereztük be. C-peptid ELISA készletet a BioVision-től (Eugene, OR, USA) szereztünk be. Patkány/egér inzulin ELISA készletet vásároltunk a Merck Millipore-tól (EMD Millipore, Darmstadt, Németország). Az immunblotoláshoz a β-aktin, a p-AKT és a Bax elleni antitesteket a Santa Cruz Biotechnology-tól (Santa Cruz, Kalifornia, USA) vásároltuk. Az AKT, p ‐ AKT, p ‐ p70S6K, 4EBP1, p ‐ 4EBP1, mTOR, p ‐ mTOR, Bcl2, inzulint és hasított kaszpáz 3-at a Cell Signaling Technology-tól (Beverly, MA, USA) vásároltuk. A Gryllus bimaculatus por kereskedelmi márkáját „D&D (Diabetes & Dietary, feltaláló: Dr Lee Sam Goo, Dél-Korea)” néven a 239bio Inc.-től (Ixsan, Chonbuk, Dél-Korea) szerezték be. A por előállításához a Gryllus bimaculatus növekedési periódusát legfeljebb 35 napra korlátozták. A tücsköket 3 napos székletürítési periódusnak vetették alá, háromszor mosták desztillált vízben, majd fagyasztva szárították. A fagyasztva szárított Gryllus bimaculatus-t homogenizáltuk, és a port 4 hétig -20 ° C-on tároltuk. A porgyártás a 239bio Inc., Korea állampolgáraihoz tartozó szabadalmakon alapul, a következő nyilvántartási számokkal: 10–1686179, 10–1663202, 10–1702851, 10–1716766, 10–1716763, 10–1773851 és 10–1809451).

2.2. Állatok

Nyolc hetes hím SD patkányokat a Saeron Bio Inc.-től (Uiwang-si, Gyeonggi-do, Korea) vásároltak. Valamennyi állatot 18-25 ° C-on tartottuk 12 órás világos/sötét ciklus alatt, és ad libitum hozzáférést biztosítottak az élelemhez és a vízhez. 1 hét akklimatizáció után a patkányoknak intraperitoneálisan (IP) egyetlen dózis frissen készített STZ-t (65 mg/kg, Sigma-Aldrich; 0,05 M citrátpuffer; pH 4,5) injektáltunk a T1D indukálásához. A kontroll csoportba azonos térfogatú injekciót adunk, amely csak citrátpuffert tartalmaz. A cukorbetegséget az injekció beadása után 7 nappal igazolták a vércukorszint mérésével Accu-Chek glükométerrel (Roche, Boston, MA, USA). A vércukorszintet hetente egyszer mértük a Gryllus bimaculatus por beadását megelőző napon (Ryu et al., 2016). A kontroll csoportnak csak a legnagyobb adagot (6,5 g/kg) adták Gryllus bimaculatus porból, míg a cukorbeteg csoport különféle dózisokat (1,63, 3,25 és 6,5 g/kg) naponta kétszer (10:30 és 16:00). ). A kontroll csoportot azonos térfogatú vízzel tápláltuk.

2.3. Vércukorszint mérések, intraperitoneális glükóz tolerancia tesztek és inzulin tolerancia tesztek

A vércukorszint-méréseket, az intraperitoneális glükóz tolerancia teszteket (GTT) és az inzulin tolerancia teszteket (ITT) a korábban leírtak szerint végeztük (Cho, Zhou, Sheng és Rui, 2011). Röviden: a vércukorszintet hetente mértük patkány farok vérmintákban, kezdve a Gryllus bimaculatus por orális beadásával. A GTT-ket 2 nappal az eutanázia előtt végeztük, és a vizsgálatokat 09:00 órakor végeztük 12 órás koplalás után (az ételt előző este 21:00 órakor vettük ki). 10% -os glükózoldatot (1 g/kg) adtunk bolus IP injekcióként, és a farok vérmintáit 0, 15, 30, 45, 60, 90 és 120 perccel a beadás után gyűjtöttük a vércukorszint meghatározásához. Hasonló eljárást hajtottak végre az ITT-knél 8: 00-kor 4 órás koplalás után (az ételt 04: 00-kor vették ki). Inzulint (0,75 E/kg) adtak be bolus IP injekcióként, és a vércukorszintet 0, 15, 30, 45, 60, 90 és 120 percen belül határozták meg az injekció beadása után.

2.4. Immunhisztokémiai festés

Az immunhisztokémiai festést a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (Chau és mtsai, 2017; Franko és mtsai, 2016; Song és mtsai, 2010). Az elemzéshez a patkány hasnyálmirigyeket 3,7% -os formaldehid-oldatban rögzítettük, fokozatmentes etanol-sorozatban dehidratáltuk, paraffinba ágyazva (Leica, Wetzlar, Németország) és 4 µm-es szeletekre osztottuk. A hasnyálmirigy H&E festésére a metszeteket először hematoxilinnal festettük 2 percig, majd eozinnal (Sigma-Aldrich) 5 percig 10 perc mosás után. A hasnyálmirigy-szigetek inzulinfestéséhez a metszeteket inzulin antitesttel (1: 100, Santa Cruz Biotechnology) inkubáltuk. Az inzulin expresszióját 3-amino-9-etil-karbazollal (AEC; Dako, Santa Clara, Kalifornia, USA) detektáltuk, majd a sejtmagot hematoxilinnel festettük.

2.5. Immunblot

Az összes fehérjét kivontuk a hasnyálmirigyből lízispuffer (150 mM NaCl, 0,5 M Tris-HCl, 2,5% dezoxikolsav, 10% NP-40 és 10 mM EDTA; pH 7,4) alkalmazásával. A mintákat 10% –13% nátrium-dodecil-szulfát (SDS) –poliakrilamid gélelektroforézissel (PAGE) választottuk el és PVDF membránokra (Bio-Rad) vittük át. A membránokat specifikus primer antitestekkel (Bax, Bcl2, AKT, p-AKT, p70S6 kináz, p-p70S6 kináz, 4EBP1, p-4EBP1, mTOR, p-mTOR, hasított kaszpáz 3 és β-aktin, 1: 1 000 - 1: 2 000) egy éjszakán át 4 ° C-on, majd inkubálás torma-peroxidáz – IgG-konjugált szekunder antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten. A jeleket röntgenfilm segítségével jelenítettük meg (GE Healthcare, Amersham, Buckinghamshire, Egyesült Királyság). A fehérje expressziót sávfelismerő szoftverrel elemeztük ImageJ-ben (NIH, MD, USA).

2.6. Statisztikai analízis

Valamennyi értéket átlagként ± SEM fejezzük ki. Minden csoportra t tesztet alkalmaztunk. Statisztikai számításokat, ábrázolást és görbeillesztést hajtottunk végre az Origin 7.0 (OriginLab Co., MA, USA) alkalmazásával. A P érték (1a. Ábra). 1 a). A T1D markerei, beleértve a szérum C-peptid- és inzulinszintet, szignifikánsan csökkentek az STZ-indukálta cukorbetegségben a nem cukorbetegek csoportjához képest (ábra (1b. Ábra, c). 1b, c). A Gryllus bimaculatus porral kezelt csoport dózisfüggő megmentését mutatta be ezen markerek szintjén, megmutatva, hogy a Gryllus bimaculatus por glükózcsökkentő hatással bír a T1D patkány modellben.

3.2. A Gryllus bimaculatus por hatása a glükóz- és inzulin-tolerancia állapotokra

A csökkent glükóz tolerancia (IGT) a hiperglikémia prediabetikus állapota, amely az inzulinrezisztenciával társul. A kísérlet utolsó hetében glükóz tolerancia tesztet hajtottak végre a patkányokon az inzulinérzékenység értékelésére. Amint a 2a., 2a. Ábra mutatja, a glükóz tolerancia romlott az STZ által kiváltott cukorbetegségben, de ezt a károsodást jelentősen megmentették a Gryllus bimaculatus porral kezelt csoportban. Az inzulinérzékenység Gryllus bimaculatus por jelenlétében történő meghatározásához külön inzulin tolerancia tesztet alkalmaztunk a modellre. A várakozásoknak megfelelően a Gryllus bimaculatus porral történő kezelés fokozta az inzulinérzékenységet az STZ által kiváltott diabétesz modellben (ábra (2. ábra 2 b).

3.3. A Gryllus bimaculatus por hatása a hasnyálmirigy működésére és morfológiájára

A patkányok hasnyálmirigy szöveteiben bekövetkezett hisztopatológiai változásokat megvizsgáltuk, hogy megerősítsük a Gryllus bimaculatus por hasnyálmirigy működésére és morfológiájára gyakorolt hatását. A degeneratív és nekrotikus változásokat, valamint a Langerhans-szigetek zsugorodását figyelték meg a hasnyálmirigy szöveteinek szövettani metszeteiben az STZ-indukálta cukorbetegség csoportjából (ábra (3a. Ábra, 3a, fent). A Gryllus bimaculatus por azonban enyhítette ezt a károsodást., különösen a legmagasabb dózisnál (6,5 g/kg), és egyértelmű gyógyulást váltott ki az STZ által kiváltott cukorbetegségben. Ezenkívül a hasnyálmirigy szöveteinek immunhisztokémiai festésénél egyértelműen megfigyelhető volt az inzulin expressziójának porfüggő csökkenése (ábra Az inzulin festés intenzitását kvantifikáltuk (ábra (3b. Ábra) 3 b), és azt javasolta, hogy a Gryllus bimaculatus por megőrizze a hasnyálmirigy β-sejtjeinek működését és fenntartsa a hasnyálmirigy szerkezetét.

3.4. A Gryllus bimaculatus por hatása a hasnyálmirigy károsodására, amelyet STZ okozta cukorbetegség okoz

Megvizsgáltuk, hogy a Gryllus bimaculatus por hogyan szabályozza a β-sejtek replikációját és a túlélést STZ által kiváltott cukorbetegségben. A Gryllus bimaculatus pornak a hasnyálmirigy apoptózis-útjára gyakorolt hatásának vizsgálatához immunoblot-vizsgálatot végeztünk a proapoptotikus Bax és antiapoptotikus Bcl2 fehérjék expressziójának megerősítésére (Yoo & Park, 2018; Zhang et al., 2014). A Gryllus bimaculatus porkezelés fokozott Bcl2 expressziót, csökkent BAX expressziót és a kaszpáz 3 hasításának gátlását eredményezte az STZ által kiváltott diabetes csoportban (ábra (4a. Ábra). 4a). A kvantifikációs elemzés kimutatta a Gryllus bimaculatus por antiapoptotikus szerepét az STZ-indukálta cukorbetegség hasnyálmirigyében (ábra (4b – d. Ábra). 4 b – d). Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a Gryllus bimaculatus por hasnyálmirigy-funkcióval és morfológiai változásokkal szembeni hatása jól korrelál az anti- és proapoptotikus fehérje expressziós mintázatával.

4. KÖVETKEZTETÉSEK

Ebben a tanulmányban a Gryllus bimaculatus pornak jótékony hatásai voltak a T1D ellen, amint ezt egy streptozotocin (STZ) által indukált diabétesz patkány modell eredményei bizonyítják. Ennek a rovarkivonatnak a beadása jelentősen megmentette a cukorbetegségben fellépő csökkent C-peptid és inzulin válaszokat. Ezenkívül az antiapoptotikus Bcl2 fehérje, a Bax proapoptotikus fehérjék és a hasított kaszpáz 3 dózisfüggő módon helyreálltak kontroll szintre. A Gryllus bimaculatus por szabályozta az mTORC1-et, a tápanyag-érzékelés és a sejtnövekedés fő vezérlőjét, amelyet a Gryllus bimaculatus por által kiváltott glükózszint-csökkentő hatás mechanizmusaként javasolunk ebben a modellben. Ebben a tanulmányban a Gryllus bimaculatus por hatékony természetes funkcionális élelmiszer, amely STZ-indukált cukorbetegségben glükózcsökkentő hatást mutat.

ÉRDEKLŐDÉSEK

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek összeférhetetlenségük.

ETIKAI JÓVÁHAGYÁS

Minden állatkísérletet a Chonbuki Nemzeti Egyetemi Kórház Nemzetközi Laboratóriumi Állatgondozás Értékeléséért és Akkreditálásáért Egyesület (AAALAC) laboratóriumi állatgondozási elveivel összhangban hajtottak végre (jóváhagyási szám: cuh ‐ IACUC ‐ 2017–21), és azokat az AAALAC 2017. november 8-án (cuh ‐ IACUC ‐ 170316–6).

Segítő információ

ELISMERÉS

Ezt a tanulmányt az Koreai Koreai Nemzeti Élelmiszer Klaszter (AnFC), Koreai Köztársaság együttműködési kutatás-fejlesztési programja (2017) támogatta.

Megjegyzések

Park S-A, Lee G-H, Lee H-Y, Hoang T-H, Chae H-J. A Gryllus bimaculatus por glükózszint-csökkentő hatása a sztreptozotocin által kiváltott cukorbetegségre az AKT/mTOR útvonalon keresztül. Élelmiszer Sci Nutr. 2020; 8: 402–409. 10.1002/fsn3.1323 [CrossRef] [Google Tudós]

Finanszírozási információk

Ezt a tanulmányt a Koreai Koreai Nemzeti Élelmiszer Klaszter Ügynökség (AnFC) együttműködésének K + F programja (2017) támogatta.