A gyermekkori elhízás összefügg a szérum metabolit profil változásával

Dr. Rui Wang-Sattler

profiljának

Molekuláris Epidemiológiai Intézet

Helmholtz Zentrum München, Német Környezet-egészségügyi Kutatóközpont

Ingolstädter Landstraße 1, 85764 Neuherberg (Németország)

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • Email

Absztrakt

Bevezetés

Az elmúlt három évtizedben világszerte drámai módon nőtt a gyermekkori elhízás előfordulása [1]. A kiváltó ok a hajlamosító genetikai tényezők és a környezeti tényezők, például a táplálkozási szokások változása közötti összetett kölcsönhatás [2, 3]. Ez a tendencia nagy aggodalomra ad okot, figyelembe véve az elhízásnak a gyermekek egészségére gyakorolt ​​sokféle következményét. Ide tartoznak az olyan anyagcserezavarok, mint az inzulinrezisztencia, a dyslipidaemia és a magas vérnyomás, amelyek viszont elősegítik a szív- és érrendszeri betegségek kialakulását gyermekkorban és későbbi életükben is [2, 4]. .

A megfelelő kezelési stratégiák kidolgozása érdekében elkerülhetetlen az elhízással kapcsolatos patofiziológiai mechanizmusok jó megértése. Az elmúlt években fejlett laboratóriumi technikákat és adatfeldolgozó eszközöket fejlesztettek ki, amelyek lehetővé teszik a metabolitok nagyszámú, egyidejű vizsgálatát az emberi biofolyadékokban vagy szövetekben [5–7]. Az emberi szérum metabolitprofilja tükrözi az anyagcsere folyamatokat, beleértve a betegséggel kapcsolatos változásokat is [8]. Ezért az elhízott gyermekek szérum metabolit-koncentrációinak vizsgálata új betekintést nyújthat a gyermekkori elhízáshoz kapcsolódó biológiai mechanizmusokba. Kevés tanulmány vizsgálta már az elhízással összefüggő változásokat a szérum metabolomjában felnőtteknél [9–12] és serdülőknél [13]. .

Jelen tanulmányunkban célzott metabolomikai megközelítést alkalmaztunk a gyermekkori elhízáshoz kapcsolódó szérum metabolitok azonosítására. Ennek a vizsgálatnak a legfontosabb célkitűzései: i) annak vizsgálata, hogy a szérum metabolitok koncentrációprofilja különbözött-e az elhízott és a normál testsúlyú gyermekek között, ii) az elhízással összefüggő metabolit biomarkerek azonosítása, és iii) a pubertás szakasz és a metabolit profilja.

Anyag és módszerek

A populáció és az antropometriai mérések tanulmányozása

A 2008–2009-es években 80 elhízott 6–15 éves gyermeket és serdülőt követtek el a németországi Vestische Kinder- und Jugendklinik Datteln németországi elhízás miatt járó ambulancián, valamint 40 normál testsúlyú, hasonló életkorú és nemi megoszlású gyermeket. Minden gyermek Németországban született. A szindrómás elhízásban szenvedő gyermekeket, valamint a pszichiátriai vagy endokrin rendellenességeket, beleértve a 2-es típusú cukorbetegséget, kizárták. A Witten/Herdecke Egyetem Etikai Bizottsága jóváhagyta ezt a tanulmányt. Írásbeli tájékozott beleegyezést kaptak minden alany és szüleik.

A magasságot centiméteres pontossággal mértük merev stadiométerrel. A levetkőzött súlyt 0,1 kg pontossággal mértük kalibrált mérleg segítségével. Az elhízást BMI-ként határozták meg a német népesség-specifikus adatok 97. percentilisénél [14]. Minden elhízott gyermek megfelelt az elhízás nemzetközi munkacsoportjának elhízási kritériumainak, meghaladva a populáció-, életkor- és nemspecifikus percentilis értéket, ami 18 éves korában 30 kg/m 2 BMI-értéket jelent [15]. A BMI-percentiliseket és a standard deviációs pontszámokat (SDS-BMI) Cole LMS-módszere alapján számoltuk [16]. A pubertás stádiumot Marshall és Tanner [17,18] szerint értékelték, és a szeméremszőrzet és a nemi szervek stádiumai alapján három szakaszba sorolták: prepubertalis = szeméremszőrű I. és ivarmirigy/emlő I. stádiumú fiúk/lányok, pubertális = fiúk/lányok szeméremszőrzet stádium ≥ II és ivarmirigy/emlő stádium ≥ II és késői/posztpubertus = fiúk hangváltással és lányok menarche-val.

Mintavétel és metabolit mérés

A vérmintákat reggel 8 órakor vettük, éjszakai éhezés után legalább 10 órán át. Szobahőmérsékleten történő koagulálást követően a vérmintákat 10 percig, 8000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. Az alikvot részeket tartalmazó szérummintákat –80 ° C-on tároltuk és szobahőmérsékleten felolvasztottuk a metabolomikai vizsgálat céljából.

Az Absolute metabolomikát használtukIDQ™ p150 készlet (Biocrates Life Sciences AG, Innsbruck, Ausztria) 163 metabolit mennyiségi meghatározásához, a gyártó kézikönyvében leírt utasítások betartásával. A szérumminták folyékony kezelését egy Hamilton Micro Lab Star robottal (Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Svájc) végeztük. A mintákat egy API4000 LC/MS/MS rendszeren (AB Sciex Deutschland GmbH, Darmstadt, Németország) elemeztük, amely HTC PAL automatikus mintavevővel (CTC Analytics, Zwingen, Svájc) és egy elektrospray ionizációs (ESI) forrással volt felszerelve. és negatív mód. Az MS/MS elemzést többszörös reakciófigyelés (MRM) módban futtattuk. A teljes analitikai folyamatot az Analyst 1.4 szoftver és a MetIQ ™ szoftvercsomag vezérelte, ez utóbbi az Absolute szerves részeIDQ készlet. A metabolitkoncentrációkat a MetIQ szoftverrel határoztuk meg.

A méréseket két külön tételben végezték. Az adatminőség felmérése érdekében az első tétel mintáinak 43-át a másodikban mérték át. Ezenkívül egy referencia mintát ötször mértünk a két tétel mindegyikén. Kizártuk az elemzésből azokat a metabolitokat, amelyek nem feleltek meg az alábbi minőségi kritériumok közül kettőnek vagy többnek:

i) A metabolit koncentrációjának a minták legalább 60% -ában felül kell lennie a gyártó által meghatározott kimutatási határon (LOD).

ii) A Pearson-féle metabolit-koncentráció korrelációs együtthatójának a 43 ismételten mért mintában legalább 0,5-nek kell lennie a két tétel között.

iii) Minden tételnél a referencia minták metabolit-koncentrációjának variációs együtthatója (CV) nem lehet magasabb 0,2-nél.

Összesen 130 metabolit ment át a minőségellenőrzésen. A 33 kizárt metabolit nagy részét a LOD alatti vagy kismértékben meghaladó koncentrációk jellemezték. Ennek következtében ezekben az esetekben a mérési stabilitást feltételezhetően befolyásolták. A készlet utasításának megfelelően az összes mérést szoroztuk egy metabolit- és kötegspecifikus korrekciós tényezővel, hogy tovább korrigáljuk a lehetséges szakaszos hatást.

Az alkalmazott készlet által megcélzott metabolit spektrumot az 1. kiegészítő táblázat mutatja (lásd a kiegészítő anyagot). Az elemzésünkben szereplő 130 metabolit 24 konjugált karnitint (acilkarnitint (Cx: y), hidroxilacilkarnitint (C (OH) x: y) és dikarboxilacilkarnitint (Cx: y-DC), szabad karnitint (C0), 14 aminosavat, hexózt) tartalmazott (H1), 32 diacil-foszfatidilkolin (PC aa Cx: y), 35 acil-alkil-foszfatidil-kolin (PC ae Cx: y), 9 lizofoszfatidil-kolin (LPC a Cx: y), valamint 14 szfingomielin (SM Cx: y) és hidroxiszfingomielinek (SM (OH) Cx: y), ahol Cx: y rövidíti a lipid oldallánc összetételét, x és y a szénatomok és kettős kötések számát jelöli. Megjegyzendő, hogy az itt alkalmazott analitikai technika nem képes meghatározva a kettős kötések pontos helyzetét és - PC-k esetén - a szénatomok eloszlását a két zsírsav melléklánc között. Minden metabolit-koncentrációt µmol/l-ben adunk meg. A következőkben a metabolit-koncentrációkat egyszerűen csak metabolitokra, és a metabolit koncentráció arányokra, mint metabolit arányokra.

Statisztikai analízis

Minden számítást statisztikai környezetben végeztünk R, 2.10.1 verzió [19]. Az elhízott és normál testsúlyú gyermekek antropometriai jellemzőit összehasonlították Wilcoxon jel-rangú és Pearson khi-négyzet tesztjeivel.

Az elhízott és normál testsúlyú gyermekek, valamint a különböző pubertás stádiumú gyermekek szérum metabolit profiljának szétválasztásának mértékének vizsgálatához 10-szeres keresztellenőrzéssel végeztük a Partial Least Squares (PLS) elemzést a skálázott és központosított mátrixon. metabolitkoncentrációk a R csomag pls [20]. Az adatokat úgy ábrázoltuk, hogy az első két komponens kereszt-validált pontszámát ábrázoltuk egy pontszámdiagramon, ahol minden egyes pont egy-egy szérum mintát jelent.

Annak megállapítására, hogy az egyetlen metabolit koncentrációja különbözött-e az elhízott és a normál testsúlyú gyermekek között, logisztikai regressziós elemzéseket végeztünk, súlyállapot (elhízott vagy normál testsúly) függő változóként, és az egyes metabolitkoncentrációk természetes logaritmusa, valamint a kovariánsok életkora, neme, és a pubertás szakasz, mint független változók. Hasonló elemzést végeztek a pubertás stádium (prepubertalis vs. pubertális/posztpubertális) és a metabolitkoncentrációk közötti összefüggések vizsgálatára, az életkor és a nem, valamint csak a nem alapján.

Egy következő lépésben megismételtük az elhízás elemzését az összes lehetséges metabolitpár arányával, lehetővé téve az elhízott és a normál testsúlyú gyermekek közötti különbségek felfedezését, amelyeket egyébként az egyetlen metabolitkoncentráció nagy csoporton belüli változékonysága takar [ 21,22]. Ezenkívül a metabolit arányok változása tükrözheti a biológiai helyzeteket, például az enzimaktivitások változását vagy a metabolikus utak egyensúlyhiányát. Valamennyi regressziós elemzés esetében egy kísérletenként 0,05-es I típusú hibát tekintettünk statisztikailag szignifikánsnak. A Bonferroni korrekcióval végzett többszörös tesztelésre adott korrekció szignifikanciaszintet eredményezett: p = 0,05/130 = 3,8 × 10 –4, illetve p = 0,05/8 385 = 6,0 × 10 –6 az egyes metabolitok és a metabolitok arányában. A metabolit arányok esetén kiszámítottuk a p nyereséget, amelyet az egyetlen metabolit elemzés két p értékének minimumaként határozunk meg osztva a metabolit arány p értékével [21]. Minél nagyobb a p nyereség egy metabolit aránynál, annál inkább a metabolit arány alacsony p értéke az arány változásának köszönhető, nem pedig az egyedüli egyetlen metabolit egyikének erőteljes változásának. Ebben a tanulmányban a metabolit arányokra összpontosítottunk, amelynek p gyarapodása legalább 1,0 × 10 3 volt .

Eredmények

A vizsgálati populáció jellemzői

A gyermekek antropometriai jellemzőit az 1. táblázat mutatja be. Az elhízott és normál testsúlyú gyermekek nem különböztek szignifikánsan a nem, az életkor és a pubertás szakasz eloszlása ​​tekintetében. Tervezésük szerint a testtömeg, a BMI és az SDS-BMI szignifikánsan magasabb volt az elhízott gyermekek csoportjában (p –6), és p növekedési határértéket alkalmaztak ≥ 1,0 × 10 3 értéknél (3. kiegészítő táblázat; lásd a kiegészítő anyagot). A kiválasztott reprezentatív arányok eredményeit a 3. táblázat mutatja. A telített és telítetlen LPC-k, a telített LPC-k és a PC-k, valamint az SM-k és a PC-k közötti arány elhízottaknál nőtt a normál testsúlyú gyermekeknél. Például az LPC a C18: 0/LPC a C20: 4 arány elhízott csoportjába való szorzók aránya 8,4 (4,1, 20,1) volt, ap értéke 1,1 × 10 –7 és ap nyeresége 1,1 × 10 3 .

3. táblázat

A metabolitkoncentráció arányának kiválasztása jelentősen különbözik a normál testsúlyú és az elhízott gyermekek között

Vita

Ez a tanulmány szisztematikus metabolomikai megközelítésben hasonlította össze az elhízott és normál testsúlyú gyermekek szérum metabolit-koncentrációit. 14 metabolit és 69 metabolit arány szignifikánsan különbözött az elhízottaktól a normál testsúlyú gyermekekhez képest.

Az elhízással járó metabolit változások

Jelentősen csökkent glutamin-, metionin- és prolin-koncentrációt találtunk elhízottaknál a normál testsúlyú gyermekekéhez képest. Így megismételtük egy korábbi tanulmány eredményeit, amelyek szerint a rendkívül elhízott gyermekeknél csökkent a metionin és a prolin szintje [28]. Tudomásunk szerint egyetlen elhízott gyermekről szóló tanulmány sem mutatta a glutamin csökkenését. Más vizsgálatok eredményei azonban a hexosamin-útvonal elhízással összefüggő aktivációja felé mutatnak [29,30,31]. A glükózamin és a hexozaminokról ismert, hogy hozzájárulnak az inzulinrezisztencia kialakulásához [29,32]. Ezenkívül a hexosamin útvonal aktiválása csökkenti az energiafelhasználást [30].

Vizsgálatunk megerősítette, hogy az acil-alkil PC koncentrációja elhízott állapotban szignifikánsan alacsonyabb [10]. Az acil-alkil PC-k egy alosztálya az úgynevezett plazmalogén, amelyek antioxidáns tulajdonságokkal rendelkeznek [33]. Az elhízott gyermekeknél megfigyelt acil-alkil PC-k csökkenése tükrözheti a plazmalogének oxidatív stressz alatti fogyasztását, amelyről ismert, hogy szerepet játszik a gyermekkori elhízásban [34].

Jelentősen megnövekedett arányokat figyeltünk meg a telített LPC-k (C16: 0, C18: 0) és a PC-k között elhízott gyermekeknél. A telített LPC koncentrációk szintén kismértékben növekedtek. Az LPC-k PC-kből származnak az LDL oxidációja során vagy a lecitin-koleszterin-aciltranszferáz (LCAT), vagy a lipoproteinhez társított foszfolipáz A2 (LpPLA2) útján keresztül [35]. Valójában az elhízott gyermekeknél az LpPLA2 aktivitás növekedését jelentették [36]. Az oxidált LDL fő összetevőjeként a telített LPC-k pro-aterogén és gyulladáscsökkentő hatást fejtenek ki, és rontják az inzulin szignalizációt [35,37].

Az elhízott gyermekek a telítetlen LPC-k szignifikánsan csökkent koncentrációját mutatták (C18: 1, C18: 2 és C20: 4). Továbbá a telített és telítetlen LPC-k aránya jelentősen megnőtt. Eredményeink összhangban vannak egy nemrégiben elvégzett metabolomikai vizsgálattal túlsúlyos/elhízott és normál testsúlyú férfiaknál, amelyek szignifikánsan csökkent LPC C18: 1 koncentrációt és megnövekedett LPC C18: 0 koncentrációt mutatnak, az étrendi többszörösen telítetlen és telített zsírsav bevitel csökkent arányával együtt [ 12]. Az a feltételezés, hogy a szérum (lizo-) foszfolipidek zsírsavösszetétele részben tükrözi az egyén középtávú étrendi zsírsav bevitelét, támasztja alá az étrendi és a plazma foszfolipid zsírsavak közölt összefüggései [38,39]. Eddig kevés bizonyíték van arra, hogy a gyermekkori elhízás kockázata szerepet játszik-e a speciális étrendi jellemzőkben, beleértve a zsírsavegyensúlyt is [40].

Megfigyelésünk, hogy az SM/PC arány szignifikánsan megnőtt az elhízott gyermekeknél, a szfingomielin-szintáz (SMS) reakció megnövekedett sebességét tükrözheti [41]. Nem figyeltünk meg szignifikáns növekedést az egyes SM koncentrációkban. Ez az SM szintézisének és anyagcseréjének egyensúlyát ábrázolhatja. A szintetizált SM-eket szfingomielináz (SMase) révén azonnal hidrolízisnek vetik alá, így ceramidok keletkeznek, amelyekről kimutatták, hogy szerepet játszanak az inzulinrezisztencia és a szív- és érrendszeri rendellenességek kialakulásában [42,43].

Pubertális szakasz szubanalízis

Vizsgálatunkban a pubertás stádium nem társult a szérum metabolit koncentrációival. Tudomásunk szerint nincs olyan tanulmány, amely hasonló módon vizsgálta a metabolitok és a pubertás stádium közötti kapcsolatot, ami megnehezítette az eredményeink közvetlen összehasonlítását. A pubertás szakasz keresztmetszeti és longitudinális vizsgálata egyaránt jelzi az inzulinérzékenység csökkenését a pubertás fejlődés során, amely fokozott zsírsav-oxidációval jár együtt [51,52]. Továbbá a pubertás alatt csökkent proteolízisről és fehérje oxidációról számoltak be az elő pubertáshoz képest [53]. Az a tény, hogy nem figyeltük meg a pubertás stádiumhoz kapcsolódó változásokat a szérum acilkarnitin- vagy aminosav-koncentrációiban, azt jelezheti, hogy ezek a változások fiziológiai és kompenzálható tartományon belül jelentkeznek, vagy ezeket a tanulmányban megcélzott metabolit panel nem rögzíti.

Összehasonlítás a felnőttkori vizsgálatokkal

A felnőttek és gyermekek adatait nehéz összehasonlítani, mivel a növekedés hatással lehet az anyagcserére. Mégis érdekes látni, hogy az elhízással kapcsolatos metabolomikus változások következetesek és következetlenek. Az elhízással összefüggő acilkarnitin, acil-alkil PC, LPC és SM koncentrációk változásainak megállapításai jórészt összhangban vannak a felnőtteken végzett korábbi vizsgálatokkal [9,10,12,44,45]. Ezzel szemben az elhízott gyermekek vizsgálatában az aminosavkoncentrációkra vonatkozó eredmények eltérnek a felnőttek eredményeitől. Például az elágazó láncú aminosavak (BCAA-k) és a kapcsolódó metabolitok következetesen megnövekedtek az elhízottaknál a sovány felnőttekhez képest [11,12,46,47,48], míg mi és Mihalik et al. [13] nem figyelték meg ugyanezt a gyermekeknél. Felnőtteknél az elhízott és inzulinrezisztens alanyoknál a megnövekedett BCAA-szintek egyik javasolt mechanizmusa a zsírszövet BCAA-oxidációjának csökkenése [49,50]. Mihalik et al. [13], a gyermekek korai adaptív mechanizmusokat mutathatnak be, amelyek megőrzik a normális BCAA anyagcserét elhízás és zavart inzulinérzékenység jelenlétében.

Erősségek és korlátozások

Vizsgálatunknak vannak bizonyos korlátai. Mintamérete csak mérsékelt volt, így a tanulmány alulteljesítette a kisebb hatások kimutatását. Ezenkívül keresztmetszeti tanulmányként nem teszi lehetővé, hogy a súlycsoportok közötti megfigyelt különbségekből következtetéseket vonjunk le. Ebben a tekintetben a longitudinális és az intervenciós vizsgálatok további betekintést nyújthatnak. Ezenkívül hiányoznak a gyermekek étrendjével és fizikai aktivitásával kapcsolatos információk. Azonban a nagyon nagy mérési hibával rendelkező kérdőívek használatával ellentétben a szérum metabolitkoncentráció valószínűleg megbízhatóbb helyettesítője az étrendi bevitelnek.

Vizsgálatunk erőssége, hogy szisztematikus metabolomikai megközelítést alkalmaztunk, hogy összehasonlítsuk az elhízott gyermekek szérum metabolomáját a normál testsúlyú gyermekekével. Ezenkívül a gyermekeknél végzett metabolomika vizsgálata nagyobb és különösen „igazabb” hatásokat eredményezhet, mint felnőtteknél, mivel a gyermekek általában nem szenvednek más betegségektől, nem szednek gyógyszereket vagy dohányoznak - olyan tényezők, amelyek befolyásolhatják a metabolit koncentrációját [5].

Összefoglalva, adataink bizonyítékot szolgáltatnak a gyermekek szérum metabolit profiljának elhízással összefüggő változásaira. Nagyobb vizsgálatokban az azonosított metabolitok és a metabolit arányok potenciális biomarkereknek tekinthetők az elhízással kapcsolatos patofiziológiai folyamatok új hipotéziseinek generálásakor.

Köszönetnyilvánítás

Őszinte köszönetünket fejezzük ki a vizsgálat résztvevőinek, valamint szüleiknek. Hálásak vagyunk Petra Nicklowitznak a biokémiai mérések elvégzéséért. Köszönetet mondunk Julia Scarpának, Katharina Sckellnek és Arsin Sabunchinak a metabolomikai mérésekért, amelyeket a Helmholtz Zentrum München, Genomelemző Központ, Metabolomics Core Facility területén végeztek. Továbbá köszönjük Anja Kleinschmidt, Janina Ried és Ann-Kristin Petersen észrevételeit, megbeszéléseit és javaslatait.

Finanszírozás

Ezt a munkát a német szövetségi oktatási és kutatási minisztérium (BMBF) alábbi támogatásai támogatták: az Országos Genomkutató Hálózat 01GS0820 számú támogatása, NGFNplus, az elhízás kompetencia hálózat elhízás (LARGE) 01 GI0839 számú támogatása, az FKZ 0315494A támogatás a Metabotypes rendszerbiológia projekt, a SysMBo és a Gani Med projekt 03IS206IB számú száma a WRM-nek és a Német Diabéteszkutató Központnak (DZD eV). Ezt tovább támogatta a Witten/Herdecke Egyetem és a Helmholtz Zentrum München finanszírozása. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Közzétételi nyilatkozat

Minden szerző kijelenti, hogy nincs összeférhetetlenség.