A gyógyszeres étrend hatása a Helicobacter spp. a növekedésről, a patológiáról és a fertőzés állapotáról a Rag1 -/- és a meztelen egerekben

Absztrakt

A Helicobacter-asszociált gyomor-bélrendszeri betegségeket egerekben két évtizede jelentő dokumentumok ellenére a fertőzések továbbra is széles körben fennmaradnak nemcsak az Egyesült Államok tudományos intézményeiben, hanem a világ más régióiban működő kereskedelmi forgalmazóknál is. 1., 3., 31., 44. A tudományos környezetben az egészségügyi monitoring és a kirekesztési politikák jelentősen eltérnek az egyetemeken, sőt egyetlen intézmény különböző állattartó létesítményein belül is. Ezek a politikák gyakran pénzügyi tényezőkön alapulnak (a PCR-szűrés költségei és a fertőzött állatok újratermeléséhez szükséges erőforrások), valamint a Helicobacter-fertőzéseknek a kutatás megzavarására való lehetősége mellett.

A fertőzés kutatásra gyakorolt általános hatásának megjóslása szintén problematikus lehet. A gasztrointesztinális patológia kialakulása és súlyossága jelentősen változhat az egér törzse, a Helicobacter fajok és a betegség modellje szerint. Néhány egértörzs, köztük A/JCr, BALB/cAnNCr, C3H/HeNCr és SJL/NCr, különösen fogékonyak és jelentős súlyosságú krónikus enterohepatikus betegségeket fejlesztenek ki. 19, 21, 30, 49, 50 Ezenkívül számos immunhiányos egér törzs súlyos krónikus fertőzés után súlyos betegségben szenved. A C.B-17/Icr-Prkdc scid (SCID/NCr) egerekben, amelyekből hiányzik a funkcionális T- és B-sejt, progresszív hepatitis és proliferatív typhlocolitis alakul ki a H. hepaticus természetes fertőzése után. 30 IL10 -/- egér, például a B6.129P2-IL-10 t m1Cgn/J súlyos typhlocolitis alakul ki több Helicobacter spp. Fertőzés után. 51, 52 Az immunkompetens törzsekkel ellentétben az immunhiányos egerek klinikai tüneteket mutathatnak, mint például hasmenés, perianalis vérzés és változó súlyosságú végbél prolapsus. 18., 29., 51

A Helicobacter fajok befolyásolják a betegség súlyosságát. Bár a H. hepaticus továbbra is a legjobban tanulmányozott enterohepatikus egérfaj, más, szoros rokonságban lévő Helicobacter spp. emésztőrendszeri betegséget is eredményeznek. 15, 31 A H. typhloniusszal végzett természetes és kísérleti monoinfekció typhlocolitishez vezetett C57BL/6J IL-10 -/- és SCID/NCr egerekben. 18, 22, 23 A H. mastomyrinus fertőzés a telomerázhiányos C57BL/6J egerekben granulomatous typhlocolitishez (gyulladásos bélbetegség, IBD) vezetett a kritikus korai öregedési vizsgálatok során. 15 Érdekes módon a gasztrointesztinális betegség szignifikánsan súlyosabb volt a H. mastomyrinus fertőzött egerekben, mint a H. hepaticus fertőzöttekben. 15

Ezenkívül a Helicobacter fertőzések kutatási hatása a betegség modelljétől függően változik a komplex dinamikában, amely a gazda gyomor-bél immunitása, a mikroflóra, az étrend és a környezeti feltételek közötti kölcsönhatásokból származik. Az IBD egérmodelljei kiemelik ezeket a bonyolultságokat. Helicobacter spp. Megállapították, hogy a genetikai módosítás helyett a fertőzés felelős az IBD fejlődésének fogékonyságáért és mintázatáért a T-sejt receptor αβ mutáns egerekben. 6, 10 Szándékos oltást alkalmaztak a Helicobacter spp.-hez kapcsolódó rezidens bél mikroflóra változásainak, valamint az IBD indukciójának és súlyosságának vizsgálatához immunhiányos egerekben. 51

Az enzootikus Helicobacter spp. fertőzések. 1, 46 Ez a technika kevésbé költséges és munkaigényes, és kevesebb szakértelmet igényel, mint az embriótranszfer. 1, 42, 46 Egy tanulmány összehasonlította a Helicobacter spp., Az egér norovírus, az egér hepatitis vírus és a Syphacia obvelata kiküszöbölésére szolgáló két kereszt-elősegítő paradigmát. Megállapították, hogy a siker mind a kölyök életkorától, mind az ágyneműváltási szokásoktól függ. 1 A szüléstől számított 24 órán belül áthelyezett kölykök olyan ketrecekből, amelyek 24 óránként átestek az ágyneműcserén, gyakrabban negatív eredményt adtak, mint a kölykök, akik a születéstől számított 48 órán belül kerültek át a legfeljebb 7 d éves koszos ágyneműt tartalmazó ketrecekből. 1 Azonban egyik paradigma sem volt teljesen sikeres a Helicobacter eliminációban, amit a keresztes nevelésű utódok utólagos PCR-vizsgálata is bizonyít. 1 Ezenkívül a H. hepaticus izolálása számos késői stádiumú C.B-17/Icr-Prkdc scid (SCID/NCr) embrió zsigereiből, amelyek egy fertőzött gáthoz tartoznak, arra utal, hogy transzplacentáris átvitel lehetséges immunhiányos egerekben. 30

Bár egy újabb gyógyszeres étrend, amely amoxicillint, klaritromicint, metronidazolt és omeprazolt tartalmaz, egy évtizede áll rendelkezésre, a hatékonyságról szóló jelentések még mindig meglehetősen korlátozottak. Egy tanulmány kimutatta a H. hepaticus és a H. bilis sikeres felszámolását 129 × 1/SvJ desmin-null és heterozigóta egerek telepéből 8 hét folyamatos kezelés és 19 hónap PCR utóvizsgálat után. 28 Ezenkívül a 4 gyógyszeres terápia sikeres volt a Helicobacter spp. több genetikailag módosított patkánytörzsből, ahol a fertőzött hím patkányokat 3-két hetes ciklusokon keresztül gyógykezelték, és a vemhes patkány-anyákat és utódokat a vemhesség 7. napjától az elválasztásig folyamatosan etették. A kezelés utáni utóvizsgálata 8 hónapon keresztül széklet PCR-rel megerősítette, hogy az összes kezelt patkány negatív maradt. 26 Újabban beszámoltunk a H. hepaticus, a H. bilis és a H. rodentium sikeres felszámolásáról 2 egér törzsből, amelynek veleszületett immunhiánya volt. 9.

Anyagok és metódusok

Helicobacter-fertőzött egerek generálása.

Ház.

Az egereket AAALAC által akkreditált létesítményben helyezték el, a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatónak 25 megfelelően, és az eljárásokat a Johns Hopkins IACUC (Baltimore, MD) hagyta jóvá. Az egereket egyetlen pamut fészkelő négyzettel helyeztük el egyedileg szellőztetett ketrecekben (Allentown Caging Equipment, Allentown, NJ), kukoricacsutkával (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) összeszerelve, és egységként autoklávban. Minden egyes ketrecbe besugárzott takarmányt adtunk ezt követően egy szűrt levegő-váltó állomáson (Lab Products, Seaford, DE) klór-dioxid-alapú fertőtlenítőszer alkalmazásával (100 ppm, Vimoba, Quip Laboratories, Wilmington, DE). Valamennyi egér reverz ozmózissal kezelt vizet kapott egy ketrecben lévő automatizált öntözőrendszer (Rees Scientific, Trenton, NJ) segítségével. Ketreccserék történtek 2 hetes cikluson keresztül a szűrt levegő-cserélő állomásokon (Lab Products) klór-dioxid-alapú fertőtlenítőszer (100 ppm, Vimoba) és elővigyázatossági intézkedések alkalmazásával, beleértve a kesztyű cseréjét a ketrecek között a keresztszennyeződés megelőzése érdekében. fertőtlenítőszer bőséges permetezése a csereállomáson, a ketreceken kívül és a kesztyűs kezeken.

Egészségügyi felügyelet.

Az összes vizsgált egeret, valamint a tenyésztéshez használt egereket szennyezett ágyú őrszemek alkalmazásával követtük nyomon, amelyek mentesek maradtak a Sendai vírustól, az egerek tüdőgyulladásától, az egér hepatitisz vírusától, az egér perc vírusától, az egér 1. és 2. parvovírusától, a Theiler egértől. encephalomyelitis vírus, reovírus, csecsemő egerek epizootikus hasmenése, limfocita choriomeningitis vírus, ectromelia vírus, egér adenovírus, egér citomegalovírus, Mycoplasma pulmonis, szőr atka és pinworms.

Tanulmányi csoportok.

Helicobacter-pozitív meztelen és Rag1 egereket (életkor: 7 hét) véletlenszerűen osztottak be akár kísérleti, akár kontroll csoportba (6–8 hím egér és 6–8 nőstény egér minden csoportban), hogy 8 hét gyógyhatású étrendet, 8 hét kontrollt kapjanak. diéta, 8 hét gyógyszeres étrend, majd 8 hét kontroll étrend, 16 hét gyógyszeres étrend vagy 16 hét kontroll étrend. Ugyanazokat a kísérleti és kontroll csoportokat hoztuk létre a Helicobacter-negatív egereknél.

Diéta és etetési protokoll.

A kontroll étrend egy 5 g-os, besugárzott és táplálkozási szempontból teljes szemcsés alapú, szalonnával ízesített tablettából állt (termékszám: S05072, BioServ, Frenchtown, NJ). A gyógyszeres étrend ugyanolyan étrend volt, 3,0 mg amoxicillint, 0,5 mg klaritromicint, 1,0 mg metronidazolt és 0,02 mg omeprazolt adva minden 5 g-os tablettához (termékszám: S05723, Rodent Helicobacter MD Four-Drug Combo, BioServ). Mivel a vizsgálat során alkalmazott étrendek különböztek a létesítményben általánosan alkalmazott étrendektől, az összes egeret hozzászokták a kontroll étrendhez, amelyet ad libitum tápláltak az elválasztástól (21–23 nap) a vizsgálat megkezdéséig (7 hét).

Testtömeg felvétel.

A testtömegeket hetente (minden hét ugyanazon a napján és időpontjában) rögzítettük minden egér esetében a 8 vagy 16 hét vizsgálati időszak alatt.

Bruttó patológia.

A súlyos vagy a kórtan értékelésének teljes boncolását minden egéren elvégeztük a 8 vagy 16 hét vizsgálati időszak után. A máj, a vakbél és a teljes testtömeg dokumentálva volt. A Cecát szisztematikusan kivágtuk in situ az ileocecalis találkozásnál (proximálisan) és a proximális vastagbélnél (distalisan) közvetlenül a hasüreg megnyitásakor, a luminális tartalom minimális manipulálásával minden súlyfelvétel előtt. A szövettudományi szövetgyűjtés a májra (a bal oldalsó és középső lebeny reprezentatív része), a nyelőcsőre, a gyomorra, valamint a vékonybélre és a vastagbélre korlátozódott, mivel ezeken a szöveteken volt a legvalószínűbb a Helicobacter fertőzés vagy a gyógyszeres étrend beadása . Az összes összegyűjtött szövetet 10% -os pufferelt formalinban rögzítettük, paraffin blokkokba ágyazottuk, 5 mm vastag metszeteket készítettünk, és hematoxilinnel és eozinnal festettük a hisztopatológiai vizsgálat céljából. A nyelőcső és a gyomor további szakaszait Gram, Gomori methenamine silver és periodikus sav – Schiff foltok segítségével vizsgáltuk.

Hisztopatológia.

Helicobacter teszt.

Statisztikai analízis.

A statisztikai elemzéseket a Prism 6.0 (GraphPad, San Diego, CA) alkalmazásával végeztük. A testtömeg heti változását a fertőzöttség státusza (fertőzött és nem fertőzött) és az étrend típusa (gyógyszeres és nem gyógyszeres) szerint a 16 hetes vizsgálati időszakban összehasonlítottuk ismételt mérésekkel, kétutas ANOVA, majd posthoc Tukey többszörös összehasonlító tesztek alkalmazásával. Az étrend típusok (gyógyszeres és nem gyógyszeres) és a vizsgálat időtartamának (8 és 16 hét) közötti vakbél/test tömeg arányát kétutas ANOVA alkalmazásával, majd posthoc Tukey többszörös összehasonlító tesztekkel hasonlítottuk össze. A szövettani pontszámokat Kruskal – Wallis teszttel elemeztük nemparametrikus adatokra, majd ezt követte a Dunn többszörös összehasonlító teszt. A Helicobacter széklet PCR eredményeit statisztikailag nem hasonlítottuk össze, mert csak a 100% -os felszámolást tekintettük relevánsnak. Az elemzések eredményeit akkor tekintettük statisztikailag szignifikánsnak, ha a P érték 0,05-nél kisebb vagy egyenlő volt.

Eredmények

Klinikai egészségügyi megfigyelések.

A vizsgált egerek egyike sem mutatott semmilyen klinikai tünetet a Helicobacter fertőzéssel vagy a gyógyszeres diétás kezeléssel kapcsolatban. Enyhe végbélprolapsus fordult elő a 8 nem fertőzött hím meztelen egér közül 1-ben, akiket 8 hét gyógyszeres táplálékkal tápláltak. Sem a 8, sem a 16 hét múlva eutanizált egerek egyike sem mutatott bizonyítékot a rektális prolapsusra.

Testsúly.

Meztelen egerek.

A statisztikai elemzéseket külön végeztük hím és nőstény egerek esetében. Mivel a súly trendjei statisztikailag nem különböztek egymástól, az 1. ábra szerinti átlagos testtömeg és szórás a két nemet együttesen tükrözi. A kezdeti fertőzés állapotától függetlenül a gyógyszeres étrendben lévő hím és nőstény meztelen egerek súlya szignifikáns (P 1. ábra). Ezt követően minden egér 8 hét kontrolltáplálékkal normalizált volt, súlya normalizálódott a nem gyógyszeres kontrolljaikkal összehasonlítva a 11. hétre (1. ábra). Azok a csoportok, amelyek további 8 hétig folytatták a gyógyszeres étrendet (összesen 16 hét a gyógyszeres étrenden), a vizsgálat időtartama alatt szignifikánsan (P ≤ 0,02) könnyebbek maradtak, mint a kontroll étrendet használók (1. ábra).

A gyógyszeres étrend szignifikánsan (*, P A 2. ábra a két nemet együttesen tükrözi. A kezdeti fertőzés státuszától függetlenül a gyógyszeres táplálékkal táplált Rag1 egerek súlya szignifikáns (hím egerek, P 2. ábra). Ezt követően minden egér 8 hét kontrolltáplálékkal normalizálódott súlyában Azon csoportok, amelyek további 8 hétig folytatták a gyógyszeres étrendet (összesen 16 hét a gyógyszeres étrenden), a vizsgálat időtartama alatt szignifikánsan (P ≤ 0,02) könnyebbek maradtak, mint a kontroll étrendet használók (ábra 2).

A gyógyszeres étrend az összes Rag1 egérben jelentősen csökkentette a súlygyarapodást a 8 hét kezelés hetére. *, Szignifikáns (P A 3. ábra a két nemet együttesen tükrözi. A kezdeti fertőzés státuszától függetlenül, közvetlenül 8 vagy 16 hét gyógyszeres étrend után eutanizált egereknek szignifikánsan szignifikáns volt az aránya (P 3. ábra). A normál vakbél/testtömeg arány 8 vagy 16 hét kontroll étrendet fogyasztó egereknél, valamint 8 hét gyógyszeres étrendet fogyasztóknál 8 hét kontroll étrendet követett.

A vakbél aránya: a 8 vagy 16 héten át gyógyszeres táplálékkal táplált meztelen egerek testsúlya szignifikánsan szignifikáns volt (P A 4. ábra a két nemet tükrözi. A hím Rag1 egereknél a vakbél/testtömeg megállapítások megegyeztek a hím és a nőstény meztelen egerek (P 4. ábra B). A meztelen egerekkel és a Rag1 hím egerekkel ellentétben a Rag1 nőstény egereknek 8 hét gyógyhatású étrendet adtak, majd 8 hét kontroll étrendet továbbra is szignifikánsan (P 4. ábra A). Statisztikailag különböznek 8 vagy 16 hét gyógyszeres étrendet tápláló nőstény egerek és 8 hét gyógyszeres étrendet tápláló nőstények, majd 8 hét kontroll étrend között.

A vakbél aránya: A gyógyszeres étrendet 8 vagy 16 hétig tápláló Rag1 egerek testsúlya szignifikánsan jelentős volt (P 5. ábra). A máj, az epehólyag, a nyelőcső, a gyomor, a vékonybél és a vastagbél fennmaradó szegmensei minden elpusztított egérben rendkívül normálisnak tűntek. A máj tömege egyik törzs egyik kísérleti vagy kontroll csoportjában sem különbözött szignifikánsan.

Jelentős (P 6. B ábra). Nem állapítottunk meg szignifikáns különbséget a 8 héten át kezelt csoportok között a 16 héthez képest. Azok a csoportok, amelyek 8 hétig gyógyszeres étrendet kaptak, majd 8 héten keresztül kontroll étrendet kaptak, enyhe vagy mérsékelt nyelőcső hiperkeratózist mutattak ki (pontszám, nagyobb vagy egyenlő 1,5-2,5), amely szignifikánsan jelentős volt (P 6. A ábra). A nyelőcső és a gyomor speciális foltjai (Gram, Gomori methenamin ezüst és periodikus sav – Schiff) a gyógyszeres étrend és a kontroll csoportból nem mutattak ki organizmust. A fertőzés állapota, törzse és neme nem befolyásolta a szövettani eredményeket. A gyógyszeres egerek Ceca szövettanilag normális volt, annak ellenére, hogy a bruttó vizsgálat során jelentősen megnagyobbodott. A gyomor-bél traktus és a máj összes többi szakasza szövettanilag sem volt figyelemre méltó.

(A) Meztelen és Rag1 egerek normál nyelőcsövének szövettani megjelenése kontroll táplálékkal. (B) A nyelőcső nyálkahártyájának súlyos hiperkeratózisa (*), amelyet minden 8 vagy 16 hetes gyógyszeres táplálékkal etetett egérben találunk. A súlyosság nem különbözött a 8 és 16 hét gyógyszeres csoportok között. Hematoxilin- és eozinfolt; rúd, 50 um.

Vita

A csökkent súlygyarapodás alternatív hipotézisei összetettebbek, de kölcsönhatásokat tartalmazhatnak a bél mikrokörnyezete, az energiaegyensúly, a génexpresszió és az immunfunkció között. Az antibiotikumok megzavarhatják a biológiai folyamatokat és csökkenthetik az egészségi állapotot. 8 A testtömeg és az összetétel változásai az antibiotikumok beadása után mind az állatok, mind az emberek érdeklődésére számot tartottak. 5., 7. Noha az Egyesült Államokban még mindig bevett gyakorlat az alacsony dózisú antibiotikumok beépítése az állattakarmányba, mint növekedést elősegítő stratégia, az egerek hasonló szubterápiás antibiotikum-kezelési protokolljai nem tudták teljes mértékben megismételni ezt a jelenséget. 7 Korai kutatások svájci egerek felhasználásával az antibiotikumok és az étrendi készítmények mikroflóra hatásának tanulmányozására 11, 13, 14, 39 dokumentálták az antibiotikumok beadása után bekövetkezett csökkent súlygyarapodást, 12 de a laboratóriumi laboratóriumban mély változások történtek egerek, mivel ezeket a korábbi tanulmányokat publikálták, ami megnehezítette a közvetlen összehasonlítást a jelenlegi vizsgálatokkal.

Ez a tanulmány kimutatta a fiatal meztelen és Rag1 egerekből származó H. hepaticus és H. typhlonius sikeres felszámolását 8 hetes kezelés után amoxicillint, klaritromicint, metronidazolt és omeprazolt tartalmazó gyógyszeres étrenddel. A kezelés következményei közé tartoztak a növekedési sebesség csökkenése, a gastrooesophagealis hyperkeratosis és a vakbél megnagyobbodás, de ezek a változások nagyrészt megfordultak a normál étrendhez való visszatérés után. Ez az eredmény azt sugallja, hogy alkalmazható széles körű étrendi kezeléssel a Helicobacter fertőzések kiküszöbölésére adaptív immunhiányos egerekben.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a tanulmányt az NIH Training Grant NIH R25OD010913 támogatta, további támogatást pedig Dr. Robert J Adams és Johns Hopkins Research Animal Resources. Köszönetünket fejezzük ki mindazoknak, akik segítettek a telepek kezelésében, a mintagyűjtésben és a feldolgozásban. Köszönetet mondunk Dr. Karen M Froberg-Fejkónak (BioServ, Frenchtown, NJ) a kezelési és kontroll diéták adományozásáért. A BioServ vagy bármely tagja nem befolyásolta ezt a projektet, kivéve, ha a kezelés időtartamára a gyártó ajánlásait követte.