Az epitheliális petefészekrák kimutatása 1H-NMR-alapú metabonómiával

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Tanszék, Roswell Park Cancer Institute, Elm és Carlton Streets, Buffalo, NY, 14261

Molecular and Cellular Biophysics részleg, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Rákmegelőzési és Népesedéstudományi Osztály, Roswell Park Rák Intézet, Buffalo, NY, USA

Biostatisztika Tanszék, Buffalo Egyetem, Buffalo, NY, USA

Rákmegelőzési és Népesedéstudományi Osztály, Roswell Park Rák Intézet, Buffalo, NY, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, St. Vincent's Hospital, Indianapolis, IN, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, St. Vincent's Hospital, Indianapolis, IN, USA

H. Lee Moffitt Rákközpont és Kutatóintézet, Tampa, FL, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Patológiai osztály, Roswell Park Rák Intézet, Buffalo, NY, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Molecular and Cellular Biophysics részleg, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Tanszék, Roswell Park Cancer Institute, Elm és Carlton Streets, Buffalo, NY, 14261

Molecular and Cellular Biophysics részleg, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Rákmegelőzési és Népesedéstudományi Osztály, Roswell Park Rák Intézet, Buffalo, NY, USA

Biostatisztika Tanszék, Buffalo Egyetem, Buffalo, NY, USA

Rákmegelőzési és Népesedéstudományi Osztály, Roswell Park Rák Intézet, Buffalo, NY, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, St. Vincent's Hospital, Indianapolis, IN, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, St. Vincent's Hospital, Indianapolis, IN, USA

H. Lee Moffitt Rákközpont és Kutatóintézet, Tampa, FL, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Patológiai osztály, Roswell Park Rák Intézet, Buffalo, NY, USA

Nőgyógyászati ​​Onkológiai Osztály, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Molecular and Cellular Biophysics részleg, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, USA

Absztrakt

Anyag és módszerek

A minták gyűjtése és előkészítése

2001 júliusától 2002 decemberéig a Roswell Park Rák Intézetben (RPCI) EOC-műtéten átesett betegek preoperatív szérummintáit egy jóváhagyott IRB protokoll alapján gyűjtötték. A tumorszövet patológiájának ellenőrzését egy nőgyógyászati ​​patológus (M.E.I.) végezte. A kontrollokhoz a normál egészséges nők (pre- és postmenopauzális kontrollok), valamint a jóindulatú petefészek-cisztában szenvedő betegek szérumait 2 további IRB-protokoll alapján gyűjtöttük össze. Egészséges premenopauzás nőkből származó szérumokat gyűjtöttünk a Roswell Park Rák Intézet nőgyógyászati ​​klinikáin részt vevő nőktől. A posztmenopauzás nők esetében szérumokat gyűjtöttek egy táplálkozási beavatkozási vizsgálat résztvevőitől. A vénaszúrás útján történő vérgyűjtéstől számított 2 órán belül a szérumokat centrifugálással elválasztottuk, és az alikvot részeket -80 ° C-on tároltuk a vizsgálatig.

A szérumminták 1H-NMR spektroszkópiai elemzése

Az NMR adatok csökkentése

Mindegyik 1H-NMR spektrumot korrigáltuk a fázis és az alap torzulásokkal a NutsPro (20021122 verzió, Acorn NMR Inc., Livermore, CA) segítségével, és a 9,5–0,0 millió per millió (ppm) spektrumtartományt 200–250 integrális szegmensre csökkentettük. egyenlő szélessége δ0,04. A szegmentált régiók ezen optimális szélessége korábbi, 20, 21 tanulmányokon alapszik, amelyek szerint a 0,04 ppm-es régiók befogadják a pH-hoz kapcsolódó kisebb jelváltozásokat és a fényesség minőségének változását. A vízrezonancia szupressziójának mindenféle káros hatásának kiküszöbölésére a vízrezonanciát tartalmazó régiót (5,5–4,75) nulla integrálra állítottuk. Ezt követően a spektrumok összes megmaradt frekvencia-régióját a spektrum teljes integrált területére skálázták, átlag-középre és pareto-skálára. A Pareto skálázás minden változónak szórást ad, numerikusan egyenlő a szórásával.

Az 1H-NMR spektrumok fő komponens analízise (PCA)

Az osztály analógiájának puha, független modellezése (SIMCA)

Az eredmények validálása érdekében az adatok felügyelt elemzését az osztály analógiájának puha független modellezésén (SIMCA) alapul véve végezték el. A SIMCA a PCA jellemzőit felhasználva meghatározza a szignifikancia határokat a minták meghatározott osztályaihoz a pontszámokban és a maradék irányban. Az ismeretlen minták leképezése a számított modellekre az osztályazonosságot biztosítja az ismeretlen minták és az előre definiált osztálymodellek mintáinak hasonlósága alapján. A SIMCA-szemlélet vizualizálásának egyik módszere a Cooman-féle cselekmény, 24 amely osztálytávolságokat ábrázol egymással szemben. Különálló PCA-modelleket építettünk az EOC-betegek, a jóindulatú petefészek-cisztában szenvedő betegek és a posztmenopauzás egészséges kontrollok szérumára. Ezután a SIMCA-t alkalmazták a Cooman-féle cselekmény segítségével a modellek számára, hogy értékeljék az osztályozási teljesítményt az osztálytagság előrejelzésével a modelltől való távolság szempontjából. Az alkalmazott modelltől a kritikus távolság 0,05 szintnek felelt meg és 95% -os tolerancia intervallumot határozott meg.

A vevő működési jelleggörbéjének (ROC) elemzése

Bár a főkomponens-elemzés kiváló eszköz az adatok csökkentésére és ezáltal a grafikus megjelenítésre, nem alkalmas a betegség jelenlétének vagy hiányának előrejelzésére szolgáló diagnosztikai modell kifejlesztésére. Ennek megoldására egyváltozós ROC elemzéseket végeztünk egyedi logisztikai regressziókon keresztül a 2191H-NMR régió mindegyikére, hogy megvizsgáljuk azok hasznosságát az EOC előrejelzésében. Az érzékenységi és specifitási kompromisszumokat minden változóra összefoglaltuk az RUC görbe alatti terület AUC jelölésével, és a trapéz szabály alkalmazásával számoltuk. Az 1,0-es AUC-érték 100% -os érzékenységű és 100% -os specificitású predikciós modellnek felel meg, míg az AUC-érték 0,5 rosszul prediktív modellnek felel meg (lásd Pepe et al. A ROC elemzések áttekintése a logisztikai regressziós modellezés útján 25). A legjobb kétváltozós modelleket ezután az egyváltozós információktól kezdve előre, lépésenkénti kiválasztással kezdtük el, az AUC-t használva a változó modellbe történő belépésének kritériumaként. A kétváltozós modell nagy pontossága miatt nem találtuk szükségesnek a háromváltozós modell folytatását.

A spektrális mintázatbeli különbségek elemzése

A felügyelet nélküli PCA, a felügyelt SIMCA és a ROC elemzések eredményei alapján egy korábban leírt módszertan felhasználásával azonosítottuk a spektrummintázatbeli különbségekért felelős molekulákat. Az NMR-spektrum azon régióit, amelyek a legerősebben befolyásolják az EOC és az egészséges kontrollok közötti szétválasztást, a regressziós együtthatók határozták meg. Az együtthatókat a PCA-modellekből származtattuk úgy, hogy mindegyik oszlop 0,04 ppm-et lefedő spektrális régiót képvisel, bemutatva, hogy az EOC-minták 1H-NMR profilja különbözik az egészséges szérumminták 1H-NMR profiljától. A negatív érték az EOC mintákban jelenlévő (az NMR kémiai eltolódási hozzárendelési táblázatok alapján hozzárendelt) viszonylag nagyobb koncentrációt jelez, a pozitív pedig az EOC mintákhoz viszonyítva viszonylag alacsonyabb koncentrációt jelez.

Eredmények

A betegek jellemzői

A 38 EOC-beteg stádiumbeli megoszlása ​​a következő volt: I. stádium, 2 beteg; IIIC stádium, 34 beteg; IV. stádium, 2 beteg (I. táblázat). Az előrehaladott betegségben szenvedő betegeknél (IIIC és IV stádium) 4-nél (11%) normális volt a preoperatív szérum CA125 szint (I. táblázat: A betegek jellemzői és kontrollok)

Jellemzők Epitheliális petefészekrákos betegek Benignus petefészekbetegségben szenvedő betegek Menopauza utáni kontrollok Premenopauzális kontrollok
Tantárgyak száma 38 12. 32 19.
Kor (medián/tartomány) 61. (46–86.) 50 (22–68) 57 (51–69) 28. (22–44)
FIGO szakasz
IA - - - -
IB 1 - - -
IC 1 - - -
IIB - - - -
IIC - - - -
IIIA - - - -
IIIB - - - -
IIIC 34 - - -
IV 2 - - -
Szövettan
Papilláris serous 30 - - -
Törölje a cellát 2 - - -
Endometroid 2 - - -
Nyálkás 1 - - -
Differenciálatlan 1 - - -
Egyéb (átmeneti, vegyes) 2 - - -
Endometriosis - 1 - -
Serous cystadenoma - 7 - -
Vérzéses funkcionális ciszta - 3 - -
Nyálkahártya cystadenoma - 1 - -
Orális fogamzásgátlók alkalmazása Iratokkal nem rendelkező
Valaha 28. - 24. 15
Soha 10. - 8. 4
Paritás Iratokkal nem rendelkező Iratokkal nem rendelkező
0 8. - 5. -
1 5. - 3 -
2 8. - 7 -
3 7 - 7 -
4 7 - 6. -
≥5 2 - 4 -

EOC-betegek és kontrollok szérumainak H-NMR-spektrumai

Miután megkaptuk az NMR spektrumokat, elemeztük a kémiai eltolódás és a jelintenzitás paramétereit. A kémiai eltolódás egy adott rezonancia frekvencia és a választott referencia frekvenciája közötti különbség. Amint azt a fentiekben jeleztük, a kémiai eltolódásokat a trimetil-szilil-2,2,3,3-tetradeuteropropionsavhoz viszonyítva fejezzük ki, millió egységben kifejezve (ppm). A metilcsoport protonjai 0,7–2,0 ppm-re rezonálnak a C ‐ CH3 csoportokban, de 2,1–3,5 ppm-re rezonálnak az N ‐ CH3 csoportokban. Az aromás gyűrűs protonok 6,0–9,0 ppm között rezonálnak. Így a kémiai eltolódás már tartalmaz információkat a molekulaszerkezetről, és felhasználható a molekulák 1H-NMR spektrumának megkülönböztetésére, még akkor is, ha kémiai szerkezetük kissé eltér. Különböző kémiai csoportok részletes kémiai eltolódási információit tették közzé, 27, 28, és a kémiai komponenseket e publikált adatok alapján rendelték a spektrumokhoz. 29., 30. 1. ábraa 1. stádiumú EOC-s posztmenopauzában szenvedő páciens 600 MHz-es 1H-NMR spektrumát mutatja, 1. ábrab ábra mutatja egy egészséges posztmenopauzális páciens spektrumát, az 1c. ábra egy egészséges premenopauzás páciens spektrumát mutatja, és az 1. ábrad jóindulatú petefészek-cisztában (petefészek endometriózis) szenvedő betegek spektrumát mutatja.

kimutatása

A hám petefészekrákban (EOC) szenvedő betegek összehasonlítása egészséges alanyokkal. A posztmenopauzás I. stádiumú EOC-beteg szérummintáinak 600 MHz-es H-NMR-spektruma (a), egy premenopauzális egészséges alany (b) posztmenopauzás egészséges alany (c) és jóindulatú petefészek-cisztában (endometriózis) szenvedő beteg (d). A kiválasztott főbb metabolitok kémiai eltolódása jelzett (a közzétett metabolitokkal való összehasonlítás alapján), 27 bár ezek a metabolitok nem járulnak hozzá a jel teljes (vagy egyes esetekben akár a legtöbb) jelzéséhez a jelzett kémiai eltolódásnál. Az alanin, valin, glükóz és 3-hidroxi-butirát hozzárendelését referencia vegyületekkel kiegészített minták hozzáadásával igazolták.

A kémiai eltolódási értékek esetleges kétértelműségének kiküszöbölése érdekében egy mintát kis mennyiségű, 3 referencia vegyülettel „kiegészítettünk” annak tesztelésére, hogy a szignálok tökéletes szuperpozíciója elérhető-e. Először alanin mintát, majd valint, majd glükózt adunk az egyes adagolások után kapott spektrumokkal. Mindegyik esetben a referencia rezonanciája közvetlenül a biofolyadékban kijelölt rezonanciák tetejére esett.

EOC-betegek és kontrollok szérumainak 1H-NMR-spektrumainak PCA-analízise

Az adatokkal csökkentett 1 H-NMR-spektrumokat a 2. ábra mutatja. Az adatkészlet későbbi PCA-elemzése jó diszkriminációt jelzett az EOC-betegek és a kontrollok között. Így helyesen tudtuk szétválasztani mind a 38 rákmintát (100%), mind a 21 premenopauzás normál mintát (100%) (3. ábraa). Ezenkívül lehetőség volt a 38 (97,4%) rákmintából 37 és a menopauza utáni kontroll szérum minták közül 31 (97,4%) 31 helyes elkülönítésére (3. ábrab). Amikor a jóindulatú petefészekbetegségben szenvedő betegeket bevonták a PCA-elemzésbe, akkor is lehetséges volt mind a 38 rákminta (100%) helyes elkülönítése mind a jóindulatú petefészekbetegségben szenvedő 12 beteg szérumától (3. ábrac). Bár a jóindulatú betegségben szenvedő betegek szérumai átfedésben vannak az egészséges kontrollok szérumaival, sikerült elérni a rák elválasztását vs. nem rákos esetek. Valamennyi PCA-diagram azt mutatta, hogy a legtöbb variáció az első 2 fő komponensben jelentkezett. Mivel vizsgálatunkban és a klinikai gyakorlatban az EOC-betegek többsége posztmenopauzális, úgy döntöttünk, hogy további elemzést végzünk a jóindulatú és a rákos betegek egészséges postmenopausalis kontrollokkal történő összehasonlításával.

Adatokkal csökkentett H-NMR spektrum egy tipikus hámsejtes petefészekrákos szérummintából. A δ4.5 és δ6 közötti régiót töröltük, hogy csökkentsük a vízjel hiányos elnyomásából eredő variancia-hozzájárulás valószínűségét.

Az első 2 fő komponens (t [1], t [2]) faktor-pontszámának PCA-diagramjai mutatják a (a) hám petefészekrák (EOC) szérum minták (X, ▪) és egészséges premenopauzális kontrollok (▾); (b) EOC szérum minták (X, ▪) és egészséges menopauza utáni kontrollok (▾) és (c) EOC szérum minták (X, ▪), egészséges posztmenopauzális kontrollok (▾) és jóindulatú petefészek ciszták (o). Vegye figyelembe, hogy az optimális elválasztás a második fő komponensben történt. Az I. stádiumú EOC-t X-vel jelöljük.

SIMCA elemzés

A PCA-elemzés mellett felügyelt elemzést alkalmaztak, amely az osztály-analógia puha független modellezéséből (SIMCA) állt. Az eredményül kapott Cooman-diagram megmutatta, hogy az EOC-ban, jóindulatú petefészek-cisztákban és a posztmenopauzás egészséges kontrollokban szenvedő betegek szérumosztályai nem osztották meg a többváltozós helyet, ami validálást nyújtott az osztályok elkülönítésére (4. ábra). Ezért lehetővé kell tenni annak megjóslását, hogy a jövőbeni minták rákosnak vagy nem rákosnak minősíthetők-e. Ez az előzetes adat azt mutatta, hogy a szérumminták 1H-NMR-alapú metabonomikus elemzése klinikailag hasznos teljesítményt érhet el az EOC-s betegek szérummintáinak azonosításához.

Cooman ábrázolása, amely bemutatja, hogy az epitheliális petefészekrák (EOC) szérumosztálya (X, ▪), a jóindulatú petefészekbetegségben szenvedő betegek széruma (o) és a posztmenopauzális kontrollszérum (▾) osztálya nem osztozik többváltozós térben. Az I. stádiumú EOC-t X-vel jelöljük.

ROC elemzés

A nyers helyadatok felhasználásával végzett ROC-elemzés azt mutatta, hogy az 2H-NMR-leírókból álló 2-variábilis modell 2,77 és 2,04 ppm sebesség mellett tökéletesen illeszkedik a modellhez, azaz., AUC = 1,0. Az 5. ábra egy szóródási ábrát mutat be, amely világosan szemlélteti a 2 csoport közötti elhatárolást. Megjegyzendő, hogy az egyváltozós modell, amely csak a 2,04 ppm régiót vette figyelembe, AUC = 0,942, míg az egyváltozós modell AUC értéke 2,77 ppm, az AUC = 0,689, azaz., A 2.04 régió alapján történő előrejelzés a 2.77 ppm régióban található információktól függ.

Az egészséges posztmenopauzális kontrollok (zárt körök) és az epitheliális petefészekrák (nyitott körök) H-NMR metabonomiás profiljának szétszórt diagramja és ROC elemzése.

Az EOC-betegek és a kontrollok széruma közötti spektrális különbségekért felelős befolyásos terhelések

(a) Az NMR jelek regressziós együtthatói korreláltak a PCA második komponensével, amelyet a 3. ábra mutat. A hámsejtes petefészekrákban (EOC) szenvedő betegek és a menopauza utáni egészséges nők szérumainak összehasonlítása. A negatív együtthatók viszonylag magasabb értékeket jeleznek az EOC mintákban az adott spektrális régióhoz képest, mint az egészséges minták, míg a pozitív együtthatók alacsonyabb értékeket mutatnak. Az együttható nagysága az egyes adattartályok relatív fontosságát képviseli a PCA-modellben elért elválasztás szempontjából. (b) A PCA első komponensének a 3. ábrán bemutatott regressziós együtthatói. Az EOC-betegek és a premenopauzás egészséges nők szérumainak összehasonlítása. A negatív együtthatók viszonylag magasabb értékeket jeleznek az EOC mintákban az adott spektrális régióhoz képest, mint az egészséges minták, míg a pozitív együtthatók alacsonyabb értékeket jeleznek. Az együttható nagysága az egyes adattartályok relatív fontosságát képviseli a PCA-modellben elért elválasztás szempontjából.

Vita