A keringő miRNS-223-3p diagnosztikai és prognosztikai szerepe a hepatitis B vírussal összefüggő hepatocelluláris karcinómában

Szerepek Módszertan, validálás, írás - eredeti vázlat

diagnosztikai

Hepatitis- és májrák-tagsági kiválósági központ, Orvostudományi Kar, Chulalongkorn Egyetem, Bangkok, Thaiföld

Szerepek Formális elemzés, módszertan, vizualizáció

Hepatitis- és májrák-tagsági kiválósági központ, Orvostudományi Kar, Chulalongkorn Egyetem, Bangkok, Thaiföld

Szerepek módszertan, validálás

A Chulalongkorn Egyetem Orvostudományi Karának Biokémiai Tanszéke, Bangkok, Thaiföld

Szerepek Formális elemzés, módszertan, források, felügyelet

A Chulalongkorn Egyetem Orvostudományi Karának Biokémiai Tanszéke, Bangkok, Thaiföld

Szerepek erőforrások, validálás

Csatlakozási Radiológiai Tanszék, Orvostudományi Kar, Chulalongkorn Egyetem, Bangkok, Thaiföld

Szerepek erőforrások, felügyelet, érvényesítés

Chulalongkorn Egyetem Orvostudományi Kar Sebészeti Osztálya, Bangkok, Thaiföld

Szerepek Konceptualizálás, Felügyelet, Írás - eredeti vázlat, Írás - áttekintés és szerkesztés

Hepatitis- és májrák-tagsági kiválósági központ, Orvostudományi Kar, Chulalongkorn Egyetem, Bangkok, Thaiföld

  • Pornpitra Pratedrat,
  • Natthaya Chuaypen,
  • Pattaraporn Nimsamer,
  • Sunchai Payungporn,
  • Nutcha Pinjaroen,
  • Boonchoo Sirichindakul,
  • Pisit Tangkijvanich
  • Cikk
  • Szerzői
  • Metrikák
  • Hozzászólások
  • Média közvetítés
  • Peer Review

Ábrák

Absztrakt

Háttér

A keringő mikroRNS-ekről (miRNS-ek) kimutatták, hogy sok ráktípusban, így a hepatocelluláris carcinomában (HCC) is diszregulálnak. A tanulmány célja a keringő miRNS-ek potenciális diagnosztikai vagy prognosztikai szerepének vizsgálata hepatitis B vírussal (HBV) kapcsolatos HCC-ben szenvedő betegeknél.

Mód

A HBV-vel összefüggő HCC-ben szenvedő betegek párosított rákos és szomszédos nem rákos májszövet-mintáit használtuk felderítésként 800 miRNS szűrésére Nanostring kvantitatív vizsgálattal. Ezután a differenciálisan expresszált miRNS-eket SYBR zöld kvantitatív RT-PCR-rel vizsgáltuk 70 HBV-rokon HCC-ből, 70 HCB nélküli HBV-betegből és 50 egészséges kontrollból származó szérumminta validációs kohorszában.

Eredmények

A felfedező készlet a miR-223-3p, a miR-199a-5p és a miR-451a szekvenciákat szignifikánsan alacsonyabban azonosította a rákos szövetekben expresszálva a nem rákos szövetekkel összehasonlítva. Az validált kohorszban a keringő miR-223-3p szint szignifikánsan alacsonyabb volt a HCC csoportban a többi csoporthoz képest. A szérum alfa-fetoprotein és a miR-223-3p együttes alkalmazása nagy érzékenységet mutatott a korai HCC (85%) és a közepes/előrehaladott stádiumú HCC (100%) kimutatására. Ezenkívül a miR-223-3p szérum negatív korrelációt mutatott a tumor méretével és a BCLC stádiummal. Többváltozós elemzés során a szérum miR-223-3p-t a HCC-ben szenvedő betegek teljes túlélésének független prognosztikai tényezőként azonosították. Ezzel szemben a keringő miRNS-199a-5p és miR-451a nem mutatott klinikai hasznot a HCC diagnózisában és prognosztikus előrejelzésében.

Következtetések

Eredményeink azt mutatták, hogy a miR-223-3p differenciáltan expresszálódott a rákos megbetegedésekben a párosított szomszédos, nem rákos szövetekhez képest. Ezenkívül a keringő miRNS-223-3p új diagnosztikai és prognosztikai markert jelenthet a HBV-vel összefüggő HCC-ben szenvedő betegek számára.

Idézet: Pratedrat P, Chuaypen N, Nimsamer P, Payungporn S, Pinjaroen N, Sirichindakul B és mtsai. (2020) A keringő miRNS-223-3p diagnosztikai és prognosztikai szerepe a hepatitis B vírussal összefüggő hepatocelluláris karcinómában. PLoS ONE 15 (4): e0232211. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0232211

Szerkesztő: Isabelle Chemin, Centre of Recherche en Cancerologie de Lyon, FRANCIAORSZÁG

Fogadott: 2019. október 9 .; Elfogadott: 2020. április 9 .; Közzétett: 2020. április 24

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a kéziratban és annak kiegészítő információs fájljaiban található.

Finanszírozás: A kiadványban közölt kutatásokat a Thaiföldi Kutatási Alap (RTA6280004), a Chula Research Scholar ösztöndíja (CU-GRS-60-06-30-03), a Royal Golden Jubilee Ph.D. támogatta. Program (PHD/0061/2559 támogatásszám) és a Chulalongkorn Egyetem Orvostudományi Karának Hepatitis és Májrák Kiválósági Központja. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenség.

Bevezetés

A hepatocelluláris karcinóma (HCC) világszerte a hatodik leggyakoribb rák és a második legfontosabb oka a rákkal kapcsolatos halálozásnak [1]. A HCC elterjedése földrajzi megoszlásonként eltér Kelet- és Délkelet-Ázsiában mutatott magas arányával [2]. Thaiföldön a HCC kialakulásának fő etiológiai tényezői a hepatitis B vírus (HBV), majd a hepatitis C vírus (HCV) fertőzés, az alkoholos májbetegség (ALD) és az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) következik. Korábbi jelentésünk kimutatta, hogy a HCC-esetek legalább 60% -a krónikus HBV-fertőzésnek tulajdonítható [3]. A gyógyító kezelés fejlett fejlesztései, ideértve a műtéti és az ablatív terápiákat is, a HCC-ben szenvedő betegek teljes túlélése továbbra sem kielégítő a bemutatott daganat agresszivitása és a magas visszatérési arány miatt [2]. Jelenleg a HCC prognosztikai markerei a rutin klinikai gyakorlatban még nem állnak rendelkezésre. Ezért nagyon fontos egy megbízható szérum biomarker a korai diagnosztizáláshoz, a daganat progressziójának nyomon követéséhez és a prognosztikai előrejelzéshez, és nagy klinikai előnyökkel járna.

Ebben a tanulmányban a globális miRNS expresszió profilálást vizsgáltuk a májszövet mintákban, amelyeket HBV-vel összefüggő HCC-ben szenvedő betegekből nyertünk a NanoString kvantitatív platform segítségével. Ezenkívül igazoltuk a jelölt miRNS-ek klinikai jelentőségét Real-Time PCR-rel HBV-vel összefüggő HCC-ben szenvedő betegekből nyert másik szérummintákban.

Anyagok és metódusok

Betegek és mintagyűjtés

A májszövet miRNS expressziós profiljának vizsgálatához rákos és szomszédos nem rákos szövetminták párjait nyertük HBV-vel összefüggő HCC-ben szenvedő betegektől, akiket 2013 és 2017 között a Chulalongkorn Egyetem Sebészeti Klinikáján műtéti reszekciót végeztek. A HCC diagnózisa megerősítést nyert hisztopatológiával. A májszövetmintákat azonnal RNS későbbi oldatban tároltuk (Cat. No. 76106, QIAGEN és Németország), majd folyékony nitrogénben lefagyasztották az RNS extrakciójáig.

A validációs kohorszhoz tárolt szérum mintákat gyűjtöttek HBV-vel összefüggő HCC-ben szenvedő betegektől, akiket 2013 és 2017 között először diagnosztizáltak a thaiföldi Bangkokban, a King Chulalongkorn Emlékkórházban. A HCC diagnózisa ebben a kohorszban tipikus képalkotó vizsgálatok és/vagy hisztopatológia az American Association for Study of Liver Diseases (AASLD) iránymutatásával összhangban [10]. Röviden: a HCC diagnózisának kritériumai közé tartoztak a fokális májelváltozások, amelyekben az artériás fázisban hyperattenuation és a portalis fázisban hipoattenuation volt a dinamikus komputertomográfia (CT) vagy a mágneses rezonancia képalkotás (MRI). Májbiopsziát vagy finom tűszívást végeztek a HCC diagnózisának megerősítésére tipikus képalkotási jellemzők nélküli esetekben. Ezeknek a betegeknek az alapszintű klinikai paramétereit összegyűjtötték, amelyek magukban foglalták a nemet, az életkort, a biokémiai májfunkciós teszteket, a Child-Pugh osztályozást, a szérum alfa-fetoproteint (AFP) és a barcelonai HCC stádiumát a barcelonai klinika májrákja (BCLC) szerint [11]. Ezenkívül rögzítették a betegek teljes túlélését (OS), amelyet a kezdeti felvétel és a halál vagy az utolsó utólagos látogatás közötti intervallum jellemzett.

Tárolt szérummintákat két további csoportból is kaptunk, köztük egészséges véradóktól, akiknek nincs látszólagos májbetegségük (egészséges kontrollok), és krónikus HBV fertőzésben szenvedő betegektől, akiknek nem voltak bizonyítékai HCC-re (a nem HCC csoport). Az egészséges kontrollokat és a nem HCC csoportot nem és életkor alapján egyeztettük HCC-s betegekkel a zavaró hatások csökkentése érdekében. A krónikus HBV fertőzés diagnózisát a szérum hepatitis B s antigén (HBsAg) jelenléte legalább 6 hónapig igazolta. A HCV és/vagy humán immunhiányos vírus (HIV) társfertőzésben szenvedő betegeket kizártuk. Az összegyűjtött szérum mintákat centrifugálással elválasztottuk, és további vizsgálatokig -70 ° C-on tároltuk.

Ezt a vizsgálatot a Helsinki Nyilatkozat szerint végezték az emberi egyének részvételére. Ennek a vizsgálatnak a jegyzőkönyvét a Chulalongkorn Egyetem Orvostudományi Karának Etikai Bizottsága jóváhagyta (IRB 726/60. Sz.), És minden résztvevőtől írásos tájékozott beleegyezést kaptak.

Nanostring nCounter elemzés

25 mg HCC-fagyasztott szövetből extrahált összes RNS-t és a szomszédos, nem rákos szöveteket egyenként kivontuk miRNS-ekhez a GenUP ™ Total RNS Kit (Biotechrabbit GmbH, Hennigsdorf, Németország) alkalmazásával. Ezeket az RNS-eket a teljes 800 miRNS expresszióra határoztuk meg a Human nCounter miRNA Assay v 3.0 kit alkalmazásával, a gyártó utasításainak betartásával (NanoString Technologies, Seattle, WA, USA). A miRNS jelölteket akkor választottuk ki, ha differenciális expressziójuk a rákos és nem rákos szövetekben több mint ötszörös volt.

A NanoString eredmények validálása qRT-PCR analízissel

Statisztikai analízis

A NanoString elemzést az nSolver Analysis Software (4.0 verzió) segítségével végeztük. A miRNS-ek differenciális expressziós szintjeinek adatait az SPSS statisztikai 22. verziójával (SPSS Inc., Chicago, IL) és a GraphPad Prism 5.0 (GraphPad szoftver, CA, USA) szoftverekkel elemeztük. A kvantitatív adatokat az átlag ± standard és a százalékok alapján számoltuk. A csoportok közötti összehasonlításokat χ 2 vagy Fisher pontos tesztjével elemeztük a kategorikus változókra, és a Student t-tesztjével a kvantitatív változókat. A kiindulási paraméterek közötti összefüggéseket a Spearman-féle rangvizsgálattal elemeztük. A túlélési görbéket Kaplan-Meier elemzés és log-rank teszt alapján számoltuk. A Cox regressziós elemzést a HCC-ben szenvedő betegek teljes túlélésével (OS) összefüggő független kiindulási tényezők azonosítására végezték el. P értékek 1. ábra. A vulkán diagramja a differenciál miRNS expressziójának profilját mutatja HCC-s betegek 4 szövetmintájában.

Az x-tengely a Log2-szeres változást, az y-tengely pedig a — log10 P-értékben kifejezett szignifikanciaszintet jelenti. A vulkán ábrázolásán látható piros 3 pont a HCC szövetekben lévő, leeregett miRNS. A kék pontok olyan miRNS-eket jelölnek, amelyek nem mutattak ki szignifikáns változást az expresszióban. A szignifikancia értékét 0,05-ös P-értékhatárral jelöltük.

A miRNS arányainak validálása RT-qPCR segítségével

Annak további vizsgálata, hogy alkalmazható-e keringő miRNS expresszió a HCC diagnosztizálásához; Az RT-qPCR-t validációs kohorsz szérummintákban végeztük, amely 70 HBV-vel összefüggő HCC-ben szenvedő, 70 HCC nélküli betegből és 50 egészséges kontrollból állt. Ezen egyének között az egészséges kontrollokat és a nem HCC csoportot nem és életkor szerint egyeztették a HCC-ben szenvedő betegekkel (1. táblázat). A HCC nélküli betegekkel összehasonlítva a HCC csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt a szérum albumin és a thrombocyta szám, de magasabb volt a szérum összes bilirubin, aszpartát-aminotranszferáz (AST), alanin-aminotranszferáz (ALT), AFP szint, a HBV C genotípus jelenléte és a cirrhosis. A HBeAg pozitivitás és a HBV DNS szint tekintetében nem volt szignifikáns különbség. A HCC csoportban a BCLC kritériumok alapján a rák kezdeti stádiuma a következő volt: 21 (30,0%), 24 (34,3%) és 25 (35,7%) beteg 0-A, B és C-D stádiumban.

A további elemzéshez három miRNS-t választottak ki, köztük a miR-223-3p, miR-199a-5p és miR-451a, amelyeket a felfedezési környezetben azonosítottak, és amelyekről ismert, hogy a HCC-ben nem szabályozottak. Az egyes csoportok alanyainak relatív expressziós miRNS-szintjeit a 2A., 2B. És 2C. Ábra szemlélteti. Az eredmények azt mutatták, hogy a keringő miR-223-3p szintek a HCC csoportban (0,31 ± 0,46) szignifikánsan alacsonyabbak voltak, mint a nem HCC csoportban (0,94 ± 1,05, P 2. ábra.

A szérum (A) miR-223-3p, (B) miR-199a-5p és (C) miR-451a relatív expressziója a vizsgált csoportokban.

A szérum miRNS-szintje és a klinikai paraméterek kapcsolata

A HCC-ben szenvedő betegek között megvizsgálták a szérum miRNS-szintje és a kiindulási klinikai paraméterek közötti összefüggést. A miR-223-3p és a miR-199a-5p (r = 0,118, P = 0,329), a miR-223-3p és a miR-451a (r = -0,059, P = 0,28), valamint a miR között nem volt összefüggés. -199a-5p és miR-451a (r = 0,149, P = 0,218). A szérum miR-223-3p negatív korrelációt mutatott a tumor méretével (r = -0,312, P = 0,008) és a BCLC stádiummal (r = -0,410, P 3. ábra. A HCC és a többi csoport görbe alatti területe (AUROC).

Az összes HCC-t tekintve 70 betegből 56-ban (80,0%) 56-ban csökkent a szérum miR-223-3p szintje. 2. táblázat. A szérum miR-223-3p, AFP és kombináció érzékenysége a HCC diagnosztizálásában a tumor stádiumának megfelelően.

Szérum miRNS-ek a HCC-ben szenvedő betegek teljes túlélésének előrejelzésében

A klinikai összefüggéseken kívül tovább vizsgáltuk a szérum miR-223-3p, miR-199a-5p és miR-451a potenciális prognosztikai szerepét. A mediánértéket (0,13) alkalmazva cut-off szintként, a ≥0,13 szérum miR-223-3p-szinttel rendelkező betegek medián OS-értéke 44,4 hónap volt, ami lényegesen jobb, mint azoknál a betegeknél, akiknek a szérumszintje a 4. ábra. a vizsgált miRNS-ek teljes túlélése HCC-ben szenvedő betegeknél.

(A) miR-223-3p (B) miR-199a-5p (C) miR-451a.

A szérum miR-223-3p, miR-199a-5p és miR-451a szinteket bevittük az egyváltozós elemzésbe más változókkal együtt, amelyek befolyásolhatják a HCC prognózisát. Ezek a kiindulási tényezők magukban foglalták az életkort, a nemet, az AST és az ALT szintet, a thrombocytaszámot, a HBeAg státuszt, a HBV DNS szintet, az AFP szintet, a gyermek osztályozását, a tumor méretét és a BCLC stádiumot. Ezen paraméterek közül az AFP-t, a tumor méretét, a BCLC stádiumot és a szérum miR-223-3p-t választottuk ki többváltozós elemzésre. Többváltozós elemzés alapján az adatok azt mutatták, hogy az OS független prognosztikai tényezői a BCLC szakasz és a szérum miR-223-3p voltak (3. táblázat).

Vita

Egyre növekvő bizonyítékok jelzik a miRNS-ek kritikus szerepét a hepatocarcinogenezisben [4]. Jól ismert, hogy ezek a kicsi, nem kódoló RNS-ek részt vesznek a génexpresszió poszt-transzkripciós szabályozásában és számos sejtes folyamatban, például növekedésben, angiogenezisben, differenciálódásban és metasztázisban [6]. A legfrissebb adatok azt igazolták, hogy a miRNS deregulációja már kimutatható premalignus elváltozásokban, beleértve az alacsony vagy magas fokú diszplasztikus csomókat is, ami jelzi a HCC fejlődésének korai szakaszában való hozzájárulásukat [14]. Sőt, a deregulált miRNS-ek kimutatták, hogy a tumor progressziójában és az agresszivitásban meghatározó modulátorok, amelyekben onkogénekként vagy tumor szupresszorokként hatnak [7]. Figyelembe véve a hepatocarcinogenezis különböző szakaszaiban való részvételüket és a testfolyadékokban való stabilitásukat, úgy tűnik, hogy a keringő miRNS-ek potenciális diagnosztikai és prognosztikai biomarkerekként szolgálhatnak a HCC számára.

Jelen tanulmányt elsősorban a miRNS-ek expressziójának összehasonlítására tervezték HBV-vel összefüggő HCC-ben szenvedő betegek szövetmintáiban, majd validálta a kiválasztott miRNS jelölt szérum minták klinikai következményeit. A felfedezési kohorszban a NanoString platformot alkalmaztuk, amely lehetővé tette a szöveti miRNS-ek kimutatását nagy érzékenységgel és specifitással. E technika alapján 29 miRNS-t azonosítottunk, amelyek szignifikánsan differenciáltan expresszálódtak a rákos és nem rákos szövetekben. Ezek közül a miR-223-3p szignifikánsan alacsonyabban volt szabályozva a rákos szövetekben expresszálódva a hozzájuk tartozó kontrollokkal összehasonlítva. Ez a megállapítás összhangban állt a korábbi adatokkal, amelyek azt mutatták, hogy az erősen deregulált miR-223 expresszió jelentősen meg tudja különböztetni a HCC-t a szomszédos nem rákos májtól, függetlenül a vírusos hepatitis státuszától [15, 16]. Például a krónikus vírusos májgyulladásban szenvedő betegek rákos szövetekben elnyomott miR-223 expressziója medián ötszörös csökkenést mutatott a nem rákos társhoz képest, míg a nem B nem C-HCC-ből származó tumorokban megfigyelt megfelelő adat kb. 3,5-szeres csökkentés [15]. Így a miR-223-3p megváltozott expressziója a májszövetben azt sugallta, hogy ez a miRNS új értéket képviselhet a HCC új biomarkerként.

Ezenkívül eredményeink azt mutatták, hogy negatív összefüggés van a szérum miR-223-3p down-szabályozása és az agresszívebb tumor-viselkedés között HCC-ben. Konkrétan a miR-223-3p szint csökkenését figyelték meg gyakrabban a nagy tumorméretű és előrehaladott BCLC stádiumú betegeknél. Ezenkívül a Kaplan-Meier túlélési elemzés azt mutatta, hogy az alacsony szérum miR-223-3p csoport teljes túlélése szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a magas miR-223-3p expressziós csoporté. Végül a többváltozós elemzés megerősítette, hogy a csökkent szérum miR-223-3p szint független, kedvezőtlen előrejelzője a teljes túlélésnek. Legjobb tudomásunk szerint ez a jelentés elsőként mutatja be a keringő miR-223-3p prognosztikai következményeit HCC-ben szenvedő betegeknél.

Ennek a jelentésnek bizonyos korlátai voltak, mivel egy retrospektív kohorsz volt, amely viszonylag kevés beteget toborzott. Ezenkívül vizsgálatunk csak krónikus HBV-fertőzésben szenvedő betegeket vett fel, amelyek esetleg nem alkalmazhatók a krónikus májbetegségek egyéb etiológiai okaiban, például krónikus HCV-fertőzésben, ALD-ben és a NAFLD-ben. E korlátozások ellenére adataink egyértelműen bizonyították, hogy a miR-223-3p a rákos szövetekben eltérően expresszálódik a párosított szomszédos szövetekhez képest. Ezenkívül a keringő miRNS-223-3p szintek megkülönböztethetik a HCC-t a nem HCC csoportoktól. Diagnosztikai szerepe mellett ez a keringő miRNS a HBV-vel kapcsolatos HCC ígéretes prognosztikai biomarkerként is szolgálhat. További vizsgálatok érdemesek megerősíteni ezeket a megfigyeléseket, és tisztázni a szérum miRNS-223-3p klinikai jelentőségét HCC-ben szenvedő betegeknél.