Lingguizhugan a főzet javítja az alkoholmentes zsírmáj betegségeket az inzulinrezisztencia és a lipid anyagcserével kapcsolatos gének megváltoztatásával: egy teljes trancriptome vizsgálat az RNS-Seq

Mutatók: PDF 1082 megtekintés | HTML 1615 megtekintés | ?

Mingzhe Zhu, Shijun Hao, Tao Liu, Lili Yang, Peiyong Zheng, Li Zhang _ és Guang Ji

Absztrakt

Mingzhe Zhu 1, 2, *, Shijun Hao 1, *, Tao Liu 1, Lili Yang 1, Peiyong Zheng 1, Li Zhang 1 és Guang Ji 1

1 Emésztési Betegségek Intézete, Kína-Kanada Emésztési betegségek kutatóközpontja, Sanghaji Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem, Sanghaj, Kína

2 Népegészségügyi Főiskola, Sanghaji Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem, Sanghaj, Kína

* A szerzők egyformán járultak hozzá ehhez a munkához

Kulcsszavak: Lingguizhugan főzet, génexpresszió, alkoholmentes zsírmájbetegség, RNS-Seq

Beérkezett: 2017. június 07. Elfogadva: 2017. június 29. Publikálva: 2017. július 28

BEVEZETÉS

Az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) a krónikus májbetegségek egyik vezető oka szerte a világon, amelyet a zsírlerakódások májban történő felhalmozódása jellemez, nem pedig az alkoholfogyasztás miatt [1, 2]. A NAFLD elterjedtsége a modern mozgásszegény és táplálékokban gazdag életmódnak köszönhetően növekszik, amely a nyugati országokban 20-30%, Kínában pedig 15-20% [3, 4]. Fontos, hogy a NAFLD az egyik legveszélyesebb szövődmény, amely súlyos májbetegségekhez vezethet, beleértve a fibrózist, a cirrhosist és a hepatocelluláris carcinomát [5, 6]. Ezenkívül a felhalmozódó bizonyítékok azt mutatják, hogy a NAFLD kockázata meghaladja a májat, és számos olyan krónikus betegséghez kapcsolódik, mint a szív- és érrendszeri betegségek, a krónikus vesebetegségek és a 2-es típusú diabetes mellitus [7, 8].

A NAFLD kialakulása számos tényezőhöz kapcsolódik, mint például az életkor, a nem, az etnikum, az alvási apnoe jelenléte és az endokrin rendszer rendellenességei (pl. Hypothyreosis, hypopituitarismus, hypogonadism és policisztás petefészek szindróma). A NAFLD előfordulása az életkor előrehaladtával növekszik, és gyakoribb a 45-65 éves férfiak körében. Gyorsan terjed a gyermekek körében az elhízási járványokkal együtt [9]. Így a NAFLD jelentős globális egészségügyi problémává vált, és súlyos terhet rótt a betegekre és a társadalomra.

A NAFLD fejlesztésében szerepet játszó mechanizmusok még vita tárgyát képezik, bár számos hipotézist javasoltak [10–12]. Tanulmányok kimutatták, hogy különféle jelátviteli utak vesznek részt, mint például a nukleáris faktor κB (NF-κB), AMP-aktivált protein-kináz (AMPK), Toll-szerű receptor (TLR) és foszfatidil-inozitol-3-kináz/protein-kináz B (PI3K/Akt). a NAFLD haladásában. Ezek a jelátviteli útvonalak összekapcsolódva hálózatot képeznek, és egyikük blokkolása sem lehet hatékony a NAFLD megelőzésében vagy kezelésében [13]. Valójában nincs megállapított standard terápia a NAFLD számára. A nemzetközi irányelvek az életmód megváltoztatását javasolják a NAFLD betegek számára javasolt fő stratégiaként. Farmakológiai beavatkozásra azonban szükség van, ha a betegség progresszív vagy súlyos. A közelmúltban számos kiegészítő terápiát, különösen növényi gyógyszereket vezettek be a NAFLD kezelésére [14].

A hatékonyság alatti mechanizmusok megértésének javítása Lingguizhugan főzettel HFD által indukált NAFLD patkányokat alkalmaztunk, és először RNS-Seq analízissel detektáltuk a máj teljes genom génexpressziós profilját. Ez a tanulmány új megvilágításba helyezheti a hagyományos kínai orvoslás terápiás elvének tudományos konnotációjának megértését a NAFLD-ben, és több lehetőséget kínál a NAFLD kezelésére és a jelölt célpontokra a jövőben a NAFLD klinikai terápiájában.

EREDMÉNYEK

A patkányok fenotípusos jellemzői

A HFD táplálásával kiváltott steatosis, amely a NAFLD tipikus jellemzője a májszakaszokban, amint azt a hematoxilin- és eozin- (H&E) festés és az olajvörös O-festés (1I. Ábra), a máj TG-je jelentősen megnövekedett (1H ábra) a NAFLD patkányokban, összhangban volt a szövettani elváltozás. A testtömeg (1A. Ábra), a májindex (1B. Ábra), az epididymális zsírpárna-test tömegarány (EFP/BW, 1C. Ábra), a szérum összes koleszterinszint (TC, 1D. Ábra), a szérum aszpartát-aminotranszferáz (AST, 1G. Ábra). szintén drámaian megnőtt a NAFLD patkányokban, de a szérum TG (1E. ábra) és az almandin-aminotranszferáz (ALT, 1F. ábra) nem mutattak szignifikáns különbséget a csoportok között. 4 hét után Lingguizhugan főzetkezelés, a steatosis gyengült (1I. ábra) és a máj TG-tartalma jelentősen csökkent (1H ábra). A májindex, az EFP/BW arány (1C. Ábra), a szérum TC (1D. Ábra), a TG (1E. Ábra) és az AST (1G ábra) szintén jelentősen csökkent Lingguizhugan főzetes beavatkozás, míg a testtömeg (1A ábra) és a szérum ALT (1F ábra) nem reagált a beavatkozásra.

1. ábra: A patkányok fenotípusos jellemzői A hím C57Bl/6 egereket vagy chow-diétával (Normal, n = 7), HFD-vel (n = 7) vagy HFD-vel etették Lingguizhugan főzet 4 hétig beadva (n = 7). A patkányokat leöltük, és a májszövetet és a szérumot összegyűjtöttük. Feljegyeztük a testtömegét (A), májindex (B), Mellékhártya zsírpárna-test súlyarány (C) kiszámolták. Szérum TC (D), KSZ (E), ALT (F), AST (G) elemeztük, a máj TG-tartalmát (H) kimutatták, és a májszakaszokat mind H&E-vel, mind olajos vörös O-val festették (ÉN) (képnagyítás × 200). Az adatok átlag ± SD-ként voltak jelen. Zöld sávok, lingguizhugan főzet közbelépett csoport; kék oszlopok, a HFD indukálta NAFLD csoport; fekete sávok, normál csoport. Két összehasonlított csoportot jelöltek egy vonallal, és a statisztikai információkat a következőként adták meg o 0,05.

Differenciálisan expresszált génprofilok

A hamis felfedezési arány 1.2 (felfelé szabályozott) vagy 2. ábra: Hierarchikus klaszter az átfedő, differenciálisan expresszált gének felhasználásával Az összes releváns gént hierarchikus klaszterezéssel csoportosítottuk, az összes minta expressziós értékei (log2 arányok) alapján. A minták oszlopokban, a gének sorokban jelennek meg. A génexpresszió színként jelenik meg, a magasabb értékeknél élénkebb vörös, alacsonyabb értékeknél pedig élénkebb zöld.

Gén annotáció és funkcionális elemzés

3. ábra: GO és KEGG útdúsítás A GO és KEGG útdúsítást David 6.8 elemezte. GO (biológiai folyamat) kifejezések gazdagodtak az egymást átfedő, differenciálisan expresszált gének számára (A) KEGG útvonal-dúsítás átfedésben lévő, differenciálisan expresszált gének számára (B).

2. táblázat: Az egymást átfedő, differenciálisan expresszált gének útjának dúsítása

KEGG útvonal neve

Útban gazdagított gének

FN1, Col3a1 Actn4, Pik3r1

AMPK jelátviteli útvonal

Foxo1, Foxo3, Scd1, Pik3r1

FoxO jelzőút

Foxo1, Foxo3, Bcl2l11, Pik3r1

PI3K-Akt jelátviteli út

Bcl2l11, Col3a1, Fn1, Foxo1, Foxo3 és Pik3r1

Fn1, Col3a1, Actn4, Pik3r1

Foxo1, Ppp1r3c, Pik3r1

Az inzulin jelátviteli útja

Foxo1, Ppp1r3c, Pik3r1

Telítetlen zsírsavak bioszintézise

A rákos megbetegedések

Foxo1, Fn1, Fzd1, Pik3r1

Proteoglikánok rákban

Fn1, Fzd1, Pik3r1

Az aktin citoszkeleton szabályozása

Fn1, Actn4, Pik3r1

Fehérje-fehérje interakció (PPI) hálózat az átfedésben lévő gének számára

Az átfedésben lévő, differenciálisan expresszált gének PPI hálózatát a Cytoscape építette fel a BioGRID adatbázis alapján. A hub fehérjék azt jelezték, hogy a csomópontok közötti kapcsolat szorosan megalapozott. Amint a 4. ábrán látható, megfigyeltük, hogy 23 fehérjét kódoló, differenciálisan expresszált gén, például Foxo1, Foxo3, PIK3R1, FN1, BCL2L11 és COL3A1, amelyek közül a PIK3R1 volt a legfontosabb hub fehérje.

4. ábra: Az átfedésben lévő, differenciálisan expresszált gének PPI hálózata. A sárga csomópontok átfedésben lévő, differenciálisan expresszált fehérjéket kódoló géneket képviselnek, amelyek kölcsönhatásba lépnek a jósolt fehérjékkel (kék csomópontok).

VITA

Jelen tanulmányban RNS-seq elemzést alkalmazva azt figyeltük meg Lingguizhugan a főzet javíthatja a NAFLD fenotípusos jellemzőit, és megváltoztathatja a génexpresszió sorozatát. Irodalomkereséssel megállapítottuk, hogy az azonosított, differenciálisan expresszált gének többsége kapcsolatban állt a NAFLD-vel. Továbbá a gén annotáció, a GO, a KEGG útvonal és a PPI hálózat elemzésének kombinációját felhasználva észrevettük, hogy a gének Lingguizhugan főzet az inzulinrezisztencia és a lipid anyagcserével kapcsolatos gének voltak.

Az Scd1 egy sebességkorlátozó enzim, amely katalizálja az egyszeresen telítetlen zsírsavak szintézisét, amelyek a szöveti lipidek fő alkotóelemei. Kimutatták, hogy az Scd1 kulcsfontosságú tényező a lipidanyagcserében, mint kritikus kontrollpont, amely szabályozza a máj lipidszintézisét és a β-oxidációt [32]. Az Scd1 genetikai deléciója megvédi az egerek zsírmáj- és inzulinrezisztenciájának kialakulását. Ezenkívül a máj Scd1 elleni antiszensz nukleotid inhibitorok megakadályozzák a HFD által kiváltott máj steatosist, és az Scd1 inhibitorok állítólag a NASH új kezelési módjai [33]. A jelen vizsgálat eredményeink összhangban voltak ezekkel az adatokkal, jelezve Lingguizhugan a főzet csökkentheti az Scd1-et, és megakadályozhatja a NAFLD előrehaladását. Az Scd1 szabályozás mechanizmusainak további vizsgálata segíthet új gyógyszerek megtalálásában a NAFLD kezelésére.

Sőt, azt is észrevettük, hogy néhány más gént, például a Col3a1-et és az Fn1-et jelentősen lefelé szabályoztak Lingguizhugan főzet. A Col3a1 átírja az alfa-1 (III) kollagén lánc fehérjéjét, amely a kollagén III elődje, míg az Fn1 a glikoprotein fibronektint, az extracelluláris mátrix komponensek ligandumát kódolja. Ez a két gén aktívan részt vesz a fibrózis folyamatában. Megjegyzendő, hogy Zhang X és munkatársai [34] arról számoltak be, hogy a dioscin hatásos hatást mutatott a májfibrózis ellen a Col3a1 expresszió modulálásával. Chen G és munkatársai [35] azt találták, hogy a gosszipol enyhíti a májfibrózist és csökkenti a Col3a1 és Fn1 szintet. Bai Q és munkatársai [36] arról számoltak be, hogy az acetaminofen hepatotoxikus metabolitja, a Col3a1 sejtek mRNS-expressziójának növekedése és májfibrózis indukálása. Mindezek az adatok arra utalnak, hogy a Col3a1 és az Fn1 fontos szerepet játszanak a NAFLD és Lingguizhugan a főzet csökkentheti a Col3a1 és az Fn1 szabályozását.

Bár jelenleg még nincs jóváhagyott farmakológiai beavatkozás a NAFLD számára, egy sor hatóanyagot tanulmányoznak a társuló társbetegségek különböző fokú sikerességgel történő megcélzásához. Közülük az enterális lipid felszívódást megakadályozó Orlistat az elhízást célozza meg, és reverzibilis lipáz inhibitorként működik [37]; A tiazolidinedionok, a PPARγ agonisták, bizonyítottan hatékonyak az inzulinérzékenység fokozásában [38]; A lipidcsökkentő sztatin a diszlipidémia kezelésében és főleg a koleszterinszintézis szabályozásában használatos [39]; Az obetikolsav, a chenodeoxycholsav szintetikus változata, a farnesoid X nukleáris receptor erőteljes aktivátora, és megerősítették, hogy javítja a NASH patológiáját [40]. Természetes termékekből álló képletként ésszerű, hogy Lingguizhugan a főzet az inzulinrezisztenciával és a lipid anyagcserével társult.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Előkészítése Lingguizhugan főzet

Lingguizhugan főzet a következőket tartalmazza: Poria (poliszacharidokat, triterpéneket stb. tartalmazó fő vegyszerek), Ramulus Cinnamomi (fahéjaldehidet, fahéjsavat stb. tartalmazó fő vegyszerek), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae - atraktilont, poliszacharidokat stb. tartalmazó fő vegyszerek), és Radix Glycyrrhizae (fő glicirrizinsavat, licoflavont stb. tartalmazó vegyi anyagok). A négy gyógynövény aránya 2: 1,5: 1: 1 volt. Az összes gyógynövényt a Longhua Kórház biztosította, amely a Sanghaji Hagyományos Kínai Orvostudomány Egyeteméhez tartozik. A gyógynövényes főzetet a korábban leírtak szerint készítettük [42].

Állatok és diéták

Öt hetes hím Wistar patkányokat (130 g ± 10 g) a Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., LTD-től (Kína) szereztünk be, és azokat hőmérséklet és páratartalom mellett szabályozott helyiségben tartottuk. Huszonegy patkányt véletlenszerűen három csoportba osztottak: normál csoportba táplálták a chow étrendet; NAFLD csoport, HFD-vel táplálva (88% chow-étrend, 10% sertészsír és 2% koleszterin); LGZG csoport, táplálva HFD-vel és beadva Lingguizhugan főzet 10 ml/kg/nap dózisban

Az állatokat 4 hetes beavatkozás után lemértük és felöltük. Vérmintákat gyűjtöttünk a hasi aortából, 3000 x g-vel 10 percig 4 ° C-on centrifugáltuk és szérumot gyűjtöttünk. A májszövetet gyorsan eltávolították, 0,9% -os nátrium-klorid-oldattal öblítették és lemérték. Két darab májszövetet (1,0 cm × 1,0 cm × 0,2 cm) kaptunk az azonos lebenytől és helyzettől, majd 10% semleges pufferelt formalinban rögzítettük. A másik májszövetet -80 ° C-on tárolták, miután folyékony nitrogénben lefagyasztották. Minden állatkísérletet a Sanghaji Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem állatkísérleti etikai bizottsága hagyott jóvá

Biokémiai elemzés

A szérum almandin-aminotranszferázt (ALT), AST, TG, TC és a máj TG-t kereskedelmi készletekkel (a Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute-tól (Nanjing, Kína) szereztük be) a gyártók utasításai szerint vizsgáltuk.

Szövettani vizsgálat

A májmintákat 10% -os formalinban rögzítettük 48 órán át, paraffinba ágyazva, 4 μm vastagságúra metszettük, H & E-vel festettük, és a fagyasztott mintákat 8 μm-es részekre vágtuk, és Oil Red O-val festettük, az összes mintát fény alatt vizsgáltuk. mikroszkóp 200-szoros nagyítással.

RNS-Seq detektálás

A teljes szöveti RNS-t izoláltuk a májszövetekből (csoportonként 7 minta) TRIzol reagens (Invitrogen, USA) alkalmazásával. Az RNS minőségét Agilent 2100 Bio-analizátorral (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia) ellenőriztük. A cDNS könyvtárak előkészítését ezt követően az Illumina TruSeq RNS minta előkészítő készletében v2 szállított reagensekkel végeztük a gyártó utasításainak megfelelően. A végső tisztított könyvtárakat BioAnalyzer 2100 automatizált elektroforézis rendszer alkalmazásával értékeltük, és az Illumina szabványos szekvenálási protokollja szerint számszerűsítettük és szekvenáltuk a HiSeq 2000-en.

RNS-Seq adatok elemzése

Kiváló minőségű tiszta adatok megszerzéséhez a későbbi elemzéshez eltávolítottuk a gyenge minőségű olvasókat és olvasókat, amelyek adaptereket vagy nyers N-t tartalmaztak a nyers adatokban. A tiszta leolvasásokat a patkánygenomhoz (Ensembl RGSC3.4) illesztettük a TopHat v2.1.1 alkalmazásával. Az egyes génekhez feltérképezett leolvasási számokat a HTSeq 0.7.2-vel számoltuk. Az egyes gének transzkripciós rengetegségének meghatározásához a transzkripciós szekvencia és a szekvenált millió bázispár per száz töredékét (FPKM) használtuk. Három csoport (csoportonként hét biológiai replikátum) differenciál expresszióját elemeztük a DESeq 2 alkalmazásával. Hamis felfedezési arány 1.2 vagy ->