A nagy és alacsony dózisú fenobarbitál különböző hatásai éretlen CD1 egerek stroke utáni rohamainak elnyomására és gyógyulására

Geoffrey J. Markowitz

Neurológiai és Fejlődési Orvostudományi Tanszék, Baltimore, MD, USA 21205

Shilpa D. Kadam

Neurológiai és Fejlődési Orvostudományi Tanszék, Baltimore, MD, USA 21205

2. Idegtudományi Tanszék, Kennedy Krieger Intézet, Baltimore, MD, USA 21205

3. Neurológiai Tanszék, Baltimore, MD, USA 21205

Dani R. Smith

5 Neurogenetikai és Viselkedési Központ, Pszichológiai és Agytudományi Tanszék, Johns Hopkins Egyetem, Baltimore, MD, USA 21218

Michael V. Johnston

Neurológiai és Fejlődési Orvostudományi Tanszék, Baltimore, MD, USA 21205

2. Idegtudományi Tanszék, Kennedy Krieger Intézet, Baltimore, MD, USA 21205

3. Neurológiai Tanszék, Baltimore, MD, USA 21205

Johns Hopkins Medicine, Baltimore, MD, USA, 21205, Gyermekgyógyászat 4

Anne M. Comi

Neurológiai és Fejlődési Orvostudományi Tanszék, Baltimore, MD, USA 21205

3. Neurológiai Tanszék, Baltimore, MD, USA 21205

Johns Hopkins Medicine, Baltimore, MD, USA, 21205, Gyermekgyógyászat 4

Társított adatok

Absztrakt

1. Bemutatkozás

Az újszülöttkori stroke 4000-es születésből körülbelül egynél fordul elő (Lynch et al., 2002), és ezeknek körülbelül 75% -ának következményei vannak, beleértve az agyi bénulást, az epilepsziát, a tanulási és memóriaproblémákat, valamint a kognitív zavarokat (Koelfen et al., 1995; Delsing és mtsai., 2001). Az újszülöttkori és a gyermekkori stroke gyakran görcsrohammal jár, és a rohamok előfordulása összefügg a neurológiai eredmények súlyosságával (Aden és mtsai, 2002). A görcsoldók beadása ezekben az esetekben általános kezelési stratégia; ezért az antikonvulzív szerek mint neuroprotektív szerek értékelése az aktív kutatások területe volt (Trojnar et al., 2002; Calabresi et al., 2003; Leker és Neufeld, 2003; Liu et al., 2004; Traa et al., 2008).

A legújabb jelentések (Bittigau és mtsai, 2003; Stefovska és mtsai, 2008) káros hatásokat mutattak ki a görcsrohamok antikonvulzív beadása után a születés előtti és újszülött (0. születés utáni nap - 14. születés utáni nap) rágcsálókban az agy növekedésének megfelelő fejlődési ablak alatt. spurt (Dobbing és Sands, 1973). Antikonvulzív koncentrációk esetén drasztikusan megnövekedett apoptózisról számoltak be, és a sejtek proliferációja az éretlen agyban csökkent számos AED, köztük fenobarbitál beadása után (Bittigau et al., 2003; Glier et al., 2004; Manthey et al., 2005; Schubert et al., 2005; Kim és mtsai, 2007; Stefovska és mtsai, 2008). Kimutatták, hogy a neurotrofinok és a túlélést elősegítő jelátviteli utak szabályozatlanok (Bittigau és mtsai, 2003; Hansen és mtsai, 2004; Shi és mtsai, 2010). A magatartás is befolyásolta: kimutatták, hogy a fenobarbitál néhány hónappal később magatartási hiányokat vált ki újszülöttkori 4 adag után (Stefovska et al., 2008). Ezek a hatások dózisfüggőek, küszöbértékekkel meghaladva káros hatásokat váltottak ki (Bittigau és mtsai, 2003; Hansen és mtsai, 2004; Shi és mtsai, 2010).

Ezért a görcsoldó hatékonyságával, biztonságosságával és az eredmény javításának képességével kapcsolatos aggodalmak arra késztettek bennünket, hogy tanulmányozzuk a fenobarbitált az újszülöttkori stroke 12. születés utáni (P12) CD1 egérmodelljében. Kimutatták, hogy ez a modell akut viselkedési rohamokat, funkcionális hiányokat, károsodott neurogenezist és agykárosodást okoz (Comi és mtsai, 2004; Kadam és mtsai, 2008; Kadam és mtsai, 2009a; Kadam és mtsai, 2009b). Itt számolunk be a fenobarbitál egyetlen akut dózisának (30 mg/kg vagy 60 mg/kg) hatásáról ezekre a végpontokra az éretlen agyi stroke után.

2. Módszerek

Az összes anyagot és módszert a Johns Hopkins Egyetem Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá. CD1 egerek almát a Charles River Laboratories Inc.-től (Wilmington, MA) szereztük be. A kölyköket polikarbonát ketrecekben helyezték el, a gát 12 órás fényben: sötét ciklusban; az ételt ad libitum biztosították. A fenobarbitált (PB; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) steril dH2O-ban 25 mg/ml-re oldjuk. A 14 alom kölykeit ligálás után véletlenszerűen osztották be a kezelési csoportokba (a részleteket lásd az 1. táblázatban). A szérumkoncentrációs vizsgálatokhoz összesen 4 almot használtak. A kölyköket P12, P18, P19, P33 és P40 értékeknél mértük. A kutatókat elvakították a kezelési csoportoktól.

Asztal 1

A carotis ligációs vizsgálatokhoz használt egerek

Jármű 30 mg/kg PB60 mg/kg PB

Ligált és véletlenszerűen
40	42	46
minden csoportnak elosztva, n
Nőstények, n (%)	18 (45)	21 (50)	22 (48)
Férfiak, n (%)	22 (55)	21 (50)	24 (52)
Halandóság - nőstények, n	0	0	4
Halandóság - férfiak, n	6.	3	4
Túlélés a perfúzióig, n	34	39	38
Sérült nők, n (%)	12. (35)	15 (38)	11 (29)
Sérült férfiak, n (%)	10 (29)	9 (23)	9 (24)
Sérítetlen nőstények, n (%)	6 (18)	6 (15)	7 (18)
Sértetlen férfiak, n (%)	6 (18)	9 (23)	11 (29)

2.1. Sebészet

A P12 reggelén az állatok a carotis artéria állandó egyoldalú kettős ligálásán estek át, amint azt korábban publikálták (Kadam et al., 2009b). Közvetlenül ezt követően rektális hőmérsékleteket mértünk, majd egyetlen intraperitoneális dózist (30 mg/kg vagy 60 mg/kg PB vagy 0,9% NaCl) adtunk be, és a kölyköket 37 ° C-os inkubátorba helyeztük megfigyelés és roham pontozás céljából. A végbél hőmérsékletét szintén 2 és 4 órával a ligálás után vettük fel.

2.2. Akut roham pontozás

A rohamaktivitást a rohamok besorolási skálája szerint pontozták, amint arról korábban beszámoltunk (Comi et al., 2004; Kadam et al., 2009b). 4 óra múlva az egereket visszavezették a gátra, és mindegyik roham pontszámukat külön-külön összegezték, hogy teljes roham pontszámot kapjanak.

2.3. 5-Bróm-2’-dezoxiuridin beadása

A P18-P20-ból az egerek 5 intraperitoneális injekciót kaptak, 50 mg/kg 5-bróm-2’-dezoxiuridin (BrdU), timidin analóg, 0,9% NaCl-ban oldva.

2.4. Viselkedési tesztek

Valamennyi viselkedési tesztet P32-P37 között végeztük.

2.4.1. T-labirintus spontán váltakozása

Ezt az eljárást egy lezárt „T” alakú labirintusban hajtottuk végre, összesen 15 kísérlet során, a korábban leírtak szerint (Kadam et al., 2009b). Ha az egér 2 percen belül nem választott, a kísérlet befejeződött, és a következőre lépett. Minden kísérlet végén az útvesztőt megtisztították a vizelettől és a széklettől. Ezen adatok elemzése során kizártak egy vivőanyaggal kezelt, stroke-ot megsérült egeret, mert nem hajtotta végre a feladatot, azaz a 15 kísérlet mindegyikében az egér nem lépett be a labirintus egyik célkarjába a megadott 2 perces időtartamot, ezáltal egyik kísérletet sem fejezi be.

2.4.2. Nyílt terepi szoktatás

A teszteket négyzet alakú szabadtér kamrában hajtottuk végre, amint azt korábban leírtuk, hogy megvizsgáljuk az aktivitási szinteket két egymást követő napon, és elemezzük az ülésen belüli és a munkamenet közötti szokást (Kadam et al., 2009b). A nevelések számára és a neveléssel töltött időre vonatkozó adatokat elemeztük az első foglalkozás első 15 percében, hogy megvizsgáljuk ezt a szokástól független viselkedést.

2.4.3. Új tárgy tesztelése

Az első 2 napban az egereket hagyjuk a négyzetmezőhöz szokni, a 2.4.2. Szakaszban leírt nyílt terepi eljárásokkal. A harmadik napon, a minta fázisában két egyforma tárgyat helyeztek el az aréna ellentétes oldalán és egyenlő távolságra a falaktól. Az egereket a szabadtér közepére helyeztük, és 10 percet hagytunk felfedezni. Ezután minden egeret visszahelyeztek a háziketrecbe egy 3 perces fázisközi intervallumra, amelynek során az egyik tárgyat nem azonos tárgyra cserélték; az egereket ezután visszatértük a szabadtérre, és 10 percet kaptunk felfedezésre (tesztfázis). Az egyes egerek interakcióját az egyes tárgyakkal rögzítettük: Új objektum felfedezésének ideje/(Új objektum felfedezésének ideje + Ismerős tárgy felfedezésének ideje) számszerűsített objektum preferencia.

2.5. Perfúzió

A P40-en az egereket 90 mg/kg klór-hidráttal altattuk, transzkardiálisan PBS-sel perfúzióval, majd foszfáttal pufferolt 10% -os formalinnal, és agyukat ugyanabban a fixálóban rögzítettük, krioprotektálva, gyorsfagyasztva és -80 ° C-on tároltuk.

2.6. Immunhisztokémia

Összesen 66 agyat (n/n = 66/80) 8 alomból (7–14. Alom) festettünk a BrdU és a Neuronalis Magok (NeuN) számára (n = 13 csoportonként ligációs sérülés esetén; 7-12 csoportonként ligálás sértetlen). Az antigén-visszakeresést 10 mM nátrium-citráttal (pH 6,0), 0,5% Triton-X 100. BrdU (Roche, 1170376) és NeuN (Chemicon, MAB377) IHC-vel végeztük, és a mennyiségi meghatározást a korábban beszámoltuk (Kadam et al., 2008). A tárgylemezeket Olympus (Fluoview) konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk, az Olympus IX81 invertált mikroszkóp állványon alapuló FV 1000 konfokális rendszerrel. A BrdU-pozitív és a BrdU/NeuN együtt jelölt sejtek számlálását soros koronális metszeteken végeztük (atlas koordináták bregma −1,34 mm – bregma −2,06 mm) (Paxinos és Franklin, 2001).

2.7. Szövettan és atrófia mérés

Az MCID 7.0 Elite (InterFocus Imaging Ltd., Cambridge, Egyesült Királyság) alkalmazásával 40 µm vastag, félgömb és hippocampus területeket mértünk, Nissl festett soros koronális szakaszok, amelyek egymástól egyenlő távolságra helyezkedtek el, és a rostralis striatumtól a caudalis hippocampusig terjedtek (n ≥15 szakasz állatonként), mint korábban leírtak (Kadam et al., 2009b). A hippocampus és a félgömb atrófiáját az egyes szakaszokra a következőképpen számítottuk: (1 - (terület sérült oldal/terület sérült oldal)) × 100%. A stroke-sérülés jelenlétét mikroszkópos ellenőrzéssel határoztuk meg 4x és 10x-es infarktus, atrófiás deformálódott struktúrák, gliózis vagy piramissejt-veszteség jelenlétére vagy hiányára a hippocampusban. A dentát gyri-t felvázoltuk azokra a szakaszokra, amelyeknél a BrdU-pozitív és a NeuN-pozitív sejteket számoltuk, és a BrdU-pozitív sejtek sűrűségét a dentate gyrus-ban (DG) minden szakaszra kiszámítottuk Főigazgatóság/Főigazgatóság területe mm 2 -ben).

2.8. Szérumkoncentrációk - gyógyszeradagolás, mintagyűjtés és elemzés

A P12 CD1 egerek külön csoportját intraperitoneálisan injektáltuk 30 mg/kg vagy 60 mg/kg fenobarbitállal, és a mintákat összegyűjtöttük és elemeztük a korábban publikáltak szerint (Markowitz et al., 2010). Két egér vérmennyiségét egyesítettük az egyes minták előállításához (2. táblázat).