A saját anyatej és a tápszerek különböző arányainak hatása a nagyon koraszülöttek bélmikrobiotájára

Szerepek Formális elemzés, források, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Hírek a Neonatologia do Clínicas de Porto Alegre kórházból, a Rio Grande do Sul Szövetségi Egyetem, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazília

Szerepek Konceptualizálás, formális elemzés, módszertan, felügyelet, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Csatlakozási Unidade de Neonatologia do Clínicas de Porto Alegre Kórház, Rio Grande do Sul Szövetségi Egyetem, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazília

Szerepek Formális elemzés, Módszertan, Források, Szoftver, Validálás, Írás - eredeti vázlat, Írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás Centro Interdisciplinar de Pesquisas em Biotecnologia – CIP-Biotec, Campus São Gabriel, Universidade Federal do Pampa, São Gabriel, Rio Grande do Sul, Brazília

Szerepek vizsgálata, projekt adminisztráció, felügyelet, írás - eredeti tervezet, írás - áttekintés és szerkesztés

Csatlakozási Unidade de Neonatologia do Clínicas de Porto Alegre Kórház, Rio Grande do Sul Szövetségi Egyetem, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazília

Szerepek Formális elemzés, módszertan, források, szoftver

Társulás Centro Interdisciplinar de Pesquisas em Biotecnologia – CIP-Biotec, Campus São Gabriel, Universidade Federal do Pampa, São Gabriel, Rio Grande do Sul, Brazília

Szerepek Formális elemzés, vizsgálat, módszertan, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Hatósági Járványügyi Osztály, Közegészségügyi és Egészségügyi Szakmai Főiskola és Orvostudományi Főiskola, Feltörekvő Pathogens Intézet, Florida Egyetem, Gainesville, Florida, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, hivatalos elemzés, finanszírozás megszerzése, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, erőforrások, felügyelet, validálás, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Csatlakozási Unidade de Neonatologia do Clínicas de Porto Alegre Kórház, Rio Grande do Sul Szövetségi Egyetem, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazília

Adriana Zanella,
Rita C. Silveira,
Luiz F. W. Roesch,
Andréa L. Corso,
Priscila T. Dobbler,
Volker Mai,
Renato S. Procianoy

Ábrák

Absztrakt

Célkitűzés

A koraszülöttek székletének mikrobiotájában mutatkozó különbségek meghatározása, figyelembe véve az exkluzív saját anyatej és tápszer különböző arányú használatát az élet első 28 napjában.

Mód

A vizsgálatba olyan újszülötteket vontak be, akiknek GA ≤ 32 hete volt, 5 csoportba osztva az etetési rend szerint: 7 exkluzív saját anyatej, 8 exkluzív koraszülött tápszer, 16 vegyes táplálás> 70% saját anyatejjel, 16 vegyes táplálás> 70% koraszülöttebb tápszerrel, és 15 vegyes 50% -os saját anyatej és koraszülött tápszer. Kizárási kritériumok: veleszületett fertőzések, veleszületett rendellenességek és a kábítószerfüggő anyák újszülöttjei. A székletet az első 28 napban hetente gyűjtötték. Mikrobiális DNS-extrakciót, 16S rRNS-amplifikációt és szekvenálást végeztünk.

Eredmények

Az összes csoport hasonló volt a perinatális és az újszülöttkori adatokban. Jelentős különbségek voltak a mikrobiális közösségben a kezelések között. A mikrobaközösségek közötti távolság eltérésének hozzávetőlegesen 37% -át az exkluzív saját anyatej felhasználásával magyarázták más étrendekhez képest. Az exkluzív, saját anyatejből összeállított étrend nagyobb mikrobiális gazdagságot tett lehetővé (átlagosan 85 OTU), míg az előnyösen tápszeren, exkluzív tápszeren, lehetőleg anyatejjel, valamint tápszerrel és anyatejjel kevert étrend átlagosan 9, 29, 23, illetve 25 OTU. Az Escherichia és a Clostridium nemzetség átlagos aránya mindig nagyobb volt a tápszert tartalmazóaknál, mint azoknál, akik csak anyatejjel rendelkeznek.

Következtetések

Az exkluzív, saját anyatejjel táplált koraszülöttek újszülöttkori székletmikrobiota fokozott gazdagságot és különbséget mutatott a mikrobiális összetételben azokhoz képest, akiket különböző arányú tápszerrel etettek.

Idézet: Zanella A, Silveira RC, Roesch LFW, Corso AL, Dobbler PT, Mai V és mtsai. (2019) A saját anyatej és a tápszerek különböző arányainak hatása a nagyon koraszülöttek bélmikrobiotájára. PLoS ONE 14 (5): e0217296. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217296

Szerkesztő: Paul Jensen, az Illinoisi Egyetem, Urbana-Champaign, EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2018. október 24 .; Elfogadott: 2019. május 8 .; Közzétett: 2019. május 20

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a kéziratban található. A nyers szekvenciákat a Sequence Read Archive (SRA) BioProject ID: PRJNA524815 azonosító alá helyezték. Az SRR8649276 - SRR8649252 futási számok.

Finanszírozás: A finanszírozást a Bill és Melinda Gates Alapítvány (OPP1107597), valamint a CNPQ és a DECIT Ministerio da Saude Brasil biztosította. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A koraszülöttek éretlen bélmikrobiotáját olyan tényezők befolyásolják, mint a posztnatális életkor, a terhességi életkor, a születési súly és a táplálkozási kitettség [8,13,14,15]. A szoptatás konkrét eseteiben ez úgy tűnik, hogy leplezi a születési súly hatását, ami védelmi funkciót sugall a koraszülött újszülöttek béléretlensége ellen az élet kezdetén [8]. Ezek a megállapítások nemcsak arra utalnak, hogy létezik egy mikrobiális mechanizmus, amely bizonyítja, hogy az anyatej elősegíti a koraszülött újszülöttek bélrendszeri egészségét [16], hanem a gazda és az étrendi tényezők dinamikus kölcsönhatására is, amelyek elősegítik a gyarmatosítást és a gazdagodást. specifikus mikrobák mennyisége a bélmikrobiota létrejötte során [8].

Ezért ennek a tanulmánynak az a célja, hogy leírja a nagyon alacsony születési súlyú csecsemők bélmikrobiotáját az első 28 napban, az anya saját tejének felhasználásától vagy a tápszerek különböző arányú felhasználásától függően.

Anyag és módszerek

Ez a tanulmány kényelmi mintavételi stratégiát alkalmazott a Brazíliában fekvő Clínicas de Porto Alegre Kórház (HCPA) neonatológiai részlegéből 2014 májusa és 2017 januárja között. Terhes nők, akiknek terhességi kora ≤ 32 hét, és írásos tájékoztatáson alapuló beleegyezésük volt, kórházba írták belépés a szállításukra. A vizsgálati protokollt a Clínicas de Porto Alegre Kórház (HCPA) Etikai Bizottsága jóváhagyta, és a gyámok aláírták a tájékozott beleegyező nyilatkozatot. A kizárási kritériumok a következők voltak: 1) HIV vagy veleszületett fertőzések, 2) anyák, akik kábítószerrel visszaéltek, és 3) újszülött veleszületett rendellenességek. A csecsemők heti székletmintáit a pelenkákból vették az első széklettől kezdve az élet 4. hetéig. Valamennyi mintát folyékony nitrogénben tároltuk a DNS-extrakcióig.

Az újszülötteket öt csoportba osztották az etetés szerint: kizárólagos saját anyatej (LME), kizárólagos tápszer (PFL), 50% saját anyatej és 50% tápszer (MFLM) vegyes, tápszerrel keverve és 70% vagy annál több saját anya tej tej (PLM), és összekeverve saját anyatejjel és legalább 70% tápszerrel (PFL). Az újszülöttek naponta ugyanazt az étrendet kapták, legfeljebb 28 napig. A különféle tápszer- és anyatejmennyiségeket külön-külön kínálták a nap különböző időpontjaiban, így a nap végén megmaradt az arány. Az anyatej és a tápszer aránya a rendelkezésre álló anyatej mennyiségének korlátozását jelentette. A koraszülött képlet Pre Nan volt. Ez a képlet nem tartalmaz sem probiotikumokat, sem prebiotikumokat.

Szülészeti és újszülött adatok prospektív gyűjtése.

DNS-extrakció és a 16S rRNS-könyvtár előkészítése

A korábban részletesen leírt laboratóriumi technika [16].

Mikrobiális DNS-t izoláltunk a mintákból a QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) alkalmazásával, a gyártó utasításainak megfelelően, módosításokkal. Az összes DNS-mintát felhasználásig -80 ° C-on tartottuk. A 16S rRNS gén V4 régióját amplifikáltuk és szekvenáltuk a PGM Ion Torrent platform (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) vonalkódolt bakteriális/archeális 515F és 806R primerekkel [17]. A PCR-amplifikációt vonalkódolt primerek segítségével hajtottuk végre, amelyek az Ion adapter „A” szekvenciájához (5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3 ') és az Ion adapter P1 szekvenciához (5'-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3') kapcsolódtak, hogy az A- vonalkód-806R és P1-515F adapter és alapozók. A 25 μl PCR-keverék mindegyike 2U platina Taq DNS nagy pontosságú polimerázból (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 4 μl 10-szeres nagy pontosságú PCR-pufferből, 2 mM MgSO4-ből, 0,2 mM dNTP-ből, 0,1 μM-ból állt, a 806R vonalkódos primerből és az 515F primer, 25 μg Ultrapure BSA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) és körülbelül 50 ng DNS templát. Az alkalmazott PCR-körülmények: 95 ° C 5 percig, 35 denaturációs ciklus 94 ° C-on 45 másodpercig; hőkezelés 56 ° C-on 45 másodpercig és meghosszabbítás 72 ° C-on 1 percig; ezt követi egy utolsó hosszabbítási lépés 72 ° C-on 10 percig.

A kapott PCR termékeket Agencourt AMPure XP reagenssel (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) tisztítottuk, és a PCR termék végső koncentrációját Qubit fluorométer készlet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) segítségével a gyártó ajánlása alapján számszerűsítettük. . Végül a reakciókat ekvimoláris koncentrációkban egyesítettük, így minden minta 16S-génnel amplifikált fragmenseiből álló keveréket kaptunk. Ezt az összetett mintát könyvtári előkészítéshez használták az Ion OneTouch 2 rendszerrel, az Ion PGM Template OT2 400 Kit Template-tel (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). A szekvenálást Ion PGM Sequencing 400 alkalmazásával, Ion PGM rendszeren végeztük, Ion 318 Chip v2 alkalmazásával, mikrochipenként legfeljebb 40 mintával.

Szekvencia feldolgozás

A 16S rRNS nyers szekvenciákat a brazil mikrobiológiai projekt ajánlásait követve elemeztük [18]. Röviden: az OTU (Operatív Taxonómiai Egység) táblázatot az UPARSE csővezeték felhasználásával [19] építették fel, amelyben az olvasmányokat 200 bp-on csonkították, és a minőséget maximálisan várható 0,5-ös hiba felhasználásával szűrték. A szűrt leolvasásokat visszavonták és a szinguletteket eltávolították. Miután a szekvenciákat OTU-kba csoportosítottuk, 97% -os hasonlósági vágással, a kimérákat ellenőriztük, hogy reprezentatív szekvenciákat kapjunk az egyes mikrobiális filotípusokhoz. A taxonómiai osztályozást a SINTAX [20] alkalmazásával, a Ribosomal Database Project (RDP) adatbázissal [21] vezették be, 80% -os megbízhatósági küszöbértékkel. A mintavételi erőfeszítéseket Good lefedettségével becsültük meg [22].

Statisztikai analízis.

Az összes klinikai adatot az SPSS 21.0 szoftver segítségével elemeztük 5% -os szignifikancia szinten. A normál eloszlású kvantitatív változásokat átlag/SD-vel írtuk le, és az ANOVA-val összehasonlítottuk Tukey-próbával. Az aszimmetrikus eloszlású kvantitatív változásokat a medián/interkvartilis tartományon keresztül írták le, és Kruskall-Wallis teszttel hasonlították össze Dunn teszttel. Az arányok közötti összehasonlításhoz Pearson khi-négyzet tesztjét alkalmaztuk a korrigált maradékelemzéssel együtt.

Az összes 16S rRNS downstream elemzéshez az adatsort kiszűrtük, és csak azokat az OTU-kat tartottuk meg, amelyek az egyes kezelések során a minták legalább 30% -ában voltak jelen és ritkultak ugyanannyi szekvenciára [23]. A biom fájlt R környezetbe importáltuk [24], és az alfa és a béta változatosság becsléseit a „phyloseq” csomag [25] segítségével kiszámítottuk, majd a „ggpltot2” csomag segítségével tovább ábrázoltuk.

A kezelések közötti főbb különbségek eléréséhez ebben a tanulmányban egy permutációs többváltozós varianciaanalízist (PERMANOVA) [26] binomiális disszimilaritási mátrix és a vegán csomagban megvalósított adonis-függvény segítségével hajtottak végre [27].

A kezelések közötti különbségekhez a STAMP szoftveren keresztül jutottak hozzá [28]. A P-értékeket a kétoldalas White nem-parametrikus t-tesztjével kaptuk meg, amelyet a Benjamini-Hochberg FDR korrekció követett. A p-érték 1. táblázat. Az alanyok jellemzői.

Az újszülöttek adatait a 2. táblázat mutatja.

Az étrendek általános mikrobiális közösségbeli különbségei

Az OTU-szintű mikrobaközösségi különbségeket (97% -os hasonlósági küszöb a csoportos meghatározáshoz), amelyeket 28 napos időszak alatt öt különböző étrenddel etetett koraszülött újszülöttek székletmintáiban találtunk, az 1. ábra mutatja be. A korai bélközösség összeállításáért a különböző étrendek táplálkozását sugalló kezelések közötti struktúra volt felelős. Ezeket a különbségeket tovább erősítette a permutációs többváltozós varianciaanalízis (3. táblázat).

A és B. Az A grafikon a mikrobaközösségek klasztereit ábrázolja. Minden pont egyedi mintát képvisel, a színek jelzik az etetési kezeléseket. A B grafikon mutatja a többváltozós diszperzió mérését az egyes kezelésekhez. FLE = kizárólagos képlet; LME = exkluzív saját anyatej; MFLM = 50% tápszer és 50% saját anyatej; PFL = ≥70% képlet; PLM = ≥70% saját anyatej.

Az átfogó elemzések (az összes minta) azt mutatják, hogy a kezelések közötti távolságváltozás körülbelül 31% -át magyarázta az egyes kezelésekben biztosított különböző étrend. Páronkénti összehasonlításokból kiderült, hogy az anyatej alapján készült étrendek mikrobaközösségeket állítottak össze a csoporton belül nagy eltérésekkel (pl. Nagyobb különbségek a mikrobaközösségek között az anyatejjel táplálkozó alanyoktól), míg a tápszeren alapuló diéták hasonlóbb mikrobiális közösségeket hoztak létre (1A. És 1B. Ábra) (3. táblázat ). Az étrend közötti legnagyobb eltérésért az anyatej használata volt a felelős. A kezelések közötti legnagyobb eltérést az exkluzív saját anyatej és az exkluzív tápszer mellett végzett minták között figyelték meg. A mikrobaközösségek közötti távolság variációjának körülbelül 37% -a magyarázható a csak anyatejjel történő kezeléssel (LME) szemben a preferenciálisan tápszeren alapuló étrenddel (PFL).

Emellett a kezelések közötti távolságban a legnagyobb eltéréseket azokban az összehasonlításokban figyeltük meg, amelyek csak az anyatej felhasználását jelentették. A mikrobaközösségek közötti távolság variációjának körülbelül 37% -a magyarázható csak az anyatejjel történő kezeléssel, összehasonlítva a preferenciálisan a tápszeren alapuló étrenddel (3. táblázat).

Az ordinációs analízissel összhangban az alfa diverzitás mérései szignifikáns különbségeket mutattak (p-érték 2. ábra. Különböző diétákkal etetett koraszülöttek székletmintáiban mért operatív taxonómiai egységek száma 28 nap alatt.

A dobozok átfedik az első – harmadik kvartilit; a dobozok belsejében található vízszintes vonal a mediánt jelenti. A dobozoktól függőlegesen kinyúló pofaszakállak a felső és az alsó kvartilisen kívüli változékonyságot jelzik. A kezelések a Kruskal-Wallis-teszt szerint szignifikánsan eltérőek voltak (p-érték 3. ábra. Különböző diétákkal etetett koraszülött csecsemők mintáiban kimutatott mikrobiális közösségek közötti különbség a mikrobák között 28 nap alatt.