A szívizom lipidprofilozása a magas zsírtartalmú étrend időbeli lefolyása során és annak összefüggése a zsírsav-transzporterek expressziójával

Białystoki Orvostudományi Egyetem Élettani Tanszék

lipidprofilozása

Mickiewicza 2C, 15-222, Białystok (Lengyelország)

Tel. +48857485624, fax +48857485585, e-mail [email protected]

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • Email

Absztrakt

Bevezetés

Anyagok és metódusok

Állatok és tanulmányterv

Plazma mérések

A plazma glükóz, inzulin és szabad zsírsavak koncentrációit Accu-Chek (Bayer, Basel, Svájc) glükózmérővel, Rat Insulin ELISA kit (Mercodia, Uppsala, Svédország) és gáz-folyadék kromatográfia (GLC) alkalmazásával határoztuk meg, illetőleg. Az inzulinrezisztencia-index kiszámításához az éhomi glükóz és az inzulin koncentrációit használtuk (HOMA-IR = éhomi glükóz (mmol/l) x éhomi inzulin (µU/ml)/22,5).

A szívizomsejtek szubcelluláris frakcionálása

A mitokondriumok izolálása

A mitokondriumokat tripszin emésztési módszerrel izoláltuk a bal kamrából [20,21]. Röviden, a bal kamrát apróra daráltuk, és 10 ml izolációs pufferben (0,3 M szacharóz, 10 mM nátrium-HEPES, pH 7,2, 0,2 mM EDTA) szuszpendáltuk. Ezután a szívizomszöveti izolációs pufferhez tripszint adunk, és a mintákat 15 percig inkubáljuk. A tripszin után az emésztési mintákat 10 ml szarvasmarha szérumalbumint (BSA) és tripszin inhibitorot tartalmazó izolációs pufferrel hígítottuk. A szuszpenziót összekevertük, és a felülúszót eldobtuk. Ezután az emésztett szívizomszövetet 10 ml BSA-val ellátott izolációs pufferben szuszpendáljuk és üveghomogenizátorban homogenizáljuk. A kapott homogenátumot 10 percig 600 g-nál centrifugáltuk, majd a felülúszót ismét centrifugáltuk (15 perc, 8000 g). A kapott pelletet 10 ml BSA-val ellátott izolációs pufferben szuszpendáljuk és centrifugáljuk (15 perc, 8000 g). Ezt a lépést kétszer megismételtük. A végső üledéket 500 ul BSA-val ellátott izolációs pufferben szuszpendáljuk. Alacsony hőmérsékletet (4 ° C) tartottunk az eljárás minden lépésében.

Immunblot

Intramyocardialis lipid elemzések

A bal kamra mintáit porítottuk, és a lipideket kloroform-metanol oldattal extraháltuk Folch-módszer szerint [23]. A foszfolipidek (PL), az FFA, a diacilglicerinek (DAG) és a TAG lipidfrakcióit vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) elválasztottuk [24]. Az egyes zsírsav-metil-észtereket GLC-vel azonosítottuk és számszerűsítettük a standardok retenciós idejének megfelelően (Hewlett-Packard 5890 II. Sorozatú kromatográf, HP-INNOWax kapilláris oszlop). A teljes PL-, FFA-, DAG- és TAG-tartalmat a vizsgált frakciók egyes zsírsavfajainak összegeként becsültük meg, és ezt nanomol/szövet grammban fejeztük ki.

A ceramid (CER) tartalmát nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) rendszerrel határoztuk meg, amint azt korábban leírtuk [25]. Röviden, a bal kamra mintáit homogenizáltuk, és a lipideket kloroformba extraháltuk. A lipidkivonat egy alikvot részét egy friss csőbe helyeztük, amelyhez előzetesen hozzáadtunk 40 pmol N-palmitoil-D-eritro-szfingozint (C17 bázis) (egyfajta ajándék Dr. Szulc Z.-től, a Dél-Karolinai Orvostudományi Egyetemtől). belső standard. Ezt követően a mintákat lúgos hidrolízisnek vetették alá dezacilát-ceramidhoz. A keramidból felszabadult szabad szfingozint ezután o-ftalaldehid-származékokká alakították át, majd fluoreszcencia detektorral és C18 fordított fázisú oszloppal felszerelt HPLC rendszerrel elemeztük (Varian Inc. OmniSpher 5, 4,6x150 mm). A ceramid méréséhez használt kloroformkivonat kis mennyiségű szabad szfingoid bázist is tartalmazott. Ezért a ceramid tartalmát korrigáltuk az ugyanazon mintában meghatározott szabad szfingozin szinttel. A szfingolipid-analízist megelőzően a fehérjetartalmat minden BSA-t tartalmazó mintában megmértük, és a ceramid-tartalmat nanomol/fehérje mg-ban fejeztük ki.

Hosszú láncú zsíracil-CoA (LCFA-CoA) tartalma

Becsültük az LCFA-CoA teljes tartalmát, amint azt korábban részletesen leírtam [25]. Röviden, az LCFA-CoA mennyiségét közvetetten mértük szabad CoA -vá történő hidrolízis után Ingebretsen és mtsai. [26]. A bal kamra mintáit jéghideg 6% perklórsavban homogenizáltuk és centrifugáltuk (10 perc, 1600 g). Ezután az LCFA-CoA-t tartalmazó pelletet kétszer 0,6% perklórsavval és vízzel mossuk. A pelletet ultrahanggal vízben és 1,77 M KOH-ban szuszpendáljuk, majd inkubáljuk (60 perc, 55 ° C). Inkubálás után a mintákat lehűtjük, és 0,5 M trietanol-amin-HCl-ot adunk hozzá 6% perklórsavban. Ezt követően a mintákat centrifugáltuk (10 perc, 5200 g), a felülúszóból 100 µl-t injektáltunk az oszlopba (Varian Inc. OmniSpher 5, 4,6x150 mm), és a felszabadult CoA tartalmát megbecsültük egy UV detektor gradiens eluálással. Az LCFA-CoA tartalmát minden mintában nanomolban fejeztük ki nedves szövet tömegére számítva.

statisztikai elemzések

Valamennyi adatot átlagértékként ± SEM fejezzük ki. A csoportok közötti statisztikai különbséget varianciaanalízissel és megfelelő post hoc tesztekkel, vagy Student t-teszttel teszteltük a Statistica 10-es verziójával (StatSoft, Krakkó, Lengyelország). Az eredményeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük a P héten: + 483,1%; 5. hét: + 581,3%, P 0,05, 2C. ábra). Másrészt a FABPpm plazmalemmális és intramyocelluláris expressziója a HFD-rezsim minden egyes hetében stabil maradt (P> 0,05, 2B. És 2D. Ábra).

2. ábra

A FAT/CD36 (A és C) és FABPpm (B és D) expressziója a plazma membránokban (PM) és alacsony sűrűségű mikroszómák (LDM) a szívizomban magas zsírtartalmú táplálás után. Az adatokat átlag ± SEM-ként fejezzük ki, és hat független meghatározáson alapulnak (n = 6). A világosszürke pontokat PM-nek, a fekete pontokat LDM-nek nevezik a HFD csoportokban (1., 2., 3., 4. és 5. hét). A fehér pontokat kontrollcsoportnak nevezzük. * 2. hét: + 22,2%; a 4. hét: + 49,4%; az 5. hét: + 22,0%, első hét: + 47,1%; a 2. hét: + 65,4%; a 3. hét: + 28,6%; a 4. hét: + 46,7% és az 5. hét: + 32%, P 0,05, 3C. ábra).

3. ábra

Továbbá köztudott, hogy az inzulin a PI3 kináz útvonal aktiválásával képes kiváltani a FAT/CD36 (nem FABPpm) transzlokációját a szarkolémába, ezáltal fokozva a zsírsav beáramlást a kardiomiocitákba [19,41]. Nagyon valószínű, hogy tanulmányunkban és az inzulinrezisztencia hasonló modelljeiben [27] a FAT/CD36 megemelkedett expressziója a kardiomiociták szarkolemmájában (a HFD 4. és 5. hete) a FAT/CD36 megnövekedett transzlokációjának eredménye. plazma membrán a plazma inzulin egyidejűleg jelentősen magas koncentrációja miatt. Ezenkívül a közelmúltbeli jelentések szerint a megnövekedett bazális Akt-aktivitás a HFD-táplálás alatt [11], valamint a PPAR-aktiváció [17] felelős lehet a FAT/CD36 állandó áthelyezéséért az intracelluláris rekeszekből a szív plazmamembránjába. Meglepő módon a FABPpm plazmalemmális expressziója a bal kamrában, ellentétben a FAT/CD36-mal, a patkányok HFD-vel történő etetésének öt hete alatt nem változott, ami összhangban áll néhány más, az inzulinrezisztencia állapotával kapcsolatos jelentéssel (ZDF patkányok) [42]. Valószínűleg a FABPpm expressziójának hiánya a szabad zsírsavak változatlan koncentrációjából és a transzporter inzulinstimulációval szembeni érzéketlenségéből fakadt [19].

Összefoglalva: ez a tanulmány először bizonyította, hogy a HFD minden egyes hetes időtartamában változásokat okoz a szívizom lipidprofiljában. Az étrendi zsírsavak jelentősen befolyásolták a szívizom lipid anyagcseréjét (a 3. és az 5. hét között), főleg a TAG, LCFA-CoA, CER és FFA frakció tartalmának emelésével. Valószínű, hogy a HFD harmadik hetének végén az intramyocelluláris LCFA-CoA mennyisége meghaladta a szívizom β-oxidációs képességét, és megkezdődött a miokardium progresszív lipid felhalmozódása. Valószínűleg ezek a váltakozások a lipidek felhasználásában megzavarhatják a glükóz anyagcserét, és végül lypotoxicitáshoz és kardiomiopátiához vezethetnek. További vizsgálatot igényel, hogy a szív lipidprofiljának változásai károsak-e a szív működésére.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Bialystoki Orvostudományi Egyetem (114-18920L, 124-18526L és 144-18510L támogatásszám) és a lengyel Nemzeti Tudományos Központ (N N01015536 ​​támogatásszám) támogatta. A szerzőknek nem jelentenek be összeférhetetlenséget.

Közzétételi nyilatkozat

A szerzőknek nem jelentenek be összeférhetetlenséget.