A zöld tea kivonat elhízás elleni hatásának RNS-seq alapú transzkriptóma elemzése zebrafish elhízási modellek felhasználásával

Liqing Zang

1 Regionális Innovációs Tanulmányok Doktori Iskola, Mie Egyetem, Tsu, Mie 514-8507, Japán

2 Mie University Zebrafish Drug Screening Center, Tsu, Mie 514-8507, Japán

Yasuhito Shimada

2 Mie University Zebrafish Drug Screening Center, Tsu, Mie 514-8507, Japán

3 Integratív Farmakológiai Tanszék, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu, Mie 514-8507, Japán

4 Bioinformatikai Tanszék, Mie Egyetem Élettudományi Kutatóközpont, Tsu, Mie 514-8507, Japán

Hiroko Nakayama

1 Regionális Innovációs Tanulmányok Doktori Iskola, Mie Egyetem, Tsu, Mie 514-8507, Japán

2 Mie University Zebrafish Drug Screening Center, Tsu, Mie 514-8507, Japán

Youngil Kim

5 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd., Oszaka 544-8666, Japán

Djong-Chi Chu

5 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd., Oszaka 544-8666, Japán

Lekh Raj Juneja

5 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd., Oszaka 544-8666, Japán

Junya Kuroyanagi

6 UMOU Science Lab, Mastusaka, Mie 515-0303, Japán

Norihiro Nishimura

1 Regionális Innovációs Tanulmányok Doktori Iskola, Mie Egyetem, Tsu, Mie 514-8507, Japán

2 Mie University Zebrafish Drug Screening Center, Tsu, Mie 514-8507, Japán

Társított adatok

Absztrakt

1. Bemutatkozás

A zebrafish egy jól jellemzett gerinces állatmodell a fejlődésbiológiához, a gyógyszer felfedezéséhez, a toxikológiához, az emberi genetikához és az emberi betegségek tanulmányozásához [17,18,19]. Nagy hasonlóságot mutat az emberi genommal, az emberi anatómiával és fiziológiával. A közelmúltban a zebrafish-kutatások a metabolikus szindróma kutatásával kapcsolatos előnyökre összpontosítottak, beleértve az elhízást és a 2-es típusú diabetes mellitust [20]. Az optikailag félig átlátszó test egyedülálló lehetőséget nyújt a zebrafish lárvák egész szervezetének adipozitásának megfigyelésére Nílus vörös vagy Olaj vörös O festéssel [21,22]. Kimutatták a zebrafish lipid metabolizmusának és adipogenezisének hasonlóságát az emlősökkel [23]. A felnőtt zebrafish szintén kiváló modell az elhízással kapcsolatos vizsgálatok elvégzéséhez [24]. A túlzott táplálkozással előidézett elhízás a zebrafish-ban hasonló tüneteket mutat, mint az embereknél, például a hipertrigliceridémiát és a hepatosteatosist, és az emlősöknél az elhízás közös patofiziológiai útvonalai vannak [24]. Összességében a zebrafish vonzó modellt jelent a funkcionális ételek és vegyületek elhízás kialakulására és kezelésére gyakorolt hatásainak értékeléséhez [25,26,27].

Ebben a tanulmányban zöld tea kivonatot (GTE) adtunk be mind a lárva, mind a felnőtt zebrafish elhízási modellek számára, hogy értékeljük a GTE elhízás elleni hatását. Továbbá elvégeztük a májszövetek RNS-szekvenálását (RNS-seq) felnőtt zebrafish-ból, hogy megvizsgáljuk a GTE mögöttes molekuláris mechanizmusát és összehasonlítsuk a génexpressziós profilokat az emlősökével az egerek modellként történő tanulmányozásával.

2. Eredmények

2.1. GTE csökkent zsigeri zsírszövet (áfa) mennyisége, amelyet a magas zsírtartalmú étrend vált ki a zebrafish lárvákban

Ebben a tanulmányban bebizonyítottuk, hogy a GTE jelentősen elnyomta a zsigeri zsír felhalmozódását a zebrafish lárvákban, és enyhítette a felnőtt zebrafish elhízott fenotípusait, beleértve a visceralis adipozitást és a dyslipidaemiát. Az RNS-seq adatok útvonal-elemzése feltárta, hogy a GTE elnyomhatja a lipidfelhalmozódást a WNT/β-catenin és az AMPK jelátviteli utak aktiválásával. GTE-vel kezelt májszövetek összehasonlító transzkriptómanalízise feltárta, hogy a zebrafish és az emlősök (egér modell alkalmazásával tanulmányozva) közös molekuláris utakat mutatnak.

4. Anyagok és módszerek

4.1. Etikai nyilatkozat

Valamennyi állatkísérletet a Mie Egyetem Etikai Bizottsága hagyta jóvá, az állatok jólétéről és az állatokkal való gazdálkodásról szóló japán állatjóléti szabályozás (Japán Környezetvédelmi Minisztériuma) szerint hajtotta végre, és megfelelt a nemzetközi irányelveknek.

4.2. Zebrafish törzsek és karbantartás

A zebrafish-t (AB törzs; a Zebrafish International Research Center, Eugene, OR, USA) felneveljük és normál laboratóriumi körülmények között, 28 ° C-on tartjuk, világos/sötét ciklusban, 14/10 órával [44]. Az embriókat megtermékenyítés után összegyűjtöttük, és 28 ° C-on tartottuk 0,3x Danieau-oldatban (17,4 mM NaCl, 0,21 mM KCl, 0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca (NO3) 2 és 1,5 mM 4- (2-hidroxietil) -1- piperazinil-etán-2-szulfonsav (HEPES); pH = 7,6). A halakat GEMMA Micro 75–300-mal (Skretting, Fontaine-les-Vervins, Franciaország) etették fejlettségi állapotuk és hosszuk alapján.

4.3. Vegyszerek és zebrafish obesogén teszt zebrafish lárvákban

Zöld tea kivonatot (GTE; PF-TP80), amelynek teljes polifenol-tartalma meghaladja a 80% -ot, a katechin-tartalma pedig meghaladja a 70% -ot (az EGCG-tartalom meghaladja a 40% -ot), a Pharma Foods International Co., Ltd.-től (Kiotó, Japán) vásároltuk. A kísérletekhez a GTE-t desztillált vízben oldva 100 mg/ml törzsoldatot kaptunk. A munkaoldatot úgy kaptuk, hogy elkészítettük a törzsoldat 1/1000 hígított oldatát 0,3x Danieau oldatban.

Háromnapos zebrafish obesogén tesztet hajtottak végre az előzőekben leírtak szerint, kisebb módosításokkal [21]. A kísérleti tervdiagramot az 1. a ábra mutatja. Röviden, a zebrafish lárvákat standard táplálékkal etettük (Gemma Micro 75, majd Gemma Micro 150), amíg felhasználjuk őket a ZO tesztben. Körülbelül 10 mm-es standard hosszúságú lárvákat (SL; a rostralis csúcs és a farokúszó tövének távolsága) választunk ki, amelyeket egy 6-lyukú lemezre helyezünk. Minden üreg 5 ml 0,3x Danieau-oldatot és öt lárvát tartalmazott. A ZO teszt első napján a lárvákat magas zsírtartalmú étrendként 0,1% keményre főtt csirke tojássárgájával etették. A második napon a lárvákat éheztettük a kontrollcsoportban, és a GTE csoportot a GTE munkaoldatának tettük ki. Az áfa térfogatát éhezés vagy GTE kezelés előtt és után mértük Nile Red festéssel.

Nílusvörös festéshez Nile Red (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 500 μg/ml törzsoldatot készítettünk DMSO-ban. Közvetlenül a felhasználás előtt a munkaoldatot a törzsoldat 1/100-os hígításával kaptuk 0,3x Danieau oldatban. A lárvákat sötétben 30 percig 28 ° C-on a Nílus-vörös munkaoldatnak tettük ki. Ezután a halakat kétszer 5 percig vízzel öblítettük, 500 ppm 2-fenoxi-etanolban (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japán) érzéstelenítettük, és BZ-X710 fluoreszcens mikroszkóp alatt figyeltük meg (Keyence, Tokió, Japán). A Nílus vörös-pozitív intenzitását ImageJ szoftver segítségével számszerűsítettük (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.4. Felnőtt zebrafish kezelés

GTE orális beadására felnőtt zebrafish-hoz 10% GTE-t tartalmazó zebrafish-ételt készítettünk az előzőekben leírtak szerint [45]. A nőstény felnőtt zebrafish-t (3 hónapos) véletlenszerűen három kezelési csoportba sorolták, öt hal/2 L tartályban (n = 5 csoportonként): 1) normál táplálkozási csoport - a zebrafish-okat normál étrenddel (gluténgranulátummal) etették a kísérleti periódus (3 hét), és a második héttől kiegészítve 5 mg cisztát/hal/nap Artemia (sós rák) táplálunk; 2) túlzott táplálkozási csoport - a zebrafish-kat 3 hétig normál étrenddel (gluténgranulátummal) etették, és a második héttől 60 mg cisztával/hal/nap Artemia-val [24] túltáplálták; 3) GTE csoport - a zebrafish halakat 3 hétig GTE-tartalmú táplálékkal (250 µg/testtömeg-g/nap) táplálták, majd a második héttől kezdve túletették. Az etetési részleteket az S4 kiegészítő táblázat mutatja. A GTE-tartalmú táplálékot 30 perccel az Artemia etetése előtt etették a zebrafish-ba. Az etetés során a tartály vízáramlását 2 órán át leállítottuk. Az Artemia maradékát naponta egyszer eltávolítottuk porszívózással a vízszennyezés elkerülése érdekében. A testhosszat és a testsúlyt hetente mértük. A kísérlet végén mértük a vércukorszintet, a plazma TG és a plazma TCHO szinteket [46,47].

4.5. Az áfa mennyiségének CT mérése

A zebrafish-okat jeges-vizes fürdőbe (5 rész jég/1 rész víz ≤4 ° C-on) ≥20 percig immártuk, majd 3D mikro-CT vizsgálatot hajtottunk végre in vivo System R mCT 3D micro-CT alkalmazásával. szkenner (Rigaku, Tokió, Japán) a korábban leírtak szerint [14]. A háromdimenziós képeket rekonstruáltuk és megtekintettük az i-View típusú R szoftverrel (J. Morita Mfg, Kyoto, Japán), valamint vizualizáltuk és elemeztük a CT Atlas Metabolic Analysis ver. 2.03 szoftver (Rigaku). Az áfatérfogat mérése a hasüregre korlátozódott, amelyet a cleithrum és a végbélnyílás közötti területként határoztak meg.

4.6. RNS izolálás, könyvtárépítés és nagy áteresztőképességű szekvenálás

A halakat laparotómiának vetettük alá, azonnal 3 ml RNAlatert tartalmazó csövekbe helyeztük (Qiagen, Hilden, Németország), 24 órán át 4 ° C-on tartottuk, majd felhasználásig -20 ° C-on tároltuk. Mindegyik csoportból öt hal májszövetét csipesszel történő boncolással izoláltuk, a teljes RNS-t pedig TRIzol reagenssel (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) izoláltuk. A teljes RNS-tartalmat a Nano Drop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) alkalmazásával mértük, és az RNS-minták integritását egy Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Pico Chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) segítségével határoztuk meg. . A riboszomális RNS-t a RiboMinus ™ Eukaryote System v2 készlet (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) felhasználásával kimerítettük a gyártó protokollja szerint. Az rRNS-nélkül kimerített RNS integritását az Agilent RNA Pico vizsgálati reagensek és a Bioanalyzer 2100 rendszer (Agilent Technologies) segítségével igazoltuk. Az alacsony RNS-integritási számmal rendelkező minták (RIN (199K, pdf)

Szerző közreműködései

Valamennyi szerző részt vett a kísérletek tervezésében. L.Z., H.N. és Y.S. elvégezte a kísérleteket és elemezte az adatokat. L.Z. és J.K. elvégezte a bioinformatikai elemzést. L.Z. írta a kéziratot. Y.K., D.C. és J.K. szolgáltatta a GTE-t és tanácsokat adott a jelen tanulmányhoz. Y.S. és N.N. megtervezte és megtervezte a kísérleteket. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot.

Finanszírozás

A tanulmány pénzügyi támogatását a Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. nyújtotta.

Összeférhetetlenség

Y.K., D.C. és L.J. a Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. gyógyszeripari vállalat alkalmazottai. Más szerzők nem nyilatkoznak arról, hogy összeférhetetlenség lenne közvetlen összefüggésben a kézirat tartalmával.

Lábjegyzetek

Minta elérhetősége: Zöld tea kivonat a szerzőktől kapható.