A zöld tea polifenolok csökkentik a zsírtartalmat magas zsírtartalmú patkányokban az erk1/2-PPARγ-Adiponectin útvonalon keresztül

Táplálkozási és élelmiszer-higiéniai osztály, Tongji Orvosi Főiskola, Népegészségügyi Iskola, Huazhong Tudományos és Technológiai Egyetem, Wuhan, Kína, Oktatási Minisztérium, Környezetvédelmi és Egészségügyi Főiskola, Közegészségügyi Iskola, Tongji Medical College, Huazhong Tudományos és Műszaki Egyetem, Wuhan, Kína

A WenZhou Medical College közegészségügyi osztálya, WenZhou, Kína

Táplálkozási és élelmiszer-higiéniai osztály, Tongji Orvosi Főiskola, Népegészségügyi Iskola, Huazhong Tudományos és Technológiai Egyetem, Wuhan, Kína, Oktatási Minisztérium Környezetvédelmi és Egészségügyi Főosztály, Közegészségügyi Iskola, Tongji Medical College, Huazhong Tudományos és Műszaki Egyetem, Wuhan, Kína

A WenZhou Medical College közegészségügyi osztálya, WenZhou, Kína

Társulási Oktatási Minisztérium Környezetvédelmi és Egészségügyi Főiskola, Közegészségügyi Iskola, Tongji Orvosi Főiskola, Huazhong Tudományos és Technológiai Egyetem, Wuhan, Kína Népköztársaság

Jelenlegi cím: Táplálkozási és élelmiszer-higiéniai tanszék, Közegészségügyi Iskola, Huazhong Tudományos és Technológiai Egyetem, Wuhan, Kínai Népköztársaság

Táplálkozási és élelmiszer-higiéniai osztály, Tongji Orvosi Főiskola, Népegészségügyi Iskola, Huazhong Tudományos és Technológiai Egyetem, Wuhan, Kína, Oktatási Minisztérium Környezetvédelmi és Egészségügyi Főosztály, Közegészségügyi Iskola, Tongji Medical College, Huazhong Tudományos és Műszaki Egyetem, Wuhan, Kína

Chong Tian,
Xiaolei Ye,
Rui Zhang,
Jia Long,
Weiye Ren,
Shibin Ding,
Dan Liao,
Xin Jin,
Hongmei Wu,
Shunqin Xu

Javítás

2013. szeptember 20.: Tian C, Ye X, Zhang R, Long J, Ren W és mtsai. (2013) Javítás: A zöld tea polifenolok csökkentették a zsírtartalmat magas zsírtartalmú patkányokban az erk1/2-PPARγ-Adiponectin Pathway útján. PLOS ONE 8 (9): 10.1371/annotation/83355f31-f12d-4b8e-9310-b60d11e37482. https://doi.org/10.1371/annotation/83355f31-f12d-4b8e-9310-b60d11e37482 Javítás megtekintése

Ábrák

Absztrakt

Célkitűzés

A hipoadiponektinémia hozzájárul az elhízás és a kapcsolódó rendellenességek, például a cukorbetegség, a hiperlipidémia és a szív- és érrendszeri betegségek kialakulásához. Ebben a tanulmányban a zöld tea polifenolok (GTP) adiponektinszintre és zsírlerakódásokra gyakorolt hatását vizsgáltuk magas zsírtartalmú (HF) táplált patkányokban, feltártuk a jelátviteli út mechanizmusát is.

Módszerek és eredmények

A hím Wistar patkányokat magas zsírtartalmú táplálékkal etették. GTP-ket (0,8, 1,6, 3,2 g/l) ivóvízzel adtunk be. A szérum adiponektint és az inzulint ELISA-val mértük, az adiponektin és a PPARγ mRNS-szintjét a zsigeri zsírszövetben (VAT) valós idejű PCR-rel, a PPARγ, a foszfo (p) - PPARγ, az extracelluláris szignál által szabályozott kináz (erk) fehérje szintjét határoztuk meg 1 A/2 és a p-erk1/2 áfában Western blot módszerrel határoztuk meg. A GTP-k gyengítették a HF által kiváltott VAT-felhalmozódást, hipoadiponektinémiát és az adiponektin csökkent mRNS-szintjét a VAT-ban. A HF csoportban a PPARγ (az adiponektin fő szabályozója) csökkent expresszióját és fokozott foszforilációját, valamint az erk1/2 fokozott aktiválódását figyelték meg, és ezeket a hatásokat GTP kezeléssel lehet enyhíteni. Az alapmechanizmus feltárása céljából az VAT-ot magas glükózszintű DMEM-ben tenyésztettük a hiperglikémia állapot in vitro utánzására. Az in vivo vizsgálat eredményeihez hasonlóan megfigyeltük az adiponektinszint csökkenését, az expresszió csökkenését és a PPARγ fokozott foszforilációját, valamint az erk1/2 foszforiláció emelkedését a tenyésztett VAT-ban. Ezeket a hatásokat enyhíteni lehet GTP-kkel vagy PD98059 (az erk1/2 szelektív inhibitora) együttes kezelésével.

Következtetés

A GTP-k csökkentették a zsírlerakódást, enyhítették a hipoadiponektinémiát a HF-vel táplált patkányokban, és enyhítették a magas glükóz által kiváltott adiponectin VAT csökkenését in vitro. A jelátviteli út elemzése azt mutatta, hogy az erk1/2 útvonalon keresztül közvetített PPARγ szabályozás vesz részt.

Idézet: Tian C, Ye X, Zhang R, Long J, Ren W, Ding S és mtsai. (2013) A zöld tea polifenolok csökkentették a zsírtartalmat magas zsírtartalmú patkányokban az erk1/2-PPARγ-Adiponectin Pathway útján. PLoS ONE 8 (1): e53796. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053796

Szerkesztő: Angel Nadal, Universidad Miguel Hernández de Elche, Spanyolország

Fogadott: 2012. október 5 .; Elfogadott: 2012. december 3 .; Közzétett: 2013. január 15

Finanszírozás: Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Alapkutatási Program (973 Program) támogatta (Projektszám: 2012CB722401; http://www.973.gov.cn/Default_3.aspx), a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (támogatás száma: 30972473, 81030051,81172674, 81273060; http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az adiponektin (más néven GBP-28, apM1, AdipoQ és Acrp30) egy olyan adipocitokin, amelyet kizárólag a zsírszövet választ ki a véráramba. Az adiponektin az összes plazmafehérje körülbelül 0,01% -át teszi ki. A hipoadiponektinémiát, amely az adiponektin alacsony keringési szintjére utal, az elhízás és az ahhoz kapcsolódó betegségek, köztük az inzulinrezisztencia, a hiperglikémia és a szív- és érrendszeri betegségek dokumentálták [12] - [14]. A felhalmozódó bizonyítékok azt mutatták, hogy a hipoadiponectinemia kulcsszerepet játszott az elhízás és a kapcsolódó betegségek patogenezisében [15] - [17]. Ezenkívül az adiponektin elhízott vagy cukorbeteg egereknek történő adagolása csökkentheti a testtömeg és a vércukorszintet, miközben fokozza az inzulinérzékenységet [18] - [20]. Ezen adatok alapján az adiponektint az elhízás és az inzulinrezisztencia új terápiás célpontjának tekintették [21]. Az adiponektin szint emelkedését EGCG-vel dokumentálták nem elhízott spontán diabéteszes patkányokban és spontán magas vérnyomású patkányokban [22], [23]. A fenti kutatás alapján feltételeztük, hogy a GTP-k szabályozhatják az adiponektin szintjét a HF-vel táplált patkányokban, amelyek révén a GTP-k megelőző hatásukat gyakorolják az elhízásra és a kapcsolódó betegségekre.

Ebben a vizsgálatban hím Wistar patkányokat tápláltak HF-diétával, és megfigyelték a GTP-k testtömeg-növekedésre és adiponektinszintre gyakorolt hatását. A jelátviteli út mechanizmusát feltártuk a PPARγ és az erk1/2 szabályozó szerepével együtt.

Anyagok és metódusok

1. Etikai nyilatkozat

Ezt a vizsgálatot szigorúan a laboratóriumi állatok felhasználására vonatkozó irányelveknek és engedélyeknek megfelelően végezték el. A protokollt a Huazhong Tudományos és Műszaki Egyetem állatkísérlet-etikai bizottsága hagyta jóvá (Engedélyszám: S249). Minden erőfeszítést megtettek a szenvedés minimalizálása érdekében.

2. Reagensek és anyagok

Az anti-β aktin a Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA. USA) cégtől származik. Az anti-erk1/2 és p-erk1/2 antitesteket a Cell Signaling Technology-tól (Billerica, MA, USA) szereztük be. Az anti-PPARy antitestet az Abcam-tól (Cambridge, MA, USA) szereztük be; A GTP-ket (tisztaság> 98%) a Fuzhou Rimian Inc.-től (Fuzhou, Fujian, Kína) szereztük be; A TRIZOL az Invitrogen Inc.-től (Carlsbad, Kalifornia, USA) származik, a valós idejű kvantitatív PCR-készletet a TAKARA Bio Inc.-től (Otsu, Shiga, Japán) szereztük be; Az adiponektin és az inzulin ELISA készletét az R&D Systems-től szereztük be. (MN, USA). Minden egyéb vegyi anyag a kereskedelemben kapható legmagasabb fokozatú volt.

3. Állatok

Egy hetes akklimatizálás után harminc 40–60 g tömegű Wistar patkányt véletlenszerűen 5 csoportra osztottak. A kontrollcsoportot standard chow-val etettük; a másik 4 csoportot módosított HF chow-val etettük, amely 60% (w/w) standard chow-t, 12% sertészsírt, 12% cukrot, 6% földimogyoróport, 8% sárgájport és 1% tejport tartalmazott. A 4. hét óta a 4 HF csoportból 3 elkezdett különböző koncentrációjú GTP-ket (0,8, 1,6, 3,2 g/l) tartalmazó vizet inni. A 26. hét végén az összes állatot leöltük, a szöveteket folyékony nitrogénnel lefagyasztottuk, majd -80 ° C-os fagyasztóban tároltuk. A vér biokémiai indexeit, az adiponektin szintet és az inzulin szintet teszteltük. Ezt a vizsgálatot szigorúan a laboratóriumi állatok felhasználására vonatkozó irányelveknek és engedélyeknek megfelelően végezték el. A protokollt a Huazhong Tudományos és Technológiai Egyetem állatkísérlet-etikai bizottsága hagyta jóvá. Minden erőfeszítést megtettek a szenvedés minimalizálása érdekében.

4. Áfa kultúra

A hím Wistar patkányokat feláldoztuk, és aszeptikus körülmények között beszedtük az áfákat. Százötven mg áfát 37 ° C-on tartunk 5% CO2-ban. A magas glükózszintű DMEM-ben tenyésztett VAT-okat GTP-k nélkül kezeltük, GTP-kkel (4 ug/ml) 48 órán keresztül, vagy PD98059-gyel kezeltük 1 órán át. Kontrollként 5,5 mmol/l glükózzal inkubált áfákat alkalmaztunk.

5. Kvantitatív valós idejű PCR

A gyártó utasításait követve a teljes RNS-t a zsírszövetből TRIZOL segítségével extraháltuk, majd UV spektrofotometriával számszerűsítettük. Az A260/280 arányú mintákat 1,8-2,0 között használtuk. A reverz transzkripciós reakciót (RT) véletlenszerű primerek alkalmazásával, mindegyik mintából 1 ug teljes RNS-sel hajtottuk végre. A valós idejű PCR-analízist qPCR SYBR Green keverékkel hajtottuk végre, a következő paraméterekkel: 1 ciklus, 95 ° C, 5 s; 40 ciklus, 95 ° C 10 s; 57 ° C, 30 s. A génexpresszió változásait összehasonlító Ct módszerrel határoztuk meg, referenciaként a GADPH-t. A PCR-ben alkalmazott primerek a következők voltak: GADPH: glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) (BC059110) értelemben: CAG TGC CAG CCT CGT CTC AT, antiszensz: AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC; Adiponectin (NM144744) érzék: GGT GAC CAG GAG ATG CT, antiszensz: TAC GCT GAA TGC TGA GTG ATA; PPARγ (NM001145366) érzék: TCA GGT TTG GGC GAA TG, antiszensz: TTT GGT CAG CGG GAA GG .

6. Enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat

Az adiponektin szekréciójának és a keringő inzulin értékelésének céljából a patkányok vérét összegyűjtöttük, a szérumot centrifugálással elválasztottuk, a zsír explantánsok tenyészet felülúszóját összegyűjtöttük és centrifugáltuk a szennyeződések eltávolítása érdekében. Az adiponektin és az inzulin koncentrációit enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal mértük a gyártó utasításai szerint. A méréseket hat ismétlésben hajtottuk végre. Az eredményeket ng/ml-ben adtuk meg.

7. Elektroforézis és immunblotolás

A zsírszövetet homogenizáltuk, majd 50 mmol/l Tris/HCl (pH 8,0), 150 mmol/l NaCl, 1% Nonidet-P40, 1% nátrium-deoxikolát, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS) tartalmú extrakciós pufferben lizáltuk. 0,1 mmol/l DTT, 0,05 mmol/l PMSF, 0,002 mg/ml aprotinin, 0,002 mg/ml leupeptin és 1 mmol/l NaVO3 [36]. A fehérjekoncentrációt BIO-RAD DC Protein Assay Reagens (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) segítségével számszerűsítettük. A nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézist és az immunológiai blotot az Amersham Biosciences módszerével hajtottuk végre. A fehérje expressziót kemilumineszcens detektáló rendszerrel (Syngen, Cambridge, UK) vizualizáltuk, és a Gel Pro 3.0 szoftverrel (Biometra, Goettingen, Németország) elemeztük.

8. Statisztikai elemzés

Valamennyi kvantitatív adat átlag ± S.E. Az adatokat ANOVA-SNK vagy Dunnett T3 tesztjével hasonlítottuk össze. A különbségeket szignifikánsnak tekintettük a P-hét (C) időpontjában. A kísérlet végén a testtömeg és az áfa együttható nyilvánvalóan magasabb volt a HF csoportban; a hatásokat a GTP-kezelések enyhítették (D, E). A GTP-k kezelése szintén csökkentette a vércukorszintet és a HOMA-IR indexet, és megfordította a lipidprofil változását a HF-vel táplált patkányokban (1. táblázat). A GTP-k kezelése azonban nem befolyásolta a keringő inzulinszintet a HF-csoporthoz képest.

A GTP-k kezelése a HF-csoporthoz képest nem befolyásolta az energiafogyasztást, bár a kontrollcsoport ételfogyasztása magasabb, mint más csoportoké (A), az energiafogyasztásban (B) nem volt szignifikáns különbség. A testsúly különbsége a 9. héttől kezdődött (C). A testtömeg nyilvánvalóan magasabb volt a HF csoportban, mint az összes többi csoportban (D); A HF csoport ÁFA együtthatója nyilvánvalóan magasabb volt, mint a kontroll csoport, és a GTP kezelése enyhítette a hatást (E). (* P 1. táblázat. A GTP-k csökkentették a vércukorszintet és javították a lipidprofilt HF-vel táplált patkányokban.

2. A GTP-k enyhítették az adiponektin Down-expresszióját a HF-étrend által kiváltott áfában és szérumban

Az adiponektin expressziójának és szekréciójának értékeléséhez az VAT-ban lévő adiponektin mRNS-t qRT-PCR-rel, a szérum-adiponektint pedig ELISA-val teszteltük. A 2. ábra bemutatta, hogy a HF-vel táplált patkányok alacsonyabb adiponektin expressziót mutattak transzkripciós és fenotípusos szinten, míg a GTP-k kezelése enyhítette a HF étrend adiponektin-csökkentő hatását.

A 2. A ábra az adiponektin mRNS-szintjét mutatja a zsírszövetben, az eredményt tetszőleges egységekben mutatjuk be, referenciaként GADPH-t használva. A 2. B ábra a szérum adiponektin szintjét mutatja be. A HF csoport szignifikánsan csökkent mRNS-t és keringő adiponektin-szintet mutatott, a csökkent expressziót különböző koncentrációkban (GL 0,8 g/l, GM 1,6 g/l, GH 3,2 g/l) GTP-kezelés gyengítette (* P 3. ábra. A GTP-k gyengítették a HF-diéta által kiváltott foszforilációt, csökkent PPARγ expressziót és az erk1/2 aktivációt a zsírszövetben.

A PPARγ mRNS szintjét GADPH-val számítottuk referenciaként. A fehérje expressziót és a PPARγ és az erk1/2 foszforilációját Western blot-tal teszteltük; az eredményeket tetszőleges egységekben mutattuk be, referenciaként béta-aktint, PPARy-t és erk1/2-t használva. A kontrollcsoport értékét 1,00-nak tekintettük. A HF lefelé szabályozta a PPARγ mRNS-jét (A, N = 6) és a fehérje expresszióját (B, N = 3), míg a PPARγ (C, N = 3) és az erk1/2 (D, N = 3) foszforilációját felfelé szabályozta. ), a hatásokat enyhíteni lehet a GTP kezelésével. (* P 4. ábra. GTP-k és az erk1/2 szelektív inhibitora enyhítette a magas glükóz által kiváltott adiponectin csökkenést.

Százötven mg VAT-ot tenyésztettünk magas glükózszintű (33 mmol/l) DMEM-ben, és 48 órán keresztül GTP-vel (4 ug/ml) kezeltük, vagy 1 órán át PD98059-gyel kezeltük. A sejttenyészet táptalajának felülúszóját gyűjtöttük szekretált adiponektin ELISA-hoz. (A) Adiponektin mRNS szintjét, összehasonlító Ct módszert alkalmaztuk referenciaként a GADPH-val. (B) A szekretált adiponektin a táptalaj felülúszójában ng/ml. A magas glükóz inkubáció (H) csökkentette az adiponektin mRNS-expresszióját és szekrécióját, a hatásokat GTP-kezelések (GH) vagy PD98059 (PD) csökkenthetik. (* P 5. ábra. Az erk1/2 és GTP-k gátlása gyengítette a PPARγ és az erk1/2 aktiváció foszforilációját és down-expresszióját tenyésztett VAT-ban magas glükózszint mellett.