Az abberrant bél mikrobiota megváltoztatja a gazda metabolomját, és hatással van a veseelégtelenségre az emberekben és a rágcsálókban

Hemodializált betegeknél a bél mikrobiális összetételének és a szérum metabolomjának változásáról számoltak be.

Állatokon végzett vizsgálatok arra utalnak, hogy sok uraemiás toxin bélmikrobiális eredetű.

Mik az új eredmények?

A végstádiumú vesebetegségben (ESRD) szenvedő betegek széklet- és szérum metabolomái szorosan korreláltak, és számos uraemiás toxin és szekunder epesav (SBA) felhalmozódása jellemezte őket.

A bél mikrobiota úgy tűnik, hogy fontos meghatározója a gazda székletének és a szérum metabolikus tájának, különösen, ha az ESRD-ben szenvedő betegeknél az uraemiás toxinok és az SBA-k dúsulása összefügg a bél mikrobiom által közvetített aromás aminosavak lebomlásával és a mikrobiális SBA bioszintézissel.

Meghatároztuk az ESRD-hez kapcsolódó mikrobiális fajok egy csoportját, amely az uraemiás toxinok és az SBA-k termelésének oka lehet.

Az ESRD mikrobiota transzplantációja ESRD-ben szenvedő betegekből magasabb szérum uraemiás toxinok termelődését, súlyosbodott vesefibrózist és oxidatív stresszt okozott vese sérült csíramentes egerekben és antibiotikummal kezelt patkányokban.

Az ESRD-vel dúsított Eggerthella lenta és a Fusobacterium nucleatum fokozta az uraemiás toxinok termelését és elősegítette a vesebetegség kialakulását a krónikus vesebetegség patkány modelljében, egy probiotikus Bifidobacterium animalis pedig csökkentette a toxinok szintjét és a betegség súlyosságát patkányokban.

A tanulmány jelentősége

Hogyan befolyásolhatja belátható időn belül a klinikai gyakorlatot?

Az ESRD-ben szenvedő betegek aberrált bélmikrobiómája hozzájárulhat a betegség súlyosságához.

Meg kell vizsgálni azokat a terápiás megközelítéseket, amelyek magukban foglalják a bél mikrobiota modulációját, mint a dialízis kiegészítő terápiáját.

Bevezetés

A végstádiumú vesebetegség (ESRD), a krónikus vesebetegség (CKD) előrehaladott szövődménye, 1 a morbiditás és a halálozás egyik vezető oka világszerte.2 3 Jelenleg az ESRD kezelésének költségei megdöbbentőek; csak az Egyesült Államokban évente hozzávetőleg 34 milliárd dollárra becsülik.4 A CKD progressziója ESRD-be és szövődményei szorosan összefüggenek a toxikus metabolitok vérben és más anyagcsere-terekben történő felhalmozódásával.5-7 A toxinok jelentős része a bél mikrobiota származéka8 9, és dialízissel gyakran nem lehet hatékonyan eltávolítani.5 A CKD10–14-es betegeknél a bél mikrobiómájának szerkezetében bekövetkezett jelentős változások, valamint az ESRD15–17 hemodialízisben szenvedő betegek vérének és székletének metabolikus összetételének megzavarása mikrobiom alapú létezésre utal. metabolikus diszreguláció CKD-ben. Az ESRD-vel összefüggő metabolitok, például az uraemiás toxinok mikrobiális eredetét és a bél mikrobiota által közvetített változásainak hátterében álló mechanizmusokat azonban nem vizsgálták teljes mértékben. Az ilyen vizsgálatok terápiás betekintést nyújthatnak, amint azt egy nemrégiben végzett tanulmány feltárta, amelyben a specifikus bélmikrobák modulációjával kimutatták, hogy szabályozzák a keringő uraemiás toxin, az indoxil-szulfát koncentrációját.

Itt végeztünk egy átfogó vizsgálatot, amely integrálta a bél mikrobiómájának, a szérum és a széklet metabolomáinak, valamint a gazdatulajdonságok többdimenziós adatait, amelyek klinikai és kérdőívből származó adatokon („fenoménként”) alapultak, 223 hemodialízis nagyszabású kohorszából. beteg és 69 egészséges kontroll életkor, testtömeg és táplálkozási szokás, valamint 24 egyén független validációs kohorsza alapján (online 1. kiegészítő táblázat). A tanulmány munkafolyamatát az online 1. kiegészítő ábra írja le, az adattermelést pedig az online 2. kiegészítő táblázat ismerteti.

Kiegészítő anyag

Eredmények

Az ESRD-ben szenvedő betegek és az egészséges emberek szérum metabolomái eltérőek

A szérummintákat nem megcélzott tömegspektrometriával (MS) elemeztük, és a bőségprofilokat 180 annotált szérum metabolitra kaptuk. Az ESRD és a kontroll szérum metabolomák egyértelműen különböztek (1A. Ábra); A 180 metabolitból 134-nek szignifikánsan eltérő bősége volt (online kiegészítő 3. táblázat). Tekintettel a betegpopuláció primer betegség (protopathia) típusokhoz viszonyított heterogenitására, három fő típusra osztottuk: glomerulonephritis (n = 76), diabéteszes nephropathia (n = 73) és más (n = 74), és külön-külön összehasonlítottuk mindegyik a kontroll populációval. A metabolomkülönbségek minden esetben összehasonlíthatók voltak, a teljes populációban eltérőnek mutatkozó szérum metabolitok ≥97% -át ragadták meg, és csak kis számú metabolitot (2 = 1,7%). Összhangban az ESRD státusz volt a fő oka a páciens és a kontroll szérum metabolomák különbségének (1B ábra), mivel ez magyarázta a variancia majdnem 11% -át, míg más bioklinikai változók (pl. Nem, testtömeg és a vér teljes koleszterin-koncentrációja) ) együttesen további 8,5% -kal magyarázta; a három fő protopátiatípus nem befolyásolta jelentősen a szérum metabolomát.

Különböző szérum- és székletmikrobiómák jellemzői az ESRD-s betegeknél. (A) A szérum metaboloma szétválasztása ESRD és egészséges kontrollok között, a fő komponens elemzéssel (PCA) feltárva. A szétválasztás fő elősegítőjeként azonosított metabolitokat gyémántok jelzik. (B) Az olyan fenotípus-indexek hatása, amelyek jelentősen hozzájárulnak a széklet metabolomjának (adonis p 2) varianciájához (R 2) (adonis p 2 = 0,43%), bár jelentősen befolyásolta a szérum metabolomát. Nevezetesen, az ESRD státusz volt ismét a páciens és a kontroll széklet metabolomáinak különbségének fő oka, még akkor is, ha a variancia alacsonyabb részét (4,2%, 1E ábra) magyarázta, mint a szérumban (10,9%). Más bioklinikai változók együttesen magyarázták a variancia további 5,8% -át; a cukorbetegség állapota jelentősen hozzájárult.

A Procrustes-elemzés kimutatta a szérum és a széklet metabolomprofiljának erős kooperativitását (1F ábra). Ami a legfontosabb, hogy a szérum uraemiás toxinok és azok székletprekurzorai szorosan korreláltak egymással (online 6. ábra), ami arra utal, hogy az ESRD-ben szenvedő betegek metabolikus elváltozásai a bélrendszerben jelentősen hozzájárulnak az uraemiás toxinok szérumban történő felhalmozódásához.

Az ESRD-ben szenvedő betegek bélmikrobiális összetételének megváltoztatása hozzájárul az uraemiás toxintermeléshez és a másodlagos epesav-bioszintézishez. Az uraemiás toxinok/SBA-k és MGS-ek hálózati nézete. a négyzetek az uraemiás toxinokat vagy SBA-kat, a környező összekapcsolt körök pedig a véletlenszerű erdei modellekben használt fajokat jelölik. ESRD, végstádiumú vesebetegség; MGS-ek, metagenom fajok; SBA-k, másodlagos epesavak; TMAO, trimetil-amin-N-oxid.

Fontos, hogy az uraemiás toxinhoz vagy az SBA termeléséhez kapcsolódó fajok közvetlenül és szorosan korrelálnak a legfontosabb ESRD klinikai változókkal (online 16. kiegészítő ábra). Különösen az eGFR varianciájának nagy részét (átlagosan 50,8%), valamint a keringő kreatinin, karbamid, C reaktív fehérje és hemoglobin szintjét határozta meg a fajok bősége (online 17. kiegészítő táblázat). Ezért feltételezzük, hogy a bél mikrobioma legalább részben súlyosbítja az ESRD-t uraemiás toxinok és SBA-k révén.

A fent tárgyalt fajon alapuló modell a vevő működési jelleggörbéje alatt 0,97 területet biztosított a beteg/kontroll rétegzéshez (online kiegészítő ábra 17A), ami jelentősen magasabb, mint az anyagcsere és a szív- és érrendszeri betegségek osztályozására kifejlesztett bélmikrobiota modellek által jelentett értékek. 31 36 37 Ebben a modellben az Eubacterium spp, a Flavonifractor spp és az E. lenta volt a fő hozzájáruló (online kiegészítő 17B ábra). Ezek a megállapítások arra utalnak, hogy az uraemiás toxinban és az SBA termelésében szerepet játszó mikrobák diagnosztikai markerként használhatók az ESRD számára.

A bél mikrobiomjának módosítása CKD rágcsáló modellekben befolyásolja a toxin felhalmozódását és a vesebetegség súlyosságát

Az ESRD súlyosbodásának javasolt mechanizmusa a megváltozott bél mikrobiómával. sematikus összefoglaló, amely bemutatja a metabolitok fluxusát a bél mikrobiotájából a székletbe, majd a szérumba, befolyásolva a beteg klinikai állapotát. Az ESRD-ben dúsított és kimerített mikrobiális fajokat, funkciókat, valamint a széklet/szérum metabolitjait piros, illetve kék jelöli. Az olyan fajok gazdagodása, mint az Eggerthella lenta, a Fusobacterium nucleatum és az Alistipes shahii, fokozott AAA-lebomlást, SBA és TMAO bioszintézist eredményez a bélben, ami magasabb szintű uraemiás toxinokat és SBA-kat eredményez az ESRD-s betegek székletében és vérében. Ezzel egyidejűleg az olyan fajok kimerülése, mint a Faecalibacterium prausnitzii, a Roseburia és a Prevotella, a bél mikrobiális SCFA bioszintézisének csökkenéséhez vezet. Az ilyen bél mikrobiota által vezérelt káros anyagcsere súlyosbíthatja a CKD progresszióját, szövődményeket és szisztémás gyulladásokat okozhat, és növelheti az ESRD-ben szenvedő betegek mortalitását. AAA, aromás aminosav; ESRD, végstádiumú vesebetegség; SBA, szekunder epesav; SCFA, rövid szénláncú zsírsav; TMAO, trimetil-amin-N-oxid.

Ez a munka segít ok-okozati összefüggést felállítani a rendellenes bélmikrobiota és a vesebetegség progressziója között humán személyekben. A bél mikrobiota eredetű uraemiás toxinjai közül néhány, köztük az indoxil-szulfát, a p-krezol-szulfát, a fenil-acetil-glutamin és a TMAO mind a CKD19 48 49, mind az ESRD-ben szenvedő betegeknél megemelkedett, és a CKD progressziójához, mortalitásához, súlyos káros kardiovaszkuláris eseményekhez és más súlyos klinikai végpontok.14 50 A toxinokról, például az IS-ről és a PCS-ről kísérletileg bebizonyosodott, hogy vesefibrózist indukálnak és jelentős vesetubulus károsodást okoznak a CKD patkányokban. súlyosbodott vesefibrózis 5/6 nephrectomia patkány modellben. Ezek az eredmények alátámasztják az ESRD-vel dúsított toxintermelő fajok jelentőségét a betegség kialakulásában, és megerősítik azt a modellt, amely szerint a bélből származó uraemiás toxinok növekedése súlyosbíthatja a vesebetegség progresszióját.

Az ESRD-ben szenvedő betegeknél a bélgát gyakran károsodik, 51 elősegítve az uraemiás toxin prekurzorok keringési rendszerbe való behatolását. Ez hozzájárulna a szérum toxinok felhalmozódásához. Bebizonyosodott, hogy az uraemiás betegeknél uralkodó szisztémás gyulladás részben a bélsorompó-funkciójuk károsodásának tulajdonítható. 52 Legfrissebb eredményeink kimutatták, hogy az ESRD-ben szenvedő betegek mikrobiája túlzott fenol termelésével megzavarhatja a bélgátat. a bélgát várható károsodása vagy megzavarása, több uraemiás toxin hatolhat be az ESRD-s betegek keringésébe, súlyosbítva a vesebetegség kialakulását és szövődményeit.

A veseelégtelenségben szenvedő egyének, akiket rendszeresen dialízissel kezelnek, a jelenlegi tanulmányban vizsgáltak szerint is a toxinok által kiváltott reziduális uraemiás szindrómában szenvednek, 54 ami életminőségüket súlyosan rontja. Az ESRD-ben szenvedő betegeknél a toxinok felhalmozódásának egyik oka az, hogy néhány bél mikrobiotából származó uraemiás toxint nem lehet hatékonyan eltávolítani a hagyományos dialízissel. Ezért nagy szükség van a jövőben különböző mértékben károsodott vesefunkciójú betegek klinikailag kontrollált vizsgálataira annak feltárására, hogy a bél mikrobiota diétával, probiotikumokkal vagy más terápiás eszközökkel történő modulálása képes-e enyhíteni a maradék szindróma pusztító tüneteit, javíthatja-e a túlélést és életminőség, vagy elhalasztja az erőforrásigényes dialízis kezelés vagy a veseátültetés szükségességét.

Mód

Tanulmányterv és mintagyűjtés

A kínai pekingi négy hemodialízis központból összesen 223 hemodializált beteget vettek fel. Valamennyi résztvevőnek diagnosztizálták az ESRD-t a Vese Disease: Improving Global Outcomes Clinical Practice irányelvek szerint, és stabil hemodialízis alatt álltak (hetente 1-3 alkalommal). A kontroll csoportba 69 egészséges önkéntes került. A validációs kohorsz 12 betegből, 12 ESRD-ből és 12 nemi és életkor szerinti egészséges kontrollból állt. A kontrollok kizárási kritériumai közé tartozott a magas vérnyomás, a cukorbetegség, az elhízás, a metabolikus szindróma, a gyulladásos bélbetegség, a rák, a máj- vagy veseműködés rendellenessége, a dyslipidaemia. Azokat az embereket kizárták, akik 30 napon belül antibiotikum-gyógyszert vagy 14 napon belül probiotikus termékeket szedtek.

A betegek vérmintáit közvetlenül a kórházi hemodialízis előtt, az egészséges kontrollmintákat pedig a fizikális vizsgálat során gyűjtötték. A szérumot elkülönítettük és -80 ° C-on tároltuk. Friss ürülékmintákat nyertünk a vérvételével azonos időszakban; mindegyik mintát két részre osztottuk, az egyik részt 4 ° C-on DNS-védőoldatban tároltuk, a mintában 2 hónapon belül DNS-kivonatokat hajtottunk végre. A másikat -80 ° C-on fagyasztották, amelyet 2 hónapon belül felhasználnak a metabolomikai elemzésre. A vérminták klinikai kémiai elemzését, az antropometrikus és a széklet pH-jának mérését, valamint kérdőíves felmérést végeztek (online 1. kiegészítő táblázat).

A szérum- és székletminták metabolomprofilja

A szérum metabolikus profilálást ultra-nagy teljesítményű folyadékkromatográf (HPLC) (Waters, USA) alkalmazásával elemeztük tripleTOF 5600 plus (Applied Biosystems, USA) tömegspektrométerrel kombinálva. Összesen 6600 metabolitcsúcsot mértünk, és közülük 180-at strukturálisan azonosítottunk és annotáltunk a házon belüli LC-MS/MS adatbázis szerint. Közülük öt anyagcsereterméket hatvan véletlenszerűen kiválasztott szérummintában kvantifikáltak külső kalibrációs görbékkel Shimadzu nexera x2 ultra HPLC (Shimadzu, Japán) és hármas kvadrupól tömegspektrométer (Shimadzu 8050, Japán) alkalmazásával.

Széklet DNS-extrahálás és metagenomikus szekvenálás

A teljes széklet DNS-t standard módszerekkel extraháltuk.37 A friss genom DNS mintákat mechanikusan fragmentáltuk

400 bp Bioruptor Picóval (Diagenode, Belgium). Mágneses gyöngy alapú módszert alkalmaztunk a DNS-fragmensek szelekciójához egy szokásos protokoll szerint (Agencourt AMPure XP). A könyvtárakat az Illumina NEBnext Ultra II DNS Library Prep Kit (New England BioLabs) alkalmazásával készítettük. Az Illumina HiSeq X Ten platformot ezután 2 × 150 bp páros végű teljes metagenóm szekvenáláshoz használták. Alacsony minőségű vagy humán genomi DNS-leolvasásokat eltávolítottunk.

Bioinformatikai és statisztikai elemzések

Valamennyi módszert online kiegészítő anyagokban részletezték, a statisztikai szkriptek pedig a https://github.com/lish2/omics címen érhetők el.

Állatkísérletek

Valamennyi állatkísérletet a Kínai Mezőgazdasági Egyetem Kísérleti Állattartás Etikai Bizottsága hagyta jóvá. Állati FMT kísérletekhez 13 ESRD beteget és 13 egészséges kontrollt választottunk ki az eredeti 292 alanyból donornak. Az FMT kísérleteket csíra mentes egerekben és antibiotikumokkal kezelt patkányokban végeztük. Egyetlen törzsű zománc kísérletekhez két független állatkísérletet végeztek az E. lenta vagy F. nucleatum (1. vizsgálat) és a probiotikumok (2. vizsgálat, Bifidobacterium animalis A6) szerepének tesztelésében vesebetegségben.

Az állatkísérletek részletei, beleértve a mintagyűjtést, a baktériumtenyésztést és a baktériumszuszpenzió előkészítését, a DNS kivonását és szekvenálását, a valós idejű kvantitatív PCR-t, a szérum uraemiás toxinok mennyiségi meghatározását, valamint a szövettani és immunhisztokémiai elemzéseket, elérhetőek online kiegészítő anyagokban.