Az egyszerű és összetett glikoszfingolipidek szubregionális agyeloszlása ​​az I. típusú mukopoliszacharidózis (Hurler-szindróma) egerekben: az étrend hatása

Genetika és molekuláris patológia, SA patológia a női és gyermekkórházban, Észak-Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Genetika és molekuláris patológia, SA patológia a női és gyermekkórházban, Észak-Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Genetika és molekuláris patológia, SA patológia a női és gyermekkórházban, Észak-Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Genetika és molekuláris patológia, SA patológia a női és gyermekkórházban, Észak-Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Orvostudományi Kar, Adelaide Egyetem, Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Genetika és molekuláris patológia, SA patológia a női és gyermekkórházban, Észak-Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Orvostudományi Kar, Adelaide Egyetem, Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Levelezési és újranyomtatási kérelmek Maria Fullerhez, a Genetikai és Molekuláris Pathology, SA patológiája a Női és Gyermekkórházban, 72 King William Rd, North Adelaide, SA, Ausztrália, 5006. E-mail: [email protected] Keresés a szerző további cikkeiért

Genetika és molekuláris patológia, SA patológia a női és gyermekkórházban, Észak-Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Genetika és molekuláris patológia, SA patológia a női és gyermekkórházban, Észak-Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Genetika és molekuláris patológia, SA patológia a női és gyermekkórházban, Észak-Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Genetika és molekuláris patológia, SA patológia a női és gyermekkórházban, Észak-Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Orvostudományi Kar, Adelaide Egyetem, Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Genetika és molekuláris patológia, SA patológia a női és gyermekkórházban, Észak-Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Orvostudományi Kar, Adelaide Egyetem, Adelaide, Dél-Ausztrália, Ausztrália

Levelezési és újranyomtatási kérelmek Maria Fullerhez, a Genetikai és Molekuláris Pathology, SA patológiája a Női és Gyermekkórházban, 72 King William Rd, North Adelaide, SA, Ausztrália, 5006. E-mail: [email protected] Keresés a szerző további cikkeiért

Absztrakt

Dél-Ausztrália Ausztrália

Használt rövidítések

Az I. típusú mukopoliszacharidózis egy autoszomális recesszív anyagcserezavar, amely a glükózaminoglikánok, heparánszulfát és dermatánszulfát katabolizálásához szükséges α-L-iduronidáz enzim abszolút vagy funkcionális hiányából ered. Következésképpen ezek a részben lebomlott glikozaminoglikánok felhalmozódnak az érintett sejtekben, ami a sejtek, szövetek és szervek krónikus és progresszív állapotromlásához vezet, amely többszörös szervi elégtelenséget eredményez (Neufeld és Muenzer, 2001). Bár az enzimpótló terápia hatékonyan csökkenti az organomegáliát, 87 kDa molekulatömegű rekombináns α-L-iduronidáz túl nagy ahhoz, hogy átlépje a vér-agy gátat, ami haszontalanná teszi az I. típusú mukopoliszacharidózis súlyos formájában rejlő kérlelhetetlen neurodegeneráció szempontjából., Hurler-szindróma (HS) (Sifuentes et al. 2007). Ennek megfelelően a neurológiai betegség a csecsemőkorban progresszív neurokognitív hanyatlást mutat, amely késői gyermekkorban halálhoz vezet, és amelyre nincs kezelés.

Az α-L-iduronidáz célzott megszakításával létrehozott HS egérmutató modellje progresszív klinikai lefolyást mutat (Clarke et al. 1997; Russel et al. 1998). A funkcionális neurokognitív értékelések ebben a modellben már két hónapos korban kimutatták a hipoaktivitást egy új környezetben, amely a szoktatással nem csökken (Reolon et al. 2006; Pán et al. 2008). A memória és a tanulási feladatokat még nem határozták meg olyan világosan, idősebb HS egerek (Wolf et al. 2011) és mások, akik nem számoltak be különbségről (Baldo et al. 2013). A hisztopatológiai és immunhisztokémiai vizsgálatok az idõben elõrehaladott idõsejtekben, mikrogliaban és perivaszkuláris térben megnövekedett lizoszómákat tárnak fel. A krónikus ideggyulladásra utaló Glia-aktiváció és asztrocitózis már négy hónapos korban nyilvánvaló, ami azt jelzi, hogy ez a folyamat ésszerűen az élet elején kezdődik. A gyulladásos folyamat további támogatását hangsúlyozza a kemokinek jelenléte a HS egerek agyában (Ohmi et al. 2003; Wilkinson et al. 2012). Az azonban továbbra sem tisztázott, hogy ezek a megállapítások hogyan kapcsolódnak a betegség emberi egyenértékében megnyilvánuló súlyos neurológiai hanyatláshoz.

Anyagok és metódusok

A HS egérmodellt (Idua -/-, C57BL/6 háttér) a Jackson Laboratóriumtól (Bar Harbor, ME, USA) vásároltuk, és az összes állatprotokollot a Női és Gyermekegészségügyi Hálózat állatetikai bizottsága hagyta jóvá. Egy héttel a párzást megelőzően heterozigóta tenyészpárokat tettek a négy étrend egyikére: dokozahexaénsav (DHA), SF07-021 módosított AIN93G rágcsáló étrend 7% halolaj; linolsav (LA), SF07-022 módosított AIN93G rágcsáló étrend 7% pórsáfrányolaj; magas zsírtartalmú (HF), AIN93G rágcsálózsír megfelelt az SF07-021 és SF07-022 és a Reg (rendszeres), húsmentes patkány- és egér-étrendnek (étrend a Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Ausztrália). Az utódok genotípusát (Clarke et al. 1997) 3 hetes és 10 vad típusú (WT) és 10 HS egér elválasztását követően folytatták az egyes diétákat, kivéve a Reg étrendet, amely 15 HS és 15 WT egeret tartalmazott. Az egereket csoportosan (3–5 egér ketrecben) helyeztük el a táplálkozás szerint 14/10 órás világos/sötét ciklusban, szabályozott hőmérsékletű létesítményben (22 ° C), és hagytuk ad libitum étel és víz. A férfiak és nők aránya minden étrendnél a következő volt: Reg, WT, 8: 6, HS, 5: 10; LA, WT, 6: 4, HS, 4: 6; DHA, WT, 6: 4, HS, 5: 5; HF, WT, 3: 7, HS, 7: 3.

Dizájnt tanulni

Teljes egyfázisú lipid extrakció

LC ‐ ESI ‐ MS/MS

A gangliozid-analízishez 5 μl lipid-extraktumot injektáltunk az oszlopra, és az A és B mozgófázist a fentiekben leírtak szerint a szfingolipid-analízishez használtuk, azzal az eltéréssel, hogy 0,05% NH4OH helyettesítette az NH4COOH-t annak biztosítása érdekében, hogy a nagyobb gangliozidok (MW> 1000 Da) kettős töltésűek legyenek. ionok. Az injekció beadásakor a mozgófázis körülményei 90% A-oldószer és 10% B-oldószer voltak, amelyet lineárisan 5% -kal 30% B-re, 8 perc alatt 60% B-ra, majd 10,5 perc múlva 100% B-ra emeltünk. Ezt 0,5 percig tartották, majd 11 perc alatt visszatértek a 10% B-be, amelyet a következő injekció előtt 1 percig egyensúlyba hoztak. A forrásparaméterek a következők voltak: IS, −4500 V, függönygáz, 25 egység; ütközésgáz, magas; porlasztógáz 1, 20 egység és 2 segédgáz, 45 egység. A gangliozidok egyes fajait nem ütemezett többszörös reakciómonitorozással (S1. Táblázat) negatív ion módban számszerűsítettük, és a koncentrációkat úgy számoltuk ki, hogy az egyes fajok csúcsterületeit a GM1 d18 csúcsterületéhez viszonyítottuk:d3) a MultiQuant 3.0.1 szoftver használatával.

Nyílt terep

A mozgásszervi aktivitást és a feltáró magatartást egy automatizált aktivitásmonitorozó rendszerrel (Harvard apparátus, Holliston, MA, USA) követtük nyomon. Mindegyik egeret külön-külön a nyílt terep (40 × 40 cm) aréna bal sarkában helyeztük el, és 3 percig hagytuk szabadon kutatni. Feljegyeztük a középpontban mért távolság és a központban mért idő arányát, a teljes százalékban kifejezve. Az állatokat 2, 4 és 6 hónapos korban megismételtük.

statisztikai elemzések

A HS és a WT közötti különbségeket szignifikancia szempontjából elemeztük kétfarkú Student segítségével t-Teszt egy F-Teszt homoszkedasztikus varianciára. Meghatároztuk Pearson korrelációs együtthatóit az egyes lipidfajok és az öt agyi régió között, az SPSS 15.0 verzió (IBM, Armonk, NY, USA) segítségével a Windows statisztikai szoftverhez.

Eredmények

Regionális agyi gangliozidok

A GD1, GD2, GM1, GM2 és GM3 egyes kvantifikált acilláncfajai az S1 táblázatban találhatók, anyagcseréjük és szerkezetük vázlata az 1. ábrán látható. Valamennyi faj korrelált az egyes gangliozid osztályokon belül (Pearson korreláció> 0,8) és a d18: 1/18: 0 volt a legkiemelkedőbb izoform. A GM1 és a GD1 egyértelműen a leggyakoribb gangliozid volt az agyban, amely a WT és a HS agy régióiban> 90% -ot tartalmazott. A GM1 szignifikánsan megemelkedett a HS egerek kisagyában 2 és 6 hónapos korban, de a többi agyrégióban nem volt szignifikáns emelkedés (3. ábra). Nem volt különbség a GD1 koncentrációiban a HS és a WT között, és a koncentrációk hasonlóak voltak 2 és 6 hónapos korban (az adatokat nem közöltük).

Ezzel szemben a HS2 egerek mind az öt agyrégiójában a GM2, GM3, GD2 és GD3 szintje széles körben emelkedett a WT-vel összehasonlítva, már 2 hónapos korban. Ezt az emelkedést 6 hónapos korban tartották fenn, további növekedés nélkül (4. ábra). Az LA étrend-kiegészítése képes volt jelentősen csökkenteni a GM2-t a HS egerekben az összes agyi régióban, a kisagy kivételével, és a GM3-t, a kisagy és a hippocampus kivételével (o

Regionális agyszintetikus prekurzorok

Lipida a az egyes fajok összegzésével meghatározott teljes lipidosztály.
Agyszár Cortex Cerebellum Hippocampus Subcortex WT HS WT HS WT HS WT HS WT HS
Cer 6.1 (1.1) 6,8 (0,6) 9,4 (0,9) 11 (0,3) 4,8 (0,1) 6,3 (0,2) 9,0 (0,7) 11. (1.8) 10. cikk (1.3) 10 (0,4)
dhCer 1,0 (0,1) 1,1 (0,1) 1,1 (0,1) 1,3 (0,1) 0,7 (0,05) 0,9 (0,04) 1,2 (0,1) 1,4 (0,2) 1,4 (0,1) 1,3 (0,05)
MHC 98 (7.9) 87 (7.6) 15. cikk (1.2) bekezdés 13 (0,5) 33. (1.9) 36 (1,0) 12. cikk (1.2) bekezdés 9,5 (0,2) 40 (3.7) 34. cikk (3.4)
THC nd. nd. nd. nd. nd. nd. nd. nd. nd. nd.
Szulfatid 65 (7.7) 55 (7.1) 17. cikk (2.9) 12 (0,7) 22. (1.5) 24. cikk (1.1) 28. cikk (2.6) 27. cikk (3.5) 35 (3.8) 29. cikk (3.5)
Sph 0,2 (0,02) 0,2 (0,03) 0,1 (0,01) 0,1 (0,01) 0,1 (0,01) 0,1 (0,005) 0,1 (0,005) 0,1 (0,01) 0,2 (0,02) 0,1 (0,01)
Chol 746 (124) 639 (81) 398 (40) 374 (19) 336 (27) 394 (35) 465 (40) 460 (87) 532 (74) 455 (38)
  • Cer, ceramid; Kol, koleszterin; dhCer, dihidroceramid; HS, Hurler-szindróma; MHC, monohexozilceramid; Sph, szfingozin; THC, trihexosilceramid; nd, nem észlelt; WT, vad típusú.
  • Az eredmények a teljes fehérje nmol/mg-jában jelentettek, és átlagként és standard hibaként (n = 6).
  • a az egyes fajok összegzésével meghatározott teljes lipidosztály.

Motoros aktivitás

A nyílt terepi tesztben a HS egerek mozgásszervi és feltáró aktivitása csökkent a WT egerekhez képest (8. ábra). Noha az életkor várható csökkenése (2-től 6 hónapig) volt mind a WT, mind a HS egerekben, az LA étrendet kapó HS egerek nem csökkentek az életkor előrehaladtával. A legdrámaibb eredményeket a központban eltöltött idő arányában tapasztaltuk, amikor az LA-ben lévő HS egerek 6 hónapos korukra jelentősen felülmúlták a Reg étrenden lévő HS egereket. A középtávolság arányában is megfigyelhető volt a javulás tendenciája, de ez nem érte el a jelentőséget (o = 0,12). Megjegyzendő, hogy a LA-étrenden lévő HS egerek centrális idejének aránya jelentősen megnőtt, összehasonlítva a 6 hónapos Reg Reg étrenden lévő WT egerekkel. Nem volt különbség a WT és a HS egerekben a DHA vagy HF étrendben, összehasonlítva a Reg étrenddel (az adatokat nem közöljük).

Vita

A fejlődő agyban a gangliozid expressziós mintázatának változása nagyrészt a szintézisükért felelős enzimek, nevezetesen a gangliozid szintázok (Yu) időbeli szabályozásának tulajdonítható. et al. 2008). Korábbi munka azt sugallta, hogy a HS-ben az egyszerű gangliozidok legalább egy részének emelkedéséért a csökkent neuraminidáz aktivitás a felelős (Walkley 2004), de újabban a gangliozid szintézis és lebontás együttes hatását vonták be. Mind a csökkent neuraminidáz aktivitást, mind a csökkent GD3, mind a GM2/GM3 szintáz aktivitást úgy ítélték meg, hogy felelősek a HS agyban a gangliozidok regionális emelkedéséért (Kreutz et al. 2013). Eredményeink alátámasztják a hippocampus GM2, GM3 és GD3 szintjének emelkedését, valamint a kisagyban és a kéregben mutatott GM1 emelkedést, rámutatva a módszertanbeli különbségre, a tanulmányban alkalmazott tömegspektrometria specifikusabb és kvantitatívabb, mint Kreutz által alkalmazott vékonyréteg-kromatográfia (TLC) et al. (2013). A gangliozidok általában egybevágtak az agytörzs, a kéreg, a kisagy, a hippocampus és a subcortex között, a gangliozidok minden osztályában a 18: 0 arányú acilfajok domináltak, összhangban az agy lipidprofiljával.

Összefoglalva, megmutattuk, hogy az egyszerű gangliozidok és szomszédos metabolikus közbeiktatóik, a DHC magasak a HS egerek agyában a WT-vel összehasonlítva. A magas LA-tartalmú étrend képes volt jelentősen csökkenteni az a-sorozatú gangliozidokat, valamint javítani a mozgásszervi és a feltáró tevékenység viselkedését. Mivel a gangliozid felhalmozódása már 2 hónapos korban bekövetkezik, és továbbra is megemelkedett, a korrekciós terápiát követő gangliozid mérés hasznos lehet a HS neurológiai megnyilvánulásainak terápiás előnyeinek felmérésében.

Köszönetnyilvánítás és összeférhetetlenségről szóló tájékoztatás

Ezt a munkát nagylelkűen támogatta a Pennsylvaniai Egyetem Orphan Disease Center (USA) kutatási támogatása (MPS1-13-003). A szerzők kijelentik, hogy nincsenek összeférhetetlenségük.

Valamennyi kísérletet az ARRIVE irányelveknek megfelelően végeztük.