Az emberi májszövet hosszú távú tenyésztése fejlett májfunkciókkal

Hamarosan Seng Ng

1 Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Orvostudományi Intézet,

2 Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Stanford Egyetem Orvostudományi Kar, Stanford, Kalifornia, USA.

3 Anyagtudományi és Mérnöki Iskola, Nanyang Technológiai Egyetem, Szingapúr, Szingapúr.

Anming Xiong

1 Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Orvostudományi Intézet,

2 Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Stanford Egyetem Orvostudományi Kar, Stanford, Kalifornia, USA.

Khanh Nguyen

1 Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Orvostudományi Intézet,

2 Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Stanford Egyetem Orvostudományi Kar, Stanford, Kalifornia, USA.

Marilyn Masek

1 Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Orvostudományi Intézet,

2 Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Stanford Egyetem Orvostudományi Kar, Stanford, Kalifornia, USA.

4 A Stanfordi Egyetem Orvostudományi Karának Patológiai Osztálya,

Da Yoon Nem

1 Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Orvostudományi Intézet,

2 Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Stanford Egyetem Orvostudományi Kar, Stanford, Kalifornia, USA.

5 Biomérnöki Tanszék, Stanford Egyetem, Kalifornia, Stanford, USA.

Menashe Elazar

1 Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Orvostudományi Intézet,

2 Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Stanford Egyetem Orvostudományi Kar, Stanford, Kalifornia, USA.

Eyal Shteyer

6 Gyermek gasztroenterológiai és táplálkozási osztály, Shaare Zedek Orvosi Központ, Jeruzsálem, Izrael.

Mark A. Winters

1 Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Orvostudományi Intézet,

2 Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Stanford Egyetem Orvostudományi Kar, Stanford, Kalifornia, USA.

Amy Voedisch

7 Szülészeti és Nőgyógyászati Osztály,

Kate Shaw

7 Szülészeti és Nőgyógyászati Osztály,

Tamir Rashid sejk

1 Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Orvostudományi Intézet,

2 Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Stanford Egyetem Orvostudományi Kar, Stanford, Kalifornia, USA.

Curtis W. Frank

8 Vegyészmérnöki Tanszék, Stanford Egyetem, Kalifornia, Stanford, USA.

Nam Joon Cho

3 Anyagtudományi és Mérnöki Iskola, Nanyang Technológiai Egyetem, Szingapúr, Szingapúr.

Jeffrey S. Glenn

1 Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Orvostudományi Intézet,

2 Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Stanford Egyetem Orvostudományi Kar, Stanford, Kalifornia, USA.

Társított adatok

Absztrakt

Bevezetés

A végstádiumú májbetegség (ESLD) a világméretű morbiditás és halálozás egyik fő oka. A májtranszplantáció az egyetlen elérhető kezelés, bár egyre nagyobb a különbség a májtranszplantáció vagy a sejtpótló terápiák iránti igény és a rendelkezésre álló donorellátás között (1). A vírusfertőzések, például a hepatitis C vírus (HCV), az ESLD fontos etiológiája. A megtervezett emberi májszövetek rendelkezésre állása nagy előnyt jelentene a transzplantációs lehetőségek növelésében, valamint a potenciális májsegítő eszközökben, amelyek hídként szolgálhatnak a transzplantációhoz.

A máj a gyógyszerek feldolgozásának kulcsfontosságú szerve is, a hepatotoxicitás pedig a kábítószer-elégtelenség egyik fő oka - gyakran a fejlesztési folyamat késői szakaszában fedezik fel, néha drámai következményekkel (2). A vegyület legerősebb vagy legmérgezőbb formája nem lehet az elsődleges vegyület, hanem annak metabolitjai egyike (3). Ezenkívül egy vegyület elsődleges in vivo metabolitja drasztikusan változhat az állatfajok függvényében, amelyekben értékelik (4). Az emberspecifikus gyógyszer-anyagcsere és a hepatotoxicitás pontos előrejelzésének képessége elengedhetetlen a hatékonyabb és biztonságosabb gyógyszerfejlesztéshez. Sajnos a jelenlegi preklinikai állatkísérleti fajok nem képesek kimutatni az emberre specifikus gyógyszer-metabolitokat vagy a hepatotoxicitást. Míg az emberi májsejtek tenyészetei segíthetnek ennek a célnak a teljesítésében, az elsődleges emberi májsejtek nem sokkal a standard 2-dimenziós tenyészetbe történő beültetésük után gyorsan elveszítik a fejlett differenciálódás jellemzőit, például a citokróm P450 (CYP) gyógyszert metabolizáló enzimek expresszióját vagy a a természetes emberi hepatitis vírusokkal való fertőzés támogatásának képessége (5). Az emberi májdaganatokból származó májsejtvonalak szintén jellemzően elveszítették korábbi differenciált állapotuk kulcsfontosságú markereit.

Eredmények

3D hatszögletű elrendezésű lobuláris emberi májszövetek előállítása.

(A) Az invertált kolloid kristályos (ICC) állványgyártás sematikus ábrázolása. (B) Szabadon álló kolloid kristályrács és (C) az eredményül kapott ICC nyílhegyekkel jelölt, egymással összekapcsolt ablakokkal és az ICC gerincével, amelyeket csillagok jeleznek. A magzati teljes májsejtek morfológiája a Col-I ICC-ben (D) vetéskor és (E) 2 héttel a vetés után. (F) Változó nyomású pásztázó elektronmikroszkópos kép, amely bemutatja a májszövetek klasztereit, amelyek nagy összekapcsolhatósággal rendelkeznek az ICC különböző szintjein. (G és H) A módosított májszövetek immunfluoreszcens képalkotása 2 héttel az albumin (piros) és a DAPI (kék) beoltása után (G) CK19 (zöld) vagy (H) vimentin (zöld). (én) Cholyl-L-lizil-fluoreszcein (CLF) felhalmozódása a májszövetekben 40 perc CLF inkubálás után, majd 40 perc mosás után. (J-L) Immunhisztológiai képek, amelyek heterogén populációkat mutatnak be az albuminra festett, módosított szövetekben (J), CK19 (K) és CD68 (L). Mérlegsorok: 100 μm.

Hosszan tartó citokróm P450 gyógyszer metabolizáló aktivitás a tervezett emberi májszövetekben.

Az FTLC-ket minden platformon 10 μM clemizollal kezeltük a megadott időpontokban 24 órán át. A kezelt tenyészetek felülúszókat a kezelés végén összegyűjtöttük az M1 metabolit termelésének mérésére LC/MS alkalmazásával. Az adatok átlag ± SD, legalább 5 biológiai ismétléssel. A jobb oldali panel a klemizol fő emberi metabolitját, az M1-et mutatja, amelyet főleg a CYP3A4 generál.

Betegtől származó HCV-oltással történő fertőzés és az antivirális aktivitás értékelése.

A mag-összmájsejtek (FTLC) párhuzamos tenyészeteit a Col-I ICC-ben hepatitis C vírus (HCV) inokulátummal oltottuk a beoltást követő 9. napon. Az oltás után 4 órával a vírust eltávolítottuk, a tenyészeteket ötször PBS-sel mostuk, és friss táptalajt adtunk hozzá; mintákat gyűjtöttünk a mosás előtt és után a megadott időközönként a qPCR HCV RNS elemzéséhez. A tenyészetek egyik készletét az oltás után a 11. napon 1 μM sofosbuvirrel kezeltük (piros nyomkövetés; a gyógyszeres kezelést nyíllal jelöltük), míg egy másik készletet önmagában vivőanyaggal kezeltünk (fekete nyomkövetés). Az adatok átlag ± SD, 5 biológiai ismétléssel.

A megtervezett emberi májszövetek halálos emberspecifikus gyógyszer-hepatotoxicitást jósolnak.

Végül úgy gondoljuk, hogy ezek a megtervezett emberi májszövetek új rendszert nyújthatnak az eddig nehezen modellezhető más fontos májbetegségek, például az elsődleges vagy áttétes májrák és a máj stádiumú maláriafertőzések tanulmányozására, és hasznosnak bizonyulhatnak a jövő májműködésében. segédeszközök vagy sejtpótló terápiák. Összefoglalva, leírhatunk egy könnyen méretezhető 3D humán máj-kokultúra modellt, amely rendkívül alkalmazkodó komponensekkel rendelkezik. Képes hosszabb ideig megmutatni a fejlett emberi májdifferenciálódás főbb jellemzőit, amelyeknek hasznosak lehetnek a gyógyszerfelfedezés és fejlesztési erőfeszítések javításához, a jelölt gyógyszerbiztonság szabályozási értékelésének javításához, valamint a normál és kórokozó folyamatok tanulmányozásához, amelyek a megőrzött hiteles májtól függenek funkció.

Mód

Sejtek, táptalajok és vegyszerek.

A HUVEC-eket és a HepG2-t az ATCC-től vásárolták, és megerősítették, hogy mikoplazmától mentesek. Az FTLC növekedési táptalaj inzulin, transzferrin, szelén (ITS +) premix (BD Pharmingen), 1 × 10–7 M dexametazon, 10 mM nikotinamid, 0,5 mM aszkorbinsav-2-foszfát, 4 mM L -glutamin, 0,1 mg/ml heparin, 5% FBS, 100 E/ml penicillin G és sztreptomicin, valamint 20 ng/ml epithelialis növekedési faktor. Az összes sejtet nedvesített, 5% szén-dioxid, 95% levegő inkubátorban tenyésztettük 37 ° C-on. Minden vegyszert és regentet a Sigma Chemicaltól vásároltunk, hacsak másképp nem jelöljük meg.

Az inverz kolloid kristályos hidrogél állvány gyártása.

Az emberi magzati májsejtek izolálása.

Az emberi magzati májat (14–22 hét) az Advanced Biosciences Research Inc.-től vásárolták, vagy a Stanfordi Egyetemi Kórháztól és Klinikáktól szerezték be az összes egyetemi, állami és szövetségi előírásnak megfelelően. Az epefát és a májszövet érágait először szikével és csipesszel távolították el. A májat ezután kisebb méretű darabokra aprítottuk, és kétszer emésztettük 0,6% -os kollagenáz IV-vel és 0,03% DNáz I-gyel HBSS-ben 30 percig 37 ° C-on. Az emésztett szövetet 70 μm-es nejlonhálón átszűrjük a zsír és a klaszterek eltávolítása érdekében. A leszűrt sejteket ezután kétszer kis sebességgel PBS-sel centrifugáltuk annak érdekében, hogy a felülúszóban lévő hematopoietikus sejteket eltávolítsuk a teljes populációból. A fibroblaszt-szerű sejtek teljes emberi magzati májsejtek kimerítéséhez a sejtpopulációt tovább alkalmaztuk Ficoll-Paque gradiensre, és centrifugáltuk (Amersham Biosciences, GE Healthcare) 30 percig 4 ° C-on 980 g-on. A kapott sejteket humán FTLC-ként határoztuk meg.

TEM elemzés.

A mintákat 2% paraformaldehidet és 2,5% glutáraldehidet tartalmazó oldattal rögzítettük nátrium-kakodilát pufferben. A mintákat ezután 2% -os ozmium-tetroxidban rögzítettük, majd etil-alkohol-sorozat és propilén-oxid segítségével dehidratáltuk. Ezután a mintákat epongyantával infiltráltuk és beágyazottuk, majd vastag metszetekkel és toluidinkékkel megfestettük, vékony metszetekkel, majd utanfestettük uranil-acetáttal és ólom-citráttal. A rácsokat Hitachi 7650 transzmissziós elektronmikroszkóppal néztük meg.

Immunfluoreszcencia és IHC elemzés.

Az ICC mintákat egy éjszakán át fixáltuk pufferolt 4% paraformaldehidben. A mintákat egy éjszakán át 2% Triton-X100 (Sigma-Aldrich) PBS-ben kezeltük szobahőmérsékleten. A mintákat először PBS-sel öblítettük, majd 5 percig 0,3% -os hidrogén-peroxiddal kezeltük. A mintákat ezt követően 2% Triton-X100 és 10% FBS-sel blokkoltuk 1 órán át, majd primer antitesttel inkubáltuk (albumin [Bethyl, A80-129A], citokeratin 19 [Abcam, ab52625] vagy vimentin [Abcam, ab24525] ellen). egy éjszakán át 4 ° C-on. A mintákat PBS-sel mostuk és szekunder antitestben inkubáltuk (Alexa Flour 647 szamár anti-kecske IgG [Abcam, ab150131], Alexa Flour 594 szamár nyúl elleni IgG [Abcam, ab150076] vagy FITC szamár csirkeellenes IgY [Abcam, ab63507 ]) egy éjszakán át 4 ° C-on, majd konfokális képmikroszkóppal (Operetta, Perkin Elmer) történő megjelenítés, nagy formátumú sCMOS kamerával és a Harmony nagy tartalmú elemző szoftverrel (Perkin Elmer) felszerelve.

In vitro gyógyszer metabolizmus vizsgálatok.

Az elsődleges vegyületeket és azok főbb metabolitjait MS-sel (Agilent Technologies) azonosítottuk és jellemeztük, amelyek elektro-spray-ionizációs forrással voltak felszerelve, lényegében a leírtak szerint (23). Röviden, a forrásban lévő felhevített kapilláris hőmérsékletet 325 ° C-on tartottuk. Összesen szkennelt (m/z 110–1000) vagy adatfüggő MS/MS spektrumokat gyűjtöttünk. A metabolitokat az MS/MS-ben bekövetkezett ütközés által kiváltott disszociációs viselkedés, a pontos tömeg és a retenciós idő alapján azonosították. A vegyületek kvantitatív elemzését kalibrációs görbe alkalmazásával, 1 000 ng/ml belső standard 1- (p-bróm-benzil) -2- (1-pirrolidinil-metil) -benzimidazol alkalmazásával végeztük.

HCV-fertőzés HCV-fertőzött betegek szérumaival.

A páciensszérumokat leszűrjük és bepároljuk egy 100 000 névleges molekulatömeg-határú pórusméretű centrifugális szűrőegységgel (Merck Milipore). A HCV titerét qPCR segítségével határoztuk meg. Az összes RNS-t TRIzol RNS izoláló reagensekkel (Invitrogen) extraháltuk és tisztítottuk a gyártó utasításainak megfelelően. Az első szálú cDNS-t nagy kapacitású RNS-cDNS készlet (Invitrogen) segítségével szintetizáltuk. A HCV RNS kópiaszámát az iTaq Universal Probes One-Kit Kit (Bio-Rad) segítségével számszerűsítettük. Az 5 ′ - CTTCACGCAGAAAGCGTCTA - 3 ′ és 5 ′ - CAAGCACCCTTCAGGCAGT - 3 ′ primereket alkalmaztuk a HCV RNS amplifikálásához, és 6-FAM-TATGAGTGTCGTGCAGCCTC-MGB-NFQ (Applied Biosystems) mint belső probát használtunk. A PCR termékek valós idejű mérését CFX96 Real-Time System, C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) segítségével végeztük. A J6/JFH HCVcc 2a genotípusú klón Charles Rice, a Rockefeller Egyetem (New York, New York, USA) ajándéka volt.

FIAU által kiváltott hepatotoxicitási vizsgálatok.

A citotoxicitást LDH szivárgási vizsgálattal (CytoTox-ONE Homogén Membrán Integrity Assay, Promega) mértük. Az L (+) - laktát termelését kereskedelmi vizsgálati készlet alkalmazásával követtük nyomon a gyártó (Abcam) utasításainak megfelelően. A máj-specifikus funkciót albumin ELISA assay-vel (Bethyl) mértük. A gyulladásos citokint IL-6 humán ELISA kit (Invitrogen) segítségével mértük. A sejtek nekrózisát és a mitokondriális funkciót a kezelés végén Mitochondrial ToxGlo teszttel (Promega) mértük.

Statisztika.

Az adatokat a Prism 6 szoftverrel (GraphPad Sofware Inc.) elemeztük, és átlag ± SD-ben jelenítettük meg. A kísérleti és a kontrollcsoportok páronkénti összehasonlítását párosított vagy nem párosított 2-farkú Student t teszttel végeztük. Az összehasonlító csoportok közötti variancia egyenértékűnek bizonyult. Több csoportos összehasonlítást végeztek egyirányú ANOVA alkalmazásával, majd Dunnett utólagos tesztjével. A minta nagyságát előre becsülték a korábban publikált kutatásokból és a laboratóriumban végzett kísérleti kísérletekből. Eltérő rendelkezés hiányában P (14M, pdf)

Köszönetnyilvánítás

Ezt a kutatást a Burroughs Wellcome Fund Clinical Scientist Award in Translational Research (JSG) támogatta; Nemzeti Kutatási Alapítvány (NRF-NRFF2011-01) és az Országos Orvosi Kutatási Tanács (NMRC/CBRG/0005/2012) (NJC); a Nemzeti Egészségügyi Intézetek R01AI099245 (JSG) és U19AI109662 (JSG); és egy Fulbright diplomás tanulmányi díj (DYN).

Lábjegyzetek

Összeférhetetlenség: A szerzők kijelentették, hogy nincs összeférhetetlenség.