Az étrend hatása a nyálmirigy hipertrófiavírussal (MdSGHV) injektált felnőtt házi légyre (Diptera: Muscidae)

Jennifer Schaler

1 Stockbridge Mezőgazdasági Iskola, Természettudományi Főiskola, Massachusettsi Egyetem, Amherst, MA

John Stoffolano, ifj

1 Stockbridge Mezőgazdasági Iskola, Természettudományi Főiskola, Massachusettsi Egyetem, Amherst, MA

Anna Maria Fausto

2 Dipartimento per la Innovazione nei Sistemi Biologici, Agroalimentari e Forestali, Università della Tuscia, Viterbo, Olaszország

Gambellini Gabriella

3 Grandi Attrezzature (CGA), Sezione di Microscopia Elettronica Università degli Studi della Tuscia, Viterbo, Olaszország

John Burand

4 Mikrobiológiai Tanszék, Természettudományi Főiskola, Massachusettsi Egyetem, Amherst, MA

Absztrakt

A nyálmirigy hipertrófiavírusának (SGHV) három legyfaj esetében az eddigi kutatása arra összpontosított, hogy a felnőtt legyek hozzáférjenek fehérjetartalmú étrendhez és ezt tartsák. Mivel számos tanulmány kimutatta, hogy az étrend számos organizmusban befolyásolja a vírusfertőzést, ez a tanulmány egy fehérje nélküli étrend hatását vizsgálta az SGHV vírus hatására felnőtt házi legyeknél, a Musca domestica-nál. L. A vírussal fertőzött és kizárólag cukortartalmú diétán tartott felnőtteknél a nyálmirigyek inkább kék, mint szürkés színűek voltak, és enyhe hipertrófiát mutattak a fehérjével táplált legyekhez képest. Lehetséges volt a vírus visszaszerzése ezekből a mirigyekből és a fertőzött legyek sikeres megfertőzése. Különböző korokban történő injekciózáskor a csak cukorral táplált nőstény legyek azt mutatták, hogy kortól függetlenül a cukorral táplált legyek mégis megfertőződtek, és megmutatták a mirigyek patológiáját. Ezenkívül az elektronmikroszkópos vizsgálatok ultrastrukturális szinten feltárták, hogy nincs különbség a vírusreplikáció között a fehérjetartalmú étrendet fogyasztó felnőttek nyálmirigyeinek sejtjeiben.

Bevezetés

Anyagok és metódusok

A legyek és az MdSGHV megszerzése és fenntartása

Az MdSGHV injekciója

A felnőtteket 2 percig hidegen immobilizáltuk -20 ° C-on, mielőtt beadták őket. Az injekciókat B-D Safety-Lok, 1 ml-es 29G1/2 inzulinfecskendővel (0,3 × 13 mm) végeztük, ULTRA-FINE tűvel, lábpedállal működtetett kdScientfic fecskendő szivattyúhoz rögzítve. BioQuip pehelysúlyú csipeszek segítségével a legyet a fecskendő tűjére helyeztük, míg 2,5 µl PBS-ben 1: 1000 arányban hígított MdSGHV mintát injektáltunk a mezothorax oldalába. Az egyes kezelések során használt legyeket ugyanazon módon előállított vírusmintával fertőztük meg. Az injekció beadása után a legyeket tiszta, 20 × 20 × 20 cm méretű alumínium ketrecekbe tették vízzel vagy csak granulált cukorral, vagy granulált cukor és teljes tejpor 50:50 arányú keverékével. Az injekció beadása után a ketrecbe rakott legyeket egy Percival Intellus környezeti kamrában tartottuk 26 ° C-ra, 40% relatív páratartalomra és 16L: 8D fotoperiódusra (Stoffolano 1974) 7 napig, amikor a fertőzést/patológiát boncolással értékeltük.

A vírusos oltás megszerzése a cukorral táplált legyek nyálmirigyéből

A vírussal fertőzött legyeket boncolgattuk, és a fertőzött nyálmirigyeket 1,5 ml PBS-sel ellátott 1,5 ml-es centrifugacsőbe helyeztük, és kézi mozsárral homogenizáltuk. Az inokulumot 0,45 µm-es fecskendőszűrőn átszűrtük, majd -80 ° C-os fagyasztóban tároltuk, amíg fel nem használtuk a fertőzőképesség ellenőrzésére és a PCR-analízishez.

Csak PBS-sel injektált legyek szolgáltak kontrollként.

A nyálmirigyek boncolása és képalkotás

A legyeket műanyag pohárba tették, és -80 ° C-os fagyasztóba tették 4 percre, majd egy-egy Ento-csapok segítségével egy boncoló edényre tették, hogy rögzítsék őket Bausch & Lomb boncoló mikroszkóp alatt. Körülbelül 300 µl PBS-t használtak a légy hasának elárasztására, és a rozsdamentes acél sz. 5 csipesz, amelyet a has hasítására és a nyálmirigyek eltávolítására használnak. A mirigyek legjobb eltávolítása érdekében a nyálmirigyeket a nyálmirigyben a nyálmirigyek közös csatornája ragadta meg. Mindegyik mirigypárt 1,5 ml mikrocentrifuga csövekbe helyeztük 50 µl PBS-sel. A mérésekhez használt fertőzött legyek mirigyeit (N = 46 mind a cukorral táplált, mind N = 44 a fehérjével táplált legyek esetében) egy üveglemezre tettük PBS-ben, és Olympus Phase mikroszkóppal mértük szemmikrométerrel. Két mérést hajtottak végre: az egyik a nyálmirigy végbélének méréséből állt (1. ábra, DM), míg a másik a keskenyebb szélesség méréséből állt, amely közvetlenül az izzót megelőzte (1. ábra, csillag). A képeket AxioCam ERc5s-sel készítették Zen képalkotó programmal.

hatása

Fehérjével táplált, felnőtt Musca domestica nyálmirigyének disztális szakaszának SEM-je, amely megmutatja, hogy hol mértek 2-t és 3-at 3 vettünk. A DM a megnagyobbodott distalis hagymás rész. * A többi mérést közvetlenül a terület mögött (vagyis a szűkebb helyen) végezték. Méretarány = 100,0 µm.

PCR protokoll

A fehérjefosztott legyek nyálmirigyeinek MdSGHV-fertőzését két különböző primerkészlettel végzett PCR-analízissel igazoltuk. A cukorral táplált legyek fertőzött nyálmirigyből származó DNS-t (N = 10) Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit-rel tisztítottuk a gyártó protokollja szerint. A PCR-ciklus körülményei 94 ° C-on 5 percig voltak a kezdeti templát denaturáláshoz, majd 35 ciklus 94 ° C-on 45 másodpercig, 45,2 ° C-on 45 másodpercig, 72 ° C-on 1 percig, az utolsó lépés 72 ° C volt. 7 percig. Két primer készletet használtunk, egy degenerált p74 primer készletet és egy MdSGHV ORF106-ra specifikus primert (Abd-Alla és mtsai 2009). A PCR termékeket 1% agaróz gélen elemeztük (az eredményeket nem tartalmazza).

A nyálmirigyek TEM és SEM

A TEM szakaszokat Guerra és munkatársai szerint készítettük el és tekintettük meg. (2015). A pásztázó elektronmikroszkópia (SEM) céljából a legyeket PBS-ben boncoltuk, a nyálmirigyeket gondosan eltávolítottuk és 80% -os etanolba helyeztük, amíg a kritikus pont folyékony CO2 alkalmazásával megszáradt. A mirigyeket ezután csonkokra, 15 nm-es arannyal bevont porlasztóra szerelték és FEI Quanta 200 SEM-ben (FEI Company, Hillsboro, OR) 10 kV-os feszültségen vizsgálták az Mt. elektronmikroszkópos létesítményében. Holyoke Főiskola, South Hadley, MA.

Az életkor hatása a cukorral táplált legyek fogékonyságára

Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk az étrendnek a legyek érzékenységére gyakorolt ​​hatását egy adott napon a posztemergencia után, hím és nőstény legyek ketrecét (N = 110) készítettük, és a legyek csak granulált cukrot kaptak a 14–39. a kohorsz hímjei a 14. napra elhunytak) a fentiek szerint vírust injektáltak. Az injekciót követő hét napon, a 14–39. Napon az összes megmaradt legyet feldaraboltuk, hogy meghatározzuk a fogékonyságot a nyálmirigy hipertrófiája alapján.

Statisztika

Az Excel alkalmazásával két minta t-próbáját feltételezve, hogy a vírusfertőzött, felnőtt HF nyálmirigyek keskeny régiójának és terminális hagymás régiójának szélességénél egyenlőtlen eltéréseket feltételezünk, a statisztikai szignifikancia meghatározásához.

Eredmények

A vírus hatása a cukorral táplált legyek nyálmirigyének méretére

Mindkét nem vírusinjektált, felnőtt HF-je kisebb nyálmirigyekkel rendelkezett, amikor a légy-diéta csak cukorra korlátozódott (N = 46), összehasonlítva a fehérjével és cukorral táplált legyekkel (N = 44). A fehérjével táplált legyekből előállított vírussal történő injekció után 7 napon belül valamennyi fertőzött, cukorral táplált legynél az SGHV fertőzés sötétkék színtünetei és enyhe hipertrófiája jelentkezett. A fehérje/cukor étrendet biztosító HF-ben nyálmirigyek átlagosan 23,75% -kal nagyobbak voltak, mint a csak cukorral táplált legyeknél (2., 3. ábra). 3). Két mintából t-tesztet hajtottak végre, egyenlőtlen eltéréseket feltételezve, a vírusfertőzött, felnőtt HF nyálmirigyeinek szűkebb szélességére vagy hagymaszélességére. A t Stat 5,57, a t kritikus pedig 1,66 volt. A t Stat nagyobb, mint a t kritikus érték, így az eredmények statisztikailag szignifikánsak.

Az étrend hatása a vírusfertőzött felnőtt házi legyek mindkét nemének nyálmirigyére szélességként mérve a mirigy keskeny részén (lásd * az 1. ábrán). A keskenyebb szélességet közvetlenül a mirigy terminális izzója előtt mértük. PS = 350,4 és S = 276,0; P ≤ 0,05.

Az étrend hatása mindkét nemi vírusfertőzött, felnőtt házi legyek nyálmirigyének disztális hagymájára (lásd 1. ábra, DM).

A cukorral táplált étrend hatása a vírus kompetenciájára más legyek megfertőzésére

A korlátozott, csak cukortartalmú étrenddel táplált legyekbe SGHV-t injektáltak, és 7 napos injekció után boncolták. A nyálmirigyeket visszanyertük és oltóanyagot készítettünk belőlük. Az oltóanyagot nem fertőzött, csak cukorral táplált legyekbe injektáltuk, hogy korlátozott étrendű legyekből származó vírus virulenciáját teszteljük. Az összes befecskendezett legyet (N = 23) 7 napos injektálás után boncoltuk. Ezek a legyek mindegyike enyhe hipertrófiát mutatott az SGHV kék színtüneteivel, és vírus jelenléte szempontjából PCR-pozitívak voltak.

Az életkor hatása a cukorral táplált legyek fogékonyságára

A 110 eredeti legy közül csak nőstények élték túl és 72% -os túlélést jelentettek a csak cukrot kapott legyeknél. A különböző napokon boncolt legyek száma a posztklózió után 37 és 39 napnál minimum egy-egy legyet változott. Ellenkező esetben a túlélő légyszám a különböző napokon 3 és 15 között változott. A túlélő 80 nő boncolása 7 nap utáni injekció után azt mutatta, hogy a cukorral táplált nőstények 100% -a az SGHV fertőzésre jellemző kóros tüneteket mutat, jelezve, hogy képesek támogatni a vírus replikációját.

Az étrend hatása a cukorral táplált, vírusos injektált legyek nyálmirigyeinek ultraszerkezetére

Csak a cukorral táplált legyek nyálmirigyeinek TEM-je más vizsgálatokban a vírus replikációjának ultrastrukturális bizonyítékát mutatja, amely emlékeztet a fehérjével táplált legyek esetében megfigyeltekre, beleértve a nukleokapszidok összeszerelését a magban és a burkolt vírusrészecskék kötegeit a fertőzött citoplazmában sejtek (4. ábra) (Coler és mtsai 1993, Geden és mtsai 2008). Míg a nukleokapszidok csoportjai a virogén sztrómához kapcsolódnak, az egyes részecskék, amelyek a mag perifériáján megfigyelhetők, gyakran a maghártyához igazodnak és látszólag kilépnek.

A vírusfertőzött, csak cukorral táplált, felnőtt HF nyálmirigyének TEM-je. A mag (Nu) számos vírus nukleokapszidot tartalmaz, amelyek a virogén sztrómához kapcsolódnak (fehér konvergens nyilak). A fekete függőleges nyíl egy nukleokapszidot mutat, amely elhagyja a sztrómát, és belép a nukleoplazmába (a bal alsó rész beillesztése ennek a területnek a nagyítása). A magmembránhoz igazodó nukleokapszidok (Nm) (lásd egyetlen fehér nyíl és betét nagyítását mutató betét), mielőtt belépnének a citoplazmába (Cy). A betéten egy köteg burkolt (MdSGHV) nukleokapszid (függőleges nyíl) látható a citoplazmában, és egyetlen burkolt virion hosszanti szakasza (vízszintes nyílja) látható a citoplazmában, amelyet a feketével körbevett területről vettek. A skála sávja = 2 µm.

Vita

A rovarok nyálmirigyei rendkívül fontosak a különféle vírusos kórokozók replikációs ciklusában és vektorozásában. Így a felnőtt HF és a hozzá kapcsolódó vírus kiváló modellrendszer a vírusok rovar-vektorozásának tanulmányozására, amelynek során a fertőzés és az átvitel mechanizmusait még tisztázni kell (Kariithi et al. 2017a). A vírus azon képessége, hogy átvegye a petefészkek fejlődését és megakadályozza a petesejtek kialakulását, valamint a vírusnak a párzás megakadályozására gyakorolt ​​hatása újszerű módszerek kifejlesztéséhez vezethet a világon a jövőbeni kártevők elleni védekezéshez.

Következtetés

A diétának kimutatták, hogy fiziológiai hatással van a légy nyálmirigyére, ha a méretet illeti. Az étrendben fehérjével rendelkező házi legyek mirigyei 23,75% -kal nagyobbak, mint a csak cukorral tápláltak, ami arra utal, hogy a fehérje hiánya az étrendben nemcsak a JH termelést, hanem a mirigyek méretét is befolyásolja a fehérjével táplált legyekkel szemben (Yin és Stoffolano 1990) . A cukorral táplált, vírusfertőzött legyeknél a nyálmirigyek méretnövekedésének hiánya ellenére a vírusreplikáció ezekben a mirigyekben normálisnak tűnt, és fertőző volt, ha csak fertőzött, csak cukorral táplált legyekbe injektálták őket.