Az étrendi fehérje jellege befolyásolja a szövetek közötti étrend 15 N diszkriminációs tényezőit a laboratóriumi patkányokban

Társulások INRA, CRNH-IdF, UMR914 Táplálkozási élettan és befogadó magatartás, Párizs, Franciaország, AgroParisTech, CRNH-IdF, UMR914 Táplálkozási élettan és befogadó magatartás, Párizs, Franciaország

Nathalie Poupin,
Cécile Bos,
François Mariotti,
Jean-François Huneau,
Daniel Tomé,
Hélène Fouillet

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Poupin N, Bos C, Mariotti F, Huneau J-F, Tomé D, Fouillet H (2011) Az étrendi fehérje jellege befolyásolja a szövet-étrend 15 N diszkriminációs tényezőket laboratóriumi patkányokban. PLoS ONE 6 (11): e28046. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028046

Szerkesztő: Stephane Blanc, Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien, Franciaország

Fogadott: 2011. június 8 .; Elfogadott: 2011. október 31 .; Közzétett: 2011. november 22

Finanszírozás: Nathalie Poupint a francia kutatási minisztérium doktori ösztöndíja támogatja. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők elolvasták a folyóirat politikáját és a következő konfliktusokkal küzdenek: Az egyik szerző (Daniel Tomé) a PLoS ONE tudományos szerkesztőségének tagja.

Bevezetés

Eredmények

Testösszetétel, szöveti tömeg és nitrogéntartalom

A tejfehérjével (MP) vagy a szójafehérjével (SP) diétát kapó két kísérleti csoport növekedési sebessége és szöveti tömege hasonló volt (1. táblázat). A szövetek fehérje (PF) és nem fehérje (nPF) frakcióinak nitrogéntartalma a 3 hét kísérleti periódus végén hasonló volt a csoportok között (S1. Táblázat), kivéve az összes izom nPF-jének alacsonyabb nitrogéntartalmát tömeg (-37%) az SP-vel táplált patkányokban az MP-vel összehasonlítva. A diéta nem befolyásolta a szövetek összes nitrogéntartalmának egyikét sem (S1. Táblázat). Nem találtunk különbséget a plazmafehérjék és a karbamid nitrogéntartalmában a csoportok között (S1. Táblázat).

A Δ 15 N változásai a szövetek és a fehérjék között

Δ 15 N (A) szöveti fehérjefrakcióból (δ 15 Nprotein frakció − δ 15 Ndiet), (B) szöveti nem fehérjefrakciókból (δ 15 Nnon-fehérje frakció − δ 15 Ndiet) és (C) plazma karbamidból (δ 15 N Az MP (fekete sávok) és az SP (szürke sávok) étrendet tápláló patkányok Nplasma karbamid − δ 15 Ndiet). Az értékek átlag ± SD. * Az étrendi fehérjeforrás hatása egy adott szövetben (Post hoc tesztek Tukey-beállítással, P 2. táblázat. A tejfehérjével vagy szójafehérjével táplált patkányok nitrogén-izotópos diszkriminációs értékeinek eltérései a különböző szövetek és a szövetek nitrogénfrakciói között alapú étrend 3 hétig.

A diéta hatása a Δ 15 N-re a szövetekben és a fehérjékben

A 15 N a fehérjeforráshoz képest is változó volt. Szöveti szinten a máj, a vese és a vastagbél 15 N-mal jobban dúsult az SP étrendet tápláló patkányokban, mint az MP étrendet tápláló patkányokban, ami magasabb viszcerális Δ 15 N-t eredményezett (3,53 ‰ ± 0,14 ‰ és 2,58 ‰ ± 0,11 ‰ SP-vel és MP-vel, 2. táblázat). Fehérje szinten a Δ 15 N értékek magasabbak voltak SP-vel, mint MP-étrenddel az összes szövet PF-jében, kivéve a SI nyálkahártyáját (1A. Ábra). Ezek a különbségek a két étrend között szövetenként is változtak. A vastagbélfehérjékben a Δ 15 N értékek ~ 160% -kal magasabbak voltak az SP csoportban, mint az MP csoportban (3,52 ‰ és 1,35 ‰), ∼60% -kal magasabbak a vese fehérjékben (2,75 ‰ és 1,73 ‰), illetve gyomorfehérjék (3,39 ‰, illetve 2,05 ‰), ~ 40% -kal magasabbak a máj konstitutív fehérjéiben (4,14 ‰ és 2,98 ‰, illetve ∼20% -kal magasabbak a májból exportált plazmafehérjékben (4,61 ‰ és 3,81 ‰).

A Δ 15 N eltérései a plazma és a szövetek nitrogénfrakciói között

Ezenkívül a Δ 15 N értékek különböztek a plazma (PF vs. karbamid) és a szövetek (PF vs. nPF) nitrogénfrakciói között. Bármi legyen is az étrend, a plazma karbamid 15 N-ban fogyott az étrendhez és a plazma PF-hez viszonyítva, és nem volt diétás hatása a plazma karbamid Δ 15 N értékeire (−1,36 ± 1,66 ‰ és −1,61 ± 1,22 ‰ MP-ben és SP csoportok). A plazma karbamidból szintén 15 N-mentes volt a máj nPF-hez, annak prekurzor-készletéhez viszonyítva (1B. Ábra, C). A szövetekben a PF mindig 15 N-mal dúsult az étrendekhez képest (1A. Ábra), míg az nPF-nek magasabb, hasonló vagy alacsonyabb volt a 15 N-os mennyisége az étrendhez képest, mind a szövetek, mind az étrend függvényében (1B. Ábra). A szövetekben a PF általában 15 N-val dúsult az nPF-hez képest (2. táblázat), kivéve, hogy egyes szövetekben nem volt különbség a frakciók között (nevezetesen a máj mind az MP, mind az SP csoportoknál, és az SI nyálkahártya csak az SP csoportnál) . A 15 N bőség különbségei a PF és az nPF között szövetenként és étrendenként változtak (2. táblázat): magasabbak voltak az SP étrendnél, mint a vastagbél, a vesék és a gyomor MP étrendjénél, míg a plazma és az SI nyálkahártyánál alacsonyabbak voltak.

Vita

Ebben a tanulmányban az étrendi fehérje minőségének (tej vs. szójafehérje) specifikus hatását vizsgáltuk a nitrogén izotóp szignatúrákra nagy mennyiségű szövetben és patkánykészletben kontrollált körülmények között, azaz kvantitatív fehérjebevitel, növekedés hasonló körülményei között. és a testek összetétele a csoportok között. A megkülönböztetési értékeket (Δ 15 N) a gyorsan átforduló medencékben (zsigeri szövetek és plazma) számoltuk, amelyek a 3 hetes kísérleti periódus végén az étrenddel megegyező izotóp egyensúlyban vannak, vagy ahhoz közel vannak. Kimutattuk, hogy a Δ 15 N nagymértékben változik a medencék között, és egyértelműen befolyásolja az étkezési fehérje jellege a legtöbb medencében. A diéták között megfigyelt Δ 15 N különbségek valószínűleg a fehérje és az aminosav anyagcseréjének finom modulációiból származnak, amelyet a tej és a szójafehérjék aminosav-összetételének és minőségének különbségei okoznak.

A szövetekben és a plazmában lévő nitrogénfrakciók közötti diszkriminációs értékek változása

Az ökológiai vizsgálatokkal ellentétben, amelyek általában a teljes plazmában vagy szövetekben Δ 15 N értékeket jelentettek, itt konkrétan a szövetek (PF és nPF) és a plazma (PF, nPF és karbamid) különböző nitrogénfrakcióiban mértük a természetes 15 N mennyiséget. ).

Először is, a szöveti nitrogén fő részét képviselő szövetfehérje-frakciókra vonatkozó Δ 15 N értékek eredményeink megerősítik, hogy a szövetek és pontosabban a szöveti fehérjék általában 15 N-dúsítottak az étrendhez viszonyítva, Δ tartományban 15 N érték (1,4 ‰ és 4,6 in között), összhangban a rágcsálók teljes szövetére vonatkozó irodalmi értékekkel [1], [4], [8], [30] - [36]. Megmutattuk azt is, hogy egy adott szövet esetében a Δ 15 N értékek a nitrogén frakciói között változtak. A PF általában szignifikánsan 15 N-dúsított volt az nPF-hez képest, ami az izotóp-hatással magyarázható a szövetekben egy vagy több metabolikus út mentén, például aminosavak metabolikus interkonverziói, fehérjeszintézis vagy fehérjebontás.

A testfehérjék közötti különbségek a diszkriminációs értékekben

Jelentős különbségeket figyeltünk meg a Δ 15 N értékekben a testfehérjék között. Például, függetlenül az étrendi fehérjeforrástól, a plazmafehérjéknek (amelyek többnyire a máj szintéziséből származnak) volt a legnagyobb a 15 N mennyisége, mint az összes többi mintában szereplő fehérjében, beleértve a máj konstitutív fehérjéit is, és a májfehérjékben magasabb volt a 15 N bőség mint a mintában szereplő többi fehérje. A szakirodalomban már beszámoltak a magasabb Δ 15 N-értékek következetes megfigyeléséről a plazmában, mint a májban [5], [40] és a májban, mint a vesében [4], [35].

A testfehérjék diszkriminációs értékeinek változásai az étrendi fehérjeforrás szerint

Az étrendi fehérjeforrás erősen befolyásolta a testfehérjék és az étrend közötti nitrogén izotóp diszkriminációt, a szójaval táplált patkányokban magasabb volt a Δ 15 N, mint a tejfehérjében, az összes jelentett fehérjét kivéve az SI nyálkahártyán. Növényi és állati fehérje-alapú étrenddel etetett patkányok májában már magasabb Δ 15 N-értékeket jelentettek [1], [8]. Pontosabban, magasabb Δ 15 N értékeket figyeltek meg a szója és tejfehérje alapú étrenddel etetett patkányok májában [8], valamint a plazma és a jejunum fehérjékben [38]. Itt megmutatjuk, hogy ez a hatás általános jellemző, amennyiben következetes az összes mintavételezett zsigeri fehérje készletben, a vékonybél kivételével. Az étrendek közötti Δ 15 N különbségek amplitúdója szövetenként változó volt, ami arra utal, hogy az étrendi fehérjeforrás a szövetek fehérje anyagcseréjét különböző módon befolyásolhatja.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

A kísérleteket az NIH laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatójában szereplő ajánlásoknak megfelelően végeztük. A protokollt a Jouy-en-Josas INRA központ és az AgroParisTech állatkísérletekkel foglalkozó etikai bizottsága (COMETHEA) hagyta jóvá (jóváhagyási szám: 11/015).

Állatok és diéták

Az eredetileg 191 g tömegű hím Wistar patkányokat (n = 18) Harlan-tól (Franciaország) vásárolták, és egy szabályozott hőmérsékletű helyiségben (22 ± 2 ° C) helyezték el 12 órás világos-sötét ciklusban (sötét időszak 9-től 9-ig).: 00 és 21:00 között). A kísérlet megkezdése előtt a patkányokat a laboratóriumi körülményekhez igazították egy hétig, szabad hozzáféréssel a kereskedelmi laboratóriumi étrendhez (δ 15 N≈4 ‰). Ezután az állatokat véletlenszerűen két csoportra osztottuk, és a két kísérleti étrend egyikének befogadására osztották őket. A kezdeti testtömeg hasonló volt a két csoportnál.

A két étrend izoenergetikus volt, tápanyag-összetételükben azonosak (az energia 20% -a fehérje, 30% lipid és 50% szénhidrát), és megfeleltek a növekedés követelményeinek. Fehérjeforrásukban különböztek, akár tejfehérje (MP, n = 9), akár szójafehérje (SP, n = 9) (3. táblázat). A diétákat az UPAE készítette (Unité de Préparation des Régimes Expérimentaux, Francia Nemzeti Agronómiai Kutatóintézet, INRA, Jouy en Josas, Franciaország).

Kísérleti protokoll és mintavételi eljárások

Az 1 hetes alkalmazkodási periódust követően a patkányokat a két kísérleti étrend egyikével etettük 3 hétig. A patkányok 9:00 és 19:00 óra között (a sötét időszakban) ingyenes hozzáférést kaptak az élelemhez, és egész nap szabadon hozzáférhettek a vízhez. A testtömeget hetente kétszer mértük. A 3. hét végén (21. vagy 22. nap) az összes patkányt egy éjszakai böjt után leöltük.

A patkányokat intraperitoneális nátrium-pentobarbitális injekcióval altattuk (100 mg/ttkg, olyan dózis, amely túl kicsi ahhoz, hogy az érzéstelenítés beadásának módja és a szövetekben a barbiturátok eloszlási kinetikája alapján jelentősen befolyásolja a mért izotópos aláírásokat). patkány plazma [49]). A has kinyílt, és körülbelül 5 ml vért gyorsan kivettek a vena cava-ból. Ezután az állatokat a vena cava és az aorta megrepedésével leölték. A májat, a vékonybelet (SI), a gyomrot, a vastagbélt, a vesét, a gastrocnemius és a soleus izmokat gyorsan kivágták, leöblítették, lemérték és folyékony nitrogénben lefagyasztották. Az SI-t lekapartuk, hogy összegyűjtsük a nyálkahártyát, amelyet külön lefagyasztottunk. A hajból és a bőrből mintát vettek. Az összes mintát az elemzésig -20 ° C-on tároltuk.

Minták előkészítése

Mindegyik szövetben a fehérjefrakciót (PF) és a nem fehérjefrakciót (nPF) izoláltuk a nitrogéntartalom és az egyes frakciók izotópos arányának külön-külön történő meghatározása céljából. A fagyott szöveteket folyékony nitrogénben lehűtött mozsárban és mozsárban porítottuk fel, és 100 mg szövetre 700 µl 5-szulfozalicilsavat (10%) adtunk hozzá. Centrifugálás után (2500 g, 4 ° C, 15 perc) a felülúszót extraháltuk, és az üledéket kétszer öblítettük 700 ul 10% -os 5-szulfosalicilsavval. Az oldható frakciót (azaz a szabad aminosavakat tartalmazó nPF) és az oldhatatlan frakciót (vagyis a fehérjéhez kötött aminosavakat tartalmazó PF) fagyasztva szárítottuk.

A plazmában a különféle nitrogén frakciókat (PF, nPF és karbamid) is elválasztották. A PF-et szulfosalicilsavval (200 ul, 1 g/ml) kicsapással izoláljuk. 1 órás 4 ° C-on történő tárolás és centrifugálás (2 000 g, 4 ° C, 20 perc) után az üledéket 1 ml szulfosalicilsavval (1 g/ml) öblítettük, újra centrifugáltuk és fagyasztva szárítottuk. Az nPF-t és karbamidot tartalmazó kivont oldható frakciót semlegesítettük, és 0,5 ml kationcserélő gyantára (Dowex AG50X8, Biorad, Marnes-la-coquette, Franciaország) vittük át, hogy megkötjük a karbamid hidrolíziséből felszabaduló ammóniumot (8 µL ureaz 2 órán át). 30 ° C). Az ammóniummal töltött gyantát mossuk és 4 ° C-on tartjuk az elemzésig, míg a karbamidhiányos felülúszót, amely aminosavakat és peptideket tartalmaz, összegyűjtjük és szűrjük a 3 kDa-nál nagyobb peptidek eltávolítására (Amicon Ultra-4, Ultracel 3k, Millipore (Carrigtwohill, Írország) és izoláljuk az nPF-et. Az izotópos meghatározás előtt a karbamidból származó ammóniát KHSO4 (2,5 mol/l) hozzáadásával eluáltuk a gyantákból.

Elemelemzés és izotópos meghatározások

A nitrogén természetes stabil izotóparányait a plazma karbamidban, valamint a szövetek és a plazma PF-ben és nPF-jében határoztuk meg izotóparányú tömegspektrométerrel (Isoprime, VG Instruments, Manchester, UK), elemanalizátorral (EA 3000, Eurovector, Olaszország) összekapcsolva. ). A tömegspektrométerrel mért nyers értékek esetleges eltéréseinek korrigálására minden menetben szabványokat vontak be. Az eredményeket a delta jelöléssel fejeztük ki a következő egyenlet szerint: ahol R minta és Rstandard a nehezebb izotóp és a könnyebb izotóp (15 N/14 N) nitrogén izotóp aránya az elemzett mintához és a nemzetközileg meghatározott standardhoz (légköri N2), Rstandard = 0,0036765), δ pedig a delta jelölés részenként 1000-ben vagy malomban (‰) a standardhoz viszonyítva.

A szövetek PF és nPF, valamint a plazma PF összes nitrogéntartalmát az elemanalizátor (EA 3000, Eurovector, Olaszország) alkalmazásával, atropin standard alkalmazásával határoztuk meg. A karbamid koncentrációt a plazmában kereskedelmi kit segítségével határoztuk meg enzimatikus módszerrel (Urea kit S-1000, Biomerieux, Craponne, Franciaország).

Számítások és statisztikák

A szövetmintákat fagyasztva szárítás előtt és után lemértük a szöveti szárazanyag becsléséhez. Az egyes mintavételi szövetfrakciók (PF vagy nPF) nitrogéntartalmát a következő egyenlet alapján számítottuk: ahol% N és% DM (%) a mintában mért nitrogén- és szárazanyag-százalék, valamint m (g ) a szövet teljes tömege. Az összes izom- és bőrtömeget nem mértük, de a teljes testtömeg 45% -ának [50], illetve 15% -ának [51] becsülték.

A plazma PF és nPF nitrogéntartalmát a frakció nitrogénkoncentrációjának és a testtömeg 3,5% -ának becsült plazmatérfogat szorzataként számolták [52]. A plazma nPF nitrogén koncentrációját a csoportunk által hasonló körülmények között kapott aminoacidemia értékek felhasználásával becsültük (3,1 mmol/l, azaz 4,4 mmol/l nitrogén ekvivalensek) [53]. A plazma karbamid-medence nitrogéntartalmát (Nurea, mmol) a plazma karbamid-koncentráció (Curea, mmol/L karbamid-nitrogén), eloszlási térfogata (azaz az összes testvíz becsült értéke a testtömeg, BM, Kg) [54], és a vér víztartalmát képviselő 92% -os korrekciós tényező: [55].

A medence és az étrend közötti izotóp-nitrogén megkülönböztetést δ 15 N különbségként írták le Δ jelöléssel, ahol Δ 15 N = δ 15 Npool − δ 15 Ndiet (Δ 15 N> 0 nagyobb 15 N-os bőséget jelez a étrendhez viszonyítva). Mivel az MP- és SP-étrendek eltérő természetes izotóparányokkal rendelkeztek (δ 15 Ndiet 7,7 MP MP-nél és 1,7 SP SP-nél volt), Δ 15 N-t használnak a különböző étrenddel etetett állatok szöveteinek izotópos összetételének összehasonlítására.

A Δ 15 N értékeket kiszámítottuk azokban a gyors átfordulási medencékben, amelyek valószínűleg elérték vagy majdnem elérték izotóp egyensúlyukat az étrenddel a 3 hetes kísérleti periódus végén (plazma karbamid, valamint a zsigeri szövetek PF és nPF mindegyike). és plazma). Minden zsigeri szövet és plazma esetében a teljes Δ 15 N-értéket kiszámítottuk a különböző nitrogénfrakciók izotópos összetételeinek súlyozott átlagaként, ahol ahol mi az i frakció nitrogénmennyisége és Δi az izotópos diszkrimináció a i frakció és a diéta. Hasonlóképpen, az összesített zsigeri Δ 15 N-t kiszámítottuk a máj, az SI nyálkahártya, a gyomor, a vesék és a vastagbél PF és nPF izotópos összetételeinek súlyozott átlagaként.

Az eredményeket átlag ± SD-ként fejezzük ki. Az étrend (MP versus SP) és a szövetek hatásait és kölcsönhatásukat kétirányú varianciaanalízissel (Proc GLM, SAS 9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA) elemeztük. A szövetek és az étrendi csoportok többszöri összehasonlításához post-hoc teszteket használtak Tukey vagy Bonferroni kiigazítással (MP versus SP). A P értékeket <0,05 szignifikánsnak tekintették.

segítő információ

S1. Táblázat.

A patkányok szöveteinek és plazmájának nitrogénösszetétele 3 hétig tejfehérje- vagy szójafehérje-alapú étrendet adott.