Az N-terminális galanin fragmens (2-15) kardioprotektív tulajdonságai kísérleti ischaemia/reperfúziós sérülés esetén

Mutatók: PDF 577 megtekintés | HTML 1056 megtekintés | ?

Oleg Pisarenko, Andrei Timotin, Maria Sidorova, Irina Studneva, Valentin Shulzhenko, Marina Palkeeva, Larisa Serebryakova, Aleksander Molokoedov, Oksana Veselova, Mathieu Cinato, Frederic Boal, Helene Tronchere és Oksana Kunduzova _

Absztrakt

Oleg Pisarenko 1, *, Andrei Timotin 2, 3, *, Maria Sidorova 1, Irina Studneva 1, Valentin Shulzhenko 1, Marina Palkeeva 1, Larisa Serebryakova 1, Aleksander Molokoedov 1, Oksana Veselova 1, Mathieu Cinato 2, 3, Frederic Boal 2, 3, Helene Tronchere 2, 3 és Oksana Kunduzova 2, 3, *

1 Orosz kardiológiai kutatási és gyártási komplexum, Moszkva, Orosz Föderáció

2 Országos Egészségügyi és Orvosi Kutatóintézet (INSERM) U1048, Toulouse, Franciaország

3 Toulouse-i Egyetem, UPS, Metabolikus és Kardiovaszkuláris Betegségek Intézete, Toulouse, Franciaország

* Ezek a szerzők egyformán járultak hozzá ehhez a munkához

Kulcsszavak: galanin (2-15); apoptózis; szívsérülés; energia-anyagcsere; oxidatív stressz

Beérkezett: 2017. augusztus 02. Elfogadva: 2017. szeptember 4. Megjelenés: 2017. október 05

Háttér és cél: A galanin egy endogén peptid, amely a központi idegrendszer különféle fiziológiai funkcióiban vesz részt, beleértve a központi kardiovaszkuláris szabályozást is. A jelen tanulmány célja a rövid N-terminális 2-15 (G) galanin fragmens lehetséges hatása volt a szív ischaemia/reperfúzió (I/R) sérülésére.

Kísérleti megközelítés: A G peptidet automatikus szilárd fázisú módszerrel szintetizáltuk, és 1H-NMR spektroszkópiával és tömegspektrometriával azonosítottuk. A kísérleteket tenyésztett patkány kardiomioblaszt (H9C2) sejteken, izolált perfúziós munkapatkány szíveken és altatott nyílt mellkas patkányokon.

Főbb eredmények: A sejtek életképessége jelentősen megnőtt 10 és 50 nM G-peptiddel történő kezelés után. Hypoxia és reoxigenációs körülmények között a H9C2 sejtek G peptidnek való kitettsége csökkentette a sejtek apoptózisát és a mitokondriális reaktív oxigénfajok (ROS) termelését. A G-peptid posztiszchémiás infúziója csökkentette a sejtmembrán károsodását és javította a funkcionális helyreállítást az izolált szívekben a reperfúzió során. Ezeket a hatásokat a szívizom metabolikus állapotának fokozott helyreállítása kísérte. A G-peptiddel végzett kezelés a reperfúzió kezdetén kisebb változásokat váltott ki a hemodinamikai változókban, de jelentősen csökkentette az infarktus méretét és a nekrózis markerek plazmaszintjét.

Következtetések és következmények: Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a G-peptid hatékonyan csökkenti a szív I/R sérüléseit, és ezáltal indokolttá teszi a kardiovaszkuláris betegségek kezelésére vonatkozó ígéretes eszközt.

BEVEZETÉS

A galanin, egy 29/30 aminosavú neuropeptid, széles körben elterjedt a központi és perifériás idegrendszerben, valamint az endokrin rendszerben, előnyösen az agyban, a hipotalamuszban, az agyalapi mirigyben és más szövetekben, beleértve a szívet is. A galaninerg rendszer több szabályozási funkcióban vesz részt, beleértve a központi kardiovaszkuláris kontrollt is [1]. A galanin N-terminális fragmensei kulcsfontosságúak biológiai aktivitása szempontjából, és az első 15 aminosav konzerválódik a legtöbb fajban [2], míg a C-terminális régió (17-29. Aminosav) fajonként változó, és hiányzik a receptor affinitása [2] . Eddig három galaninreceptort (GalR1, GalR2 és GalR3), amelyek a GPCR szupercsalád tagjai, molekuláris klónozással azonosították és farmakológiailag jellemezték [3].

Ezért arra törekedtünk, hogy megvizsgáljuk a G peptid hatásait in vitro hipoxiának/reoxigenizációnak (H/R) kitett H9C2 kardiomioblaszt sejtvonalban, ex vivo izolált perfundált patkányszívekben és in vivo patkány modellben I/R sérülés.

EREDMÉNYEK

A G hatása a H9C2 sejtek túlélésére a stressz hatására

Annak megállapításához, hogy a G befolyásolja-e a sejtek életképességét, megvizsgáltuk a peptid dózisfüggő hatásait a H2O2 által kiváltott ATP veszteségre a H9C2 sejtekben. Amint az 1. ábrán látható, a sejtek 4 órán át 400 μM H2O2-nek való kitettsége a sejtek életképességének jelentős csökkenéséhez vezetett a kontrollhoz képest. Dózis-válasz vizsgálatok azt mutatták, hogy a G 10 és 50 nM dózisban képes volt megakadályozni az ATP-szintek H2O2-indukálta csökkenését. Ezután TUNEL-vizsgálattal megvizsgáltuk, hogy a G befolyásolja-e az apoptotikus sejtpusztulást a hipoxiás stressz hatására. Mivel 50 nM G körülbelül 20% -kal növelte a kardiomioblaszt életképességét, ezt a koncentrációt használtuk a következő kísérletek során. Amint a 2. ábra mutatja, a H9C2 sejtek hipoxiának való kitettsége a TUNEL-pozitív sejtek számának növekedését okozta a normoxiához képest. A sejtek 50 nM G-val történő kezelése azonban jelentősen csökkentette a hipoxia okozta apoptózist (2. ábra).

1. ábra: A G dózisfüggő hatása a sejtek életképességére az oxidatív stressz hatására. A kardiomioblasztok G-vel történő kezelése dózisfüggő módon megakadályozza a sejtek életképességének H2O2-indukálta csökkenését. A H9C2-t 20 percig előkezeltük G-vel (10, 50, 250 nM), majd 4 órán át 400 µM H2O2-nak tettük ki. Az értékek három kísérlet átlagai ± SEM. * P ** P §§§ P 2. ábra: G hatása a hipoxia okozta sejt apoptózisra. (A) 50 nM G-vel 20 percig előkezelt, majd normoxiának vagy hipoxia-reoxigenizációnak kitett H9C2 sejtek reprezentatív fluoreszcencia képei. Az apoptózist TUNEL vizsgálattal mértük H9C2 sejtekben 16 óra hipoxia, majd 3 óra reoxigenálás után. (B) A TUNEL-pozitív sejtek kvantitatív elemzése H9C2 sejtekben. A nyilak apoptotikus sejteket jeleznek. Az értékek három kísérlet átlagai ± SEM. *** P §§§ P - ) előállítása a MitoSOX Red fluoreszcens szondával. Amint a 3A., 3B. Ábra mutatja, a sejtek hipoxiás stressznek való kitettsége az O2-termelés jelentős növekedését okozta a normoxiához képest. Fontos, hogy a H9C2 sejtek kezelése 50 nM G-val jelentősen megakadályozta a hipoxia okozta O2-képződést (3. ábra).

3. ábra: G hatása a hipoxia okozta mitokondriális O2 termelésére. (A) G peptiddel előkezelt H9C2 sejtek reprezentatív fluoreszcencia képei. A mitokondriális O2-képződést MitoSOX RED segítségével értékeltük H9C2 sejtekben, amelyeket 16 órás hipoxiának, majd 3 óra reoxigenizációnak tettek ki. (B) Az O2 termelésének kvantitatív elemzése normoxiának vagy hipoxia-reoxigenizációnak kitett H9C2 sejtekben. Az értékek három kísérlet átlagai ± SEM. * P ## P 4. ábra: A peptid G koncentrációinak hatása a KHB-ban a szívteljesítmény helyreállítására (A) és a kontraktilis funkció intenzitásának indexe (B) a reperfúzió végén. Az értékek 8 kísérlet átlagai ± SEM, és a kezdeti érték százalékában vannak kifejezve. CO, szívteljesítmény; LVDP × HR, a kontraktilis funkció intenzitásának indexe. A szaggatott vonalak a kontrollban lévő indexek helyreállását mutatják.

1. táblázat: A globális iszkémia után bekövetkezett 225 μM G infúzió hatása az izolált patkány hő visszanyerésére a reperfúzió végén