Elektroakupunktúra a Hua Tuo Jia Ji akupunktumokban csökkent neuropátiás fájdalmat és megnövekedett GABAA receptorokat a patkány gerincvelőjében

1 a hagyományos kínai állatorvoslás mesterképzése, Kínai Orvostudományi Egyetem, Taichung 40402, Tajvan

2 Akupunktúrás Tudományok Intézete, Kínai Orvostudományi Főiskola, Kínai Orvostudományi Egyetem, Taichung 40402, Tajvan

3 Kínai Orvostudományi Kutatóközpont, Kínai Orvostudományi Egyetem, Taichung 40402, Tajvan

4 Integrált Orvostudományi Intézet, Kínai Orvostudományi Főiskola, Kínai Orvostudományi Egyetem, Taichung 40402, Tajvan

5 Kínai Orvostudományi Tanszék, Kínai Orvostudományi Egyetemi Kórház, Taichung 40447, Tajvan

Absztrakt

1. Bemutatkozás

Az adenozin felszabadul a preszinaptikus terminálokból, hogy megkötje a posztszinaptikus A1, A2A, A2B és A3 receptorokat a kardiovaszkuláris, immun és idegi funkciókhoz [6, 7]. Az adenozin A1 receptor (A1R) főleg a perifériás szenzoros terminálisban [8], SC [9] és a glia sejtekben helyezkedik el [10, 11]. Az A1R aktiválása fájdalomcsillapító hatást váltott ki gyulladásos és neuropátiás fájdalom modellekben [12, 13]. A jelentések szerint az A1R aktiválja a Gi fehérjét és gátolja a ciklikus adenozin-monofoszfát-protein kináz A útvonalat [14]. Az adenozin injekciója megbízhatóan csillapíthatja az allodynia és a hyperalgesia tüneteit számos fájdalom esetén [7, 15]. Az adenozin A2 receptor (A2R) aktiválódása azonban számos mellékhatást eredményez. Indíthat vazodilatációt, csökkent pulzusszámot és súlyos kardiovaszkuláris akadályokat.

Az emlős központi idegrendszerében a GABA receptorok a fő gátló neurotranszmitterek. A GABA receptorok tovább oszthatók GABAA, GABAB és GABAC-ra. A GABAA egy olyan ioncsatorna, amely közvetíti a gyors gátló szinaptikus transzmissziót, és beindítja a klorid beáramlását, ami az idegsejtek membránjának stabilitásához vezet. Számos tényező aktiválhatja a GABAA-t az idegsejtek ingerlékenységének csökkentése érdekében, és ezeket gyakran használják érzéstelenítésre és fájdalomkezelésre. A GABA agonisták injekcióját tartják a leghatékonyabb módszernek a fájdalomjelzés csökkentésére [16, 17]. Neuropátiás fájdalom esetén a GABAerg interneuronok a kaszpáz-3 útvonalon keresztül indítják el az apoptózist [18]. Ezenkívül az idegkárosodás után a GABA és a glutamát-dekarboxiláz 65-ről alacsonyabbnak számoltak be [19, 20].

A tranziens receptor potenciál (TRP) egy nem szelektív ioncsatorna, amely szöveti sérülést követően aktiválható [21]. Tranziens receptor potenciális kationcsatorna 1. alcsalád V tagja (TRPV1) létezik a nociceptorokban és az SC háti kürtben a fájdalom jelzésére [22, 23]. A TRPV1 aktiválható kapszaicinnel, káros hővel (több mint 43 ° C) és mechanikai érzékeléssel [24–26]. A TRPV1 nagymértékben expresszálódik a kis C-rostú dorsalis gyökér ganglion (DRG) neuronokban, valamint a trigeminus és nodózus ganglionokban [27]. A TRPV1 aktiválása nátrium- és kalcium beáramlást indukál a neuronok depolarizációjához [28, 29]. A TRPV1 gén kimerülése érzéketlenséget okoz a káros hőre, a radiális hőre és a főzőlap-tesztekre [30]. A gyulladásos anyagok által kiváltott termikus hiperalgéziát a TRPV1 knockout egerekben csillapították, ami arra utal, hogy a TRPV1 döntő szerepet játszik a termikus fájdalomérzetben [31].

A TRPV4 egy polimodális receptor, amely ozmotikus, mechanikus és termikus receptorként működik [32]. A TRPV4 aktiválása kalcitonin génnel rokon peptidet és P anyagot szabadít fel az SC hátsó szarvába [33]. A TRPV4 széles körben expresszálódik a szőrsejtekben, a vese, a tüdő és a perifériás szenzoros ganglionokban [34]. A heterológ rendszerekben expresszált TRPV4-et általában ozmotikus ingerek aktiválják, ami sejtduzzadást eredményez [35]. A TRPV4 részt vehet a zsigeri fájdalom csökkentésében is [32]. A TRPV1 és a TRPV4 koexpressziója szinergikusan szerepet játszhat a nocicepcióban [36].

A műtét okozta neuropátiás fájdalom károsíthatja a c- és az A-tδ rostok a glutamát felszabadulásának növelése érdekében. A glutamát az emlősök központi idegrendszerének egyik fő gerjesztő neurotranszmittere, amely a preszinaptikus terminálokból szabadul fel, és négy receptor altípushoz kötődik: α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-izoxazol-propionsav, NMDA, KA és metabotrop glutamát receptor (mGluR) [37]. Az mGluR jelezte, hogy részt vesz a neuropátiás fájdalomban [38].

Az akupunktúrát évezredek óta használják betegségek kezelésére. Egyre több bizonyíték utal arra, hogy az elektroakupunktúra (EA) alkalmazható ischaemia patkányok [39], epilepszia [40], testtömeg-kontroll [41] és fájdalom [42, 43] tanulásának és memóriazavarának kezelésére. Ennek megfelelően a jelen tanulmány célja annak meghatározása volt, hogy a Hua Tuo Jia Ji akupontokban alkalmazott EA csökkentheti-e a krónikus szűkület okozta sérülés (CCI) által kiváltott neuropátiás fájdalmat patkány modellekben. Azt is megvizsgáltuk, hogy az A1R, GABAA, TRPV1, TRPV4 és mGluR3 részt vesznek-e az EA fájdalomcsillapító hatásában a DRG, SC és a szomatoszenzoros kéreg (SSC) szintjének értékelésével.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatok

2.2. EA kezelés

Az EA-t a 7., 8. és 9. napon alkalmazták rozsdamentes acél tűkkel (0,5 ′ ′, 32 G, Yu-Kuang, Tajvan) a Hua Tuo Jia Ji akupunktumokba 2-3 mm mélységben, 5 mm-re a gerinctől. az L4-en és az L6-on. Az EA-t 20 percig adtuk be közvetlenül a neuropátiás injekció után. Egy stimulátor (Trio 300, Ito, Japán) 100-at adott le-μs 2 mA négyzet alakú impulzusok 15 percig 2 vagy 15 Hz-en. A színlelt kontrollcsoport esetében csak a tűt helyeztük be, és az állatokat áramfelvétel nélkül csatlakoztattuk a stimulátorhoz.

2.3. Állati viselkedés

A von Frey tesztet a mechanikus hiperalgézia vizsgálatára alkalmazták (IITC; Life Science Inc., USA). A patkányokat egy fém hálóra helyezték, és egy hátsó mancsnál vékony szál alkalmazásával stimulálták. Az erőket automatikusan rögzítették, amikor a patkányok kivették a jobb hátsó mancsukat. A hideg lemez tesztet alkalmazták a termikus hiperalgézia értékelésére, amelynek során a patkányokat 4 ° C hőmérsékletű hideg lemezes készülékre (Panlab, Spanyolország) helyezték. A lábemelések teljes számát (jobb hátsó mancs) 5 percig számoltuk. A laboratóriumi dolgozók vakon figyelték a kezelés elosztását a kísérletek és az elemzések során.

2.4. Western Blot elemzés

A patkány DRG-t, SC-t és SSC-t a 9. napon azonnal kivágták a fehérje-extrakció viselkedési tesztje után. Követtük Liao et al. 2016 [40]. Az összes fehérjét úgy állítottuk elő, hogy a hippocampit 1 órán át 4 ° C-on homogenizáltuk, 20 mmol/l imidazol-HCl (pH 6,8), 100 mmol/l KCl, 2 mmol/l MgCl2, 20 mmol/l etilén-glikol lízispufferben. tetraecetsav (pH 7,0), 300 mmol/l szacharóz, 1 mmol/l NaF, 1 mmol/l nátrium-vanadát, 1 mmol/l nátrium-molibdát, 0,2% Triton X-100 és egy proteináz inhibitor koktél. Minden mintából 30 μg fehérjét extraháltunk, és egy bicinchonininsav-protein-vizsgálattal elemeztük. Az extrahált fehérjét 10-15% nátrium-dodecil-szulfát-Tris-glicin gélelektroforézisnek vetettük alá és nitrocellulóz membránra vittük. A membránt 5% zsírmentes tejjel blokkoltuk TBST pufferben (10 mmol/l Tris-pufferolt sóoldat, pH 7,5; 100 mmol/l NaCl; és 0,1% Tween 20), és egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-on az anti-GABAA-val. antitest (1: 1000, Alomone, Izrael), anti-A1R antitest (1: 1000, Alomone), anti-TRPV1 (1: 1000, Alomone), anti-TRPV4 antitest (1: 1000, Alomone) és anti-GluR3 antitest (1: 1000, Alomone) szarvasmarha szérum albumint tartalmazó TBST-ben. Szekunder antitestként peroxidázzal konjugált antitestet (1: 500) használtunk. A membránt az ECL-Plus fehérje detektáló készlet segítségével értékeltük.

2.5. Statisztikai analízis

Az összes adat átlag ± standard hiba. A színlelt, a 2 Hz-es EA és a 15 Hz-es EA csoportok közötti statisztikailag szignifikáns különbségeket egyirányú varianciaanalízissel elemeztük, majd Tukey post hoc teszt. A o A 0,05 alatti érték statisztikailag szignifikánsnak tekinthető.

3. Eredmények

Először a von Frey tesztet alkalmaztuk a CCI által kiváltott mechanikus hiperalgézia kiváltására. Adataink azt mutatták, hogy a CCI az álcsoportban történő indukciót követően a 7. és a 9. nap között mechanikus hiperalgéziát indított el (1. ábra (a); 11,77 ± 1,16 g, 15,76 ± 1,15 g, 14,4 ± 1,92 g). Ezt követően felfedeztük, hogy a 2 Hz-es EA-csoport szignifikánsan alacsonyabb mechanikai hiperalgéziával rendelkezik, mint az ál-csoport (1. ábra (a); 17,53 ± 0,79 g, 19,21 ± 1,69 g, 21,98 ± 1,47 g). Hasonló eredményeket figyeltünk meg a 15 Hz-es EA csoportban is (1. ábra (a); 15,39 ± 2,04 g, 21,63 ± 3,86 g, 21,84 ± 2,89 g). Ezután elvégeztük a hidegtányér-tesztet annak megállapítására, hogy a termikus hiperalgézia részt vesz-e a CCI által kezdeményezett neuropátiás fájdalomban. Eredményeink azt mutatták, hogy a CCI megbízhatóan indukálta a termikus hiperalgéziát az álcsoportban a 7. naptól a 9. napig (1. ábra (b); a hátsó mancsemelés száma: 15,83 ± 1,05, 15,33 ± 2,01, 15,83 ± 3,44). Mind a 2 Hz-es csoportban (1. ábra (b); 10,4 ± 1,9, 10,8 ± 2,28, 6,8 ± 2,13), mind a 15 Hz-es csoportban (1. ábra (b); 7,8 ± 1,85, 10,6 ± 2,18, 7,8 ± 2,48), EA sikeresen csillapította a termikus hiperalgéziát. Ennek megfelelően azt javasoljuk, hogy a 2- és 15 Hz-es EA megbízhatóan csillapítsa mind a mechanikus, mind a termikus hiperalgéziát.

o 0,05, n = 6). Ezután ellenőriztük az A1R fájdalomcsillapító hatását a perifériás DRG neuronokra. Megállapítottuk, hogy nincs különbség a színlelt, a 2 Hz-es EA és a 15 Hz-es EA csoportok között (2. ábra (b); 100,01% ± 7,6%, 86,01% ± 16,43% és 93,51% ± 10,61%; o > 0,05, n = 6). A jelenséget a TRPV1 esetében is megfigyelték (2. ábra (c); 100,01% ± 11,15%, 94,61% ± 16,50% és 96,81% ± 11,53%; o > 0,05, n = 6), TRPV4 (2. ábra (d); 100,01% ± 8,66%, 89,68% ± 8,41% és 99,81% ± 10,95%; o > 0,05, n = 6), és mGluR3 (2. ábra (e); 100,04% ± 28,14%, 101,16% ± 19,23% és 137,52% ± 45,89%; o > 0,05, n = 6) expresszió patkány DRG-ben.

o 0,05, n = 6). Ezt a jelenséget a TRPV1 esetében sem figyelték meg (3. ábra (c); 100,09% ± 20,92% és 107,64 ± 34,72; o > 0,05, n = 6), TRPV4 (3. ábra (d); 115,83% ± 20,39% és 104,05% ± 14,97%; o > 0,05, n = 6), vagy mGluR3 (3. ábra (e); 101,08% ± 14,34% és 102,87% ± 22,65%; o > 0,05, n = 6) expresszió SC-ben.

o 0,05, n = 6). Ezután megmutattuk, hogy az A1R nem vett részt az EA fájdalomcsillapításában, mert a fehérje szintje sem a 2-, sem a 15 Hz-es EA csoportban nem változott (4. ábra (b); 109,28% ± 22,05% és 95,05% ± 17,43%; o > 0,05, n = 6). A fehérje szintje változatlan maradt a TRPV1-ben (4. ábra (c); 109,84% ± 4,55% és 94,56% ± 6,13%; o > 0,05, n = 6), TRPV4 (4. ábra (d); 99,5% ± 2,23% és 98,48% ± 3,76%; o > 0,05, n = 6) és mGluR3 (4. ábra (e); 109,73% ± 14,87% és 114,98% ± 13,38%; o > 0,05, n = 6) kifejezések a patkány kéregben.