Az extracelluláris hemfehérjék befolyásolják a szarvasmarha myosatellite sejtjeinek szaporodását és a sejtalapú hús színét

Két izolált szarvasmarha-izom műholdas sejtek (BSC) kétdimenziós immunfluoreszcens festése. (A) DAPI-ra, aktin-citoszkeletonra (Phalloidin) és Pax7-re, a műholdas sejtek nukleáris markerére festett szaporodó szarvasmarha-műhold. A foltok nagyon tiszta műholdas sejtpopulációt mutatnak, az izolálást és az előzetes bevonási protokollt követően. (B) Egy hét differenciálódás után a sejteket DAPI, aktin citoszkeleton (Phalloidin) és Troponin T (CT3), a myogenezis markere után festettük. A méretarány 200 µm.

extracelluláris

Különböző Hb vagy Mb koncentrációk jelenlétében nőtt BSC-k szaporodása 2D-ben. (A) BSC-k, BSC-k + 3 mg/ml Hb vagy BSC-k + 3 mg/ml Mb sejtjei, CyQuant reagenssel (n = 6) számítva egy, három, öt és hét nap után. A BSC-k proliferációját különböző (B) Hb és (C) Mb koncentrációk mellett 1, 3 vagy 5 mg/ml koncentrációban figyeltük meg (n = 6). A sejtszámot ismert sűrűséggel beoltott sejtekből készített standard görbéből számítottuk. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001.

A vázizomszövet kialakulásának tulajdonságai. (A) A BSC-kből, a BSC-k + Hb és a BSC-k + Mb-ból (3 mg/ml mindkét hemfehérjéhez) generált bioartificialis izmok (BAM) reprezentatív képei különböző időpontokban (egy, négy, hét és kilenc napos inkubáció), amely megnövekedett színintenzitást mutat a Hb és az Mb konstrukciókban. A méretarány 10 mm. (B) BAM-ek súlya, szélessége és vastagsága van bemutatva a betakarítás időpontjában. A csoportokat összehasonlítottuk a hozzáadott ACA (–ACA) és a hozzáadott sejtek nélküli fibrin géllel, mindkettőt azonos ideig inkubáltuk, azonos körülmények között, a sejtek hidrogél-tömörítésének összehasonlítása céljából. Szélességet és vastagságot csak a + ACA BAM-okban lehetett mérni, mivel –ACA BAM-ok leváltak a rögzítési pontokról és elvesztették fizikai formájukat. (C) A BSC-k, a BSC-k + Mb (n = 5) és a BSC-k + Hb (n = 4) DNS-ét proteináz K lebontásával extraháltuk, és az abszorbanciát NanoDrop-mal mértük.

A BAM-ok konfokális immunfluoreszcens képalkotása. A BSC-ből, BSC + Hb-ből vagy BSC + Mb-ből (3 mg/ml mindkét hemfehérjéhez) előállított BAM-okat nyolc napos differenciálódás után festettük DAPI, aktin citoszkeleton (Phalloidin) és Troponin T (CT3), a myogenezis markere között. . A képek többmagos myotube képződést mutatnak BSC és BSC + Mb konstrukciókban, bár nem BSC + Hb konstrukciókban. A méretarány 200 µm.

Izomkonstrukciók élő-holt festése. A BSC-ből, BSC + Hb-ből vagy BSC + Mb-ből (3 mg/ml mindkét hemfehérjéhez) előállított BAM-okat kalcein AM-vel (élő sejtek, zöld) és etídium-homodimerrel (elhalt sejtek, vörös) festettük, hogy megfigyeljük a sejtek életképességét. A képeket zöld csatornán (488 nm) és vörös csatornán (594 nm) készítettük, azonos mikroszkóp körülmények között, z-Stack alkalmazásával. A teljes konstrukció életképességének megjelenítéséhez x-y varrást hajtottunk végre. Az egycsatornás képek méretaránya 200 µm, a teljes konstrukcióban pedig 1000 µm.

A BSC-k összehangolása. (A) A BSC-ből, BSC + Hb-ből vagy BSC + Mb-ből előállított BAM-okat (3 mg/ml mindkét hemfehérjéhez) kalcein AM-vel festettük és fluoreszcens mikroszkóppal képeket készítettünk, majd a képeket Fidzsi-szigeteken dolgoztuk fel a Directionality eszközzel ( Fourier-módszer). A sejtek összehangolását azon struktúrák százalékaként határoztuk meg, amelyek –10 ° és 10 ° között igazodtak az igazítási tengelyhez (0 °) viszonyítva. A statisztikai szignifikanciát egyirányú ANOVA-val és Tukey-féle post-hoc teszt többszörös összehasonlításával határoztuk meg (α = 0,05). A hibasávok szórások (n = 9). (B) A kontrollcsoport (BSC) átlagos myotube orientációját a reprezentatív MatLab rózsa-plot ábrázolta. *** p ≤ 0,001.

BAM-ek pásztázó elektronmikroszkópos képei. A BSC-ből, BSC + Hb-ből vagy BSC + Mb-ből előállított BAM-okat (3 mg/ml mindkét hemfehérjéhez) dehidratáltuk és porlasztóval arannyal borítottuk. A képeket 1000x-es nagyítással (skála sáv = 50 µm) készítettük a szövet közepén, és 2000-szeres nagyításban (skála sáv = 100 µm) a szövet oldaláról.

A szekretált fehérjék biokémiai elemzése BAM-ok segítségével. A BSC-ből, BSC + Hb-ből vagy BSC + Mb-ből előállított BAM-sejtek táptalaját (3 mg/ml mindkét hemfehérjéhez) 72 óra inkubálás után eltávolítottuk, és megmértük (A) nitrogén-oxidra (n = 5) és (B ) Oldható GAG-ok (n = 6) tartalma. * p ≤ 0,05.

Pigmenttartalom és szövetszínezés. (A) A teljes pigmenttartalmat spektroszkópikusan határoztuk meg a BSC-ből, BSC + Hb-ből vagy BSC + Mb-ből (3 mg/ml mindkét hemfehérje esetén) és marhahúsból (n = 6 az összes csoportból) előállított BAM-ok homogenizálásával nátrium-foszfát pufferben, ami pigment oldódáshoz vezet az oldatban. A pigment mennyiségét Hb és Mb standard alapján számoltuk. (B) Megjelennek a BSC (n = 6), a BSC + Hb (n = 5), valamint a BSC + Mb (n = 6) és a marhahús (n = 9) átlagos L * a * b * értékei. A marhahús színét friss vagy főtt BAM színként mutatják be egy vagy kilenc napos inkubálás után. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001.

Absztrakt

1. Bemutatkozás

2. Anyagok és módszerek

2.1. Szarvasmarhafélék műholdas sejtjeinek izolálása és sejttenyésztése