Határok a farmakológiában

Kísérleti farmakológia és gyógyszerkutatás

Ez a cikk a kutatási téma része

A biofarmácia terén elért haladás Az összes 25 cikk megtekintése

Szerkesztette
Salvatore Salomone

Cataniai Egyetem, Olaszország

Felülvizsgálta
Ana Aguiar-Ricardo

Természettudományi és Technológiai Kar, Lisszaboni Új Egyetem, Portugália

Yanqi Ye

Észak-Karolinai Egyetem, Chapel Hill, Egyesült Államok

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

határok

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Távvezérelt teranosztikai rendszerek laboratóriuma, Saratov Állami Egyetem, Saratov, Oroszország
  • 2 RASA Központ Tomszkban, Tomszki Műszaki Egyetem, Tomszk, Oroszország
  • 3 RASA Központ, Kazan Szövetségi Egyetem, Kazan, Oroszország
  • 4 Biotechnológiai, Biomérnöki és Biokémiai Tanszék, Nemzeti Kutatási Ogarev Mordovia Állami Egyetem, Saransk, Oroszország
  • 5 Műszaki és Anyagtudományi Iskola, London Mary Queen University, London, Egyesült Királyság
  • 6 Skoltech Fotonikai és Kvantum Anyagközpont, Skolkovo Tudományos és Technológiai Intézet, Skolkovo Innovációs Központ, Moszkva, Oroszország
  • 7 Farmakológia és toxikológia, Rutgers Egyetem, Piscataway, NJ, Egyesült Államok

Bevezetés

A gyógyszerek juttatása a tüdő alsó légzőszervi részébe hosszú távon kívánatos cél. A tüdő disztális része kívánatos célpont a szisztémás bejuttatáshoz, mivel nagy a felülete (~ 70–140 m 2); a diffúzió keskeny gátja és a degradatív enzimek relatív hiánya (Groneberg et al., 2003). Ezenkívül a vegyületek légúti részbe juttatása számos tüdőbetegség fontos célja. A Global Burden of Disease Study projekt szerint a tizenöt leggyakoribb halálok közül négy a tüdő légzőszervi részében fordul elő. A 2030-ra vonatkozó előrejelzés szerint ezeknek a betegségeknek a relevanciája várhatóan növekszik (Mathers és Loncar, 2006). Ezeknek a betegségeknek a kezelésében a kifejezetten a disztális tüdőre irányuló szállítórendszerek kialakítása potenciálisan nagy értéket képvisel.

Minden egyes szintézis után a részecskéket 1 percig 3000 ° C-on centrifugálással kicsapjuk g mikron részecskéknél és 6000-nél g szubmikronos részecskékhez és az azt követő háromszor ionmentes vízzel és egyszeri etanollal történő mosáshoz. A kapott csapadékot ezután 1 órán át + 60 ° C-on szárítottuk. A morfológia és a mikrostruktúra tanulmányozásához a szárított részecskéket porlasztottuk arannyal és pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM), MIRA II LMU-val (Tescan) készítettük felvételeket 30 kV üzemi feszültség mellett.

Vaterit részecskék jelölése konjugált Cy7-BSA-val

A Cy7 fluoreszcens festékét vízmentes DMSO-ban (4: 1) oldjuk, hozzáadunk 50 ml 2% -os BSA-t PBS-ben (pH 8,3), és éjszakán át + 4 ° C-on keverjük. A kapott Cy7 konjugált BSA oldatot a reagensfeleslegből vízzel végzett intenzív dialízissel mossuk. A konjugált Cy7-BSA-t (2 ml) összekevertük 5 mg kapott szárított CaCO3 részecskével, és 1 órán át szobahőmérsékleten rázattuk. A mikron méretű részecskéket 3000-nél centrifugáltuk g 1 percig a szubmikronos részecskéket 6000-nél centrifugáltuk g 1 percig. Ezután a felülúszókat eltávolítottuk és összegyűjtöttük. A fluoreszcens festék koncentrációját fotometriásan határoztuk meg spektrofotométerrel (Synergy H1), a relatív fluoreszcens egységek (RFU) függőségét és az ismert koncentrációt meghatározó kalibrációs vonal szerint. Konfokális Leica TCS SP8 X (Leica Microsystems) mikroszkópot használtunk a kapott jelölt vaterit részecskék vizualizálására.

Vaterit részecskék kölcsönhatása a felületaktív anyaggal in Vitro

A kapott vaterit részecskéket 0,65 μm méretben 10 mg/ml koncentrációban inkubáltuk ioncserélt vízzel, fiziológiás sóoldattal, kis vagy nagy aggregátum felületaktív frakciókkal, állandó rázással 37 ° C-on a megadott időpontokban (1, 3, 5, 7, 9, 24, 32, 56, 96 és 144 óra), a mintákat részecskemorfológia szempontjából elemeztük pásztázó elektronmikroszkóppal MIRA II LMU (Tescan).

Állatok

Ennek a vizsgálatnak az összes állatát az Ogarev Mordovia Állami Egyetem Állattartó létesítményében helyezték el, normál körülmények között, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez. Minden állatkísérletet az Ogarev Mordovia Állami Egyetem Orvostudományi Intézetének intézményi állatgondozási és felhasználási bizottságai által jóváhagyott protokoll szerint hajtottak végre (Etikai Bizottság 50. sz. Jegyzőkönyve 2017.05.20-tól). A 6–8 hetes Balbc egereket Zoletil keverékkel (40 mg kg-1, 50 μl, Virbac SA, Carros, Franciaország) és 2% Rometar-szal (10 μl és 10 mg kg-1, Spofa) eutanizáltuk., Csehország) intraperitoneális injekcióval.

Bronchoalveolaris lavage készítése

A bronchoalveoláris öblítést (BAL) 0,5 ml-es steril sóoldat-alikvotokkal hajtottuk végre 10 ml össztérfogatig, a leírtak szerint (Guo és mtsai., 2008). A visszanyert BAL mintákat 400 ° C-on centrifugáltuk g 4 ° C-on 10 percig a sejtek eltávolítása céljából, és a sejtmentes BAL felülúszókat centrifugálással nagy (LA) és kicsi (SA) aggregált felületaktív frakciókra szétválasztottuk (20 000 g 60 percig 4 ° C-on), ahogy azt korábban leírtuk (Atochina et al., 2004). A pelletált biofizikailag aktív LA-frakciót steril sóoldatban szuszpendáljuk és -20 ° C-on lefagyasztjuk az elemzésig. Az oldható fehérjéket és biofizikailag inaktív felületaktív anyagokat tartalmazó nagysebességű centrifugálásból származó SA frakció felülúszója friss csőbe került, és a későbbi elemzés céljából -20 ° C-on lefagyasztva.

A vaterita részecskék biodisztribúciója in Vivo

A BSA-Cy7 jelzett részecskéket (0,65, 1,35 és 3,15 μm) intratrachealisan adtuk be 6–8 hetes Balb/c egereknek az előzőekben leírtak szerint (Atochina-Vasserman et al., 2009). Egyedül BSA-Cy7 konjugátumot használtunk kontrollként, a Cy7 fluoreszcens festék dózisa minden injekció esetében 300 ng volt. Az összes egér (n = 3–4/csoport) képeket készítettünk az injekció beadása előtt és 5, 20 perc, valamint 24, 48 és 72 órával az injekció beadása után. Az intratracheális instilláció után az egerek viselkedése és jólléte normális maradt, és a légzés érzéstelenítés alatt állandó volt. Az összes manipuláció után az egerek fizikai aktivitása és étvágya 3 napig normális volt, mielőtt feláldozták őket.

A részecskék beadása után meghatározott időpontban (24, 48 és 72 óra) az élő és érzéstelenített egerek tüdejében, májában, veséiben, gyomrában és belében a fluoreszcens jel biodisztribúcióját IVIS ® Lumina képalkotó rendszerrel (Xenogen Corp.) elemeztük ICG szűrőkészlettel (gerjesztés, 710–760 nm; emisszió, 810–875 nm). Az összes fluoreszcens képet 5 másodperces expozícióval készítettük, és normalizáltuk a fluoreszcens képek referenciavilágítási képekkel való felosztásával. A lumineszcencia intenzitását az Living Image szoftverrel (Xenogen Corp) számszerűsítettük. A numerikus adatok megszerzéséhez az intenzitás szintjéről az érdeklődési körzetben a képek utómunkálatait a Fidzsi-szigeteki szoftver segítségével elemeztük 1. A szóban forgó régió fluoreszcencia szintjét kiszámítottuk az egyes egerek sugárzásának hatékonysága és a kezdeti szint (0 idő) közötti különbségként.

A tüdő konfokális fluoreszcencia képalkotása

Húsz perccel a 0,65 μm méretű részecskék/BSA-Cy7 beadása után az egereket leöltük, a tüdőt eltávolítottuk, sóoldattal mostuk és Leica kriosztátban fagyasztottuk le szöveti fagyasztó közeggel. Az elkészített 15 μm vastagságú metszeteket lézeres pásztázó konfokális mikroszkóppal (Leica TCS SP8 X) elemeztük. A lézert 670 nm-en gerjesztették. A képeket két fluoreszcens csatorna felhasználásával rögzítettük: 680–726 nm spektrumtartomány, amely megfelel a tüdőszövet autofluoreszcenciájának, és 747–794 nm spektrumtartomány, amely megfelel a Cy7 fluoreszcens festéknek. A mintáról optikai képeket is rögzítettünk.

z-verem technológiát alkalmaztak a helyi szövet 3D-vizualizációjához, ahol a vaterit részecskék lerakódtak az alveoláris térben. A fluoreszcens festékkel bevont részecskék beültetett részecskéivel a tüdőminta kriozektálásánál a kiválasztott terület kiválasztása után a z-a kriozekciós síkra merőleges tengely letapogatási tartományt hajtottunk végre. A konfokális síkok kialakításának lépése legfeljebb 0,2 μm volt. A minta szkennelési eljárásának a megadott tartományban történő befejezését követően a Las X Leica szoftver 3D-s rekonstrukciót hajtott végre az érdeklődési körzetben. A fluoreszcens képek rögzítése ugyanazon csatornákon történt, amelyeket egy bekezdéssel korábban leírtak.

Farmakokinetika

Az egereket intratrachealisan 0,65 μm méretű részecskékkel injektáltuk, az alkohololdatból Cy7 fluoreszcens festékkel vagy BSA-Cy7-konjugátummal adszorbeálva. Kontrollként 0,01% alkoholt tartalmazó Cy7 fluoreszcens festéket használtunk. A Cy7 festék dózisa minden esetben 300 ng volt. A megadott időpontokban (5, 15 és 45 perc, 1,5, 3, 6, 9, 24 és 48 óra) az alkalmazás után 50 μl vérmintát vettünk a retroorbitális szinuszon keresztül egy üveg hematokrit kapillárison keresztül, heparinnal keverve 5/3 arányban. A relatív fluoreszcencia egységek (RFU) intenzitását Synergy H1 spektrofotométerrel (BioTek Instruments, Inc.) mértük, a gerjesztés 720 nm-nél, az emissziós spektrum 750–800 nm-nél történt, 1 nm-es lépésekkel. A Cy7 fluoreszcens festék emissziós spektrumának csúcsa 773 nm-nél van. Minden koncentrációhoz kiszámolták, hogy a relatív fluoreszcencia egység (RFU) értéke mennyivel nőtt a nulla koncentrációhoz képest a megadott tartományban, vagyis a következő arányt számolták:

Ahol „I” az intenzitás növekedési együtthatója és a „λ” - spektrum hullámhossza. Az RFU jel összegzését 765 és 785 nm között számítottuk 1 nm-es lépésekben.

Statisztika

Az ANOVA teszthez a webhelyet használták: http://vassarstats.net (egyirányú varianciaanalízis független vagy összefüggő mintákra), amely a mintaeszközök páros összehasonlítását is elvégzi a Tukey HSD teszt segítségével, amely összehasonlítja az összes lehetséges párat. jelenti és használja a Studentized tartomány eloszlást. Két pár (víz/sóoldat és kis/nagy aggregátum frakció) összehasonlításával meghatároztuk a kapott eredmények statisztikai szignifikanciáját a vaterit részecskék átkristályosodási dinamikájának tanulmányozása során négy különböző oldatban. A biodisztribúciós vizsgálatban az egyes csoportok egyes szerveinek összes sugárzási hatékonysági értékét összehasonlítottuk minden időpontban (24, 48 és 72 óra). Három különböző anyag beadásának farmakokinetikai görbéit hasonlítottuk össze. Két jelentőségi szintet állapítottak meg (o ∗ o ∗∗ o ∗ o ∗∗ o Kulcsszavak: vaterit részecskék, pulmonáris gyógyszerbeadás, felszabadulás meghosszabbítása, méretfüggő biodisztribúció, gyógyszerhordozók

Idézet: Gusliakova O, Atochina-Vasserman EN, Sindeeva O, Sindeev S, Pinyaev S, Pyataev N, Revin V, Sukhorukov GB, Gorin D és Gow AJ (2018) A tüdő része. Elülső. Pharmacol. 9: 559. doi: 10.3389/fphar.2018.00559

Beérkezett: 2018. február 03 .; Elfogadva: 2018. május 10 .;
Publikálva: 2018. június 4.

Salvatore Salomone, Università degli Studi di Catania, Olaszország

Yanqi Ye, Észak-Karolinai Egyetem, Chapel Hill, Egyesült Államok
Ana Aguiar-Ricardo, Universidade Nova de Lisboa, Portugália