Az IL-1 jelátvitel genetikai inaktiválása fokozza az érelmeszesedéses plakk instabilitását és csökkenti az ér kifelé történő átalakulását előrehaladott érelmeszesedésben egerekben

Matthew R. Alexander, 1,2 Christopher W. Moehle, 1,2 Jason L. Johnson, 3 Zhengyu Yang, 4 Jae K. Lee, 4 Christopher L. Jackson, 3 és Gary K. Owens 1,2

1 Molekuláris Élettani és Biológiai Fizikai Tanszék és 2 Robert M. Berne Kardiovaszkuláris Kutatóközpont, Virginia Egyetem, Charlottesville, Virginia, USA. 3 Bristoli Szívintézet, Bristoli Egyetem, Bristol, Egyesült Királyság. 4 Közegészségügyi Tudományok Tanszék, Virginia Egyetem, Charlottesville, Virginia, USA.

Cím levelezés: Gary K. Owens, Virginia Egyetem Orvostudományi Kar, 415 Lane Road, P.O. Box 801394, Charlottesville, Virginia 22908, USA. Telefon: 434.924.2652; Fax: 434.982.0055; E-mail: [email protected].

Alexander M. cikkei: JCI | PubMed | Google ösztöndíjas

Keresse meg Johnson, J. cikkeit itt: JCI | PubMed | Google ösztöndíjas

Jackson, C. cikkei megtalálhatók itt: JCI | PubMed | Google ösztöndíjas

Publikálva 2011. december 27 - További információ

Kapcsolódó cikk:

IL-1 és érelmeszesedés: egér csavar egy fejlődő emberi történethez

Absztrakt

A gyulladás az érelmeszesedés kritikus eleme. Az IL-1 egy klasszikus proinflammatorikus citokin, amely összefüggésbe hozható az érelmeszesedéssel. Klinikai vizsgálatot indítottak, amelyben az IL-1β-ra specifikus antitest hatását vizsgálják ateroszklerózisos betegek kardiovaszkuláris eseményeire. A JCI e számában Alexander és munkatársai. arról számoltak be, hogy az IL-1 receptort nélkülöző egereknek váratlanul vannak olyan előrehaladott érelmeszesedés-jellemzői, amelyek arra utalnak, hogy az érelmeszesedési plakkok kevésbé stabilak lehetnek. Ezek az eredmények szemléltetik az ateroszklerózis gyulladásos útvonalainak bonyolultságát, és azt sugallják, hogy az érelmeszesedés gyulladáscsökkentő megközelítéseinek gondos kalibrációjára van szükség.

Szerzői

Az ateroszklerózis egy nagy artériákat érintő krónikus betegség, amely gyulladásos és vaszkuláris sejteket, extracelluláris mátrixot és lipideket tartalmazó plakkok képződésével jár (1). Az érelmeszesedés klinikai szövődményei az artériás lumen elzáródása révén jelentkeznek, ami a függő szövetek elégtelen oxigénellátásához vezet. Az ateroszklerózissal összefüggő morbiditás és mortalitás nagy része a szív koszorúér-keringésének betegségei miatt következik be, ahol a luminalis obstrukció 2 elsődleges mechanizmus révén következik be: (a) plakknövekedés az ér kifelé történő nem megfelelő átalakításával, ami érszűkülethez vezet, és (b) instabil plakkok képződése, amelyek hevesen szakadnak, kiváltva az okklúziós trombus képződést (2). A kiterjedt kutatások ellenére alapvető hiányosságok vannak ezekről a folyamatokról, és óriási szükség van az érelmeszesedéses érbetegségek kórélettanának jobb megértésére annak érdekében, hogy új terápiás stratégiákat dolgozzanak ki a klinikai szövődmények megelőzésére.

A jelen vizsgálatokat annak a hipotézisnek a tesztelésével kezdtük, hogy az IL-1 elősegíti az instabil plakkok fenotípusának kialakulását károsodott kifelé tartó erek átalakulásával és fokozott luminalis szűkülettel előrehaladott ateroszklerózis esetén az apolipoprotein E-hiányos (apoE-hiányos) (gén: Apoe; fehérje: APOE) egér. Meglepetésünkre az eredmények éppen az ellenkezőjét mutatták. Az IL-1 jelátvitel inaktiválása az IL-1R1 elvesztése révén Apoe-a knockout egerek az ateroszklerotikus plakk instabilitásának több indexét fokozták, beleértve a csökkent plakk SMC tartalmat és fedést, csökkent plakk kollagéntartalmat, megnövekedett intraplaque vérzést, valamint károsodott kifelé tartó erek átalakulását, ami csökkent lumen mérethez vezetett. Bizonyítékokat szolgáltatunk arról is, hogy az IL-1 jelátvitel elősegíti az extracelluláris proteáz, az MMP3 expresszióját, amely fokozza az ér kifelé történő átalakulását az érelmeszesedésben és közvetíti a tenyésztett SMC-k IL-1 által indukált migrációját. Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy az IL-1 meglepő kettős védő szerepet játszik az érelmeszesedésben azáltal, hogy fokozza a plakk stabilitásának jellemzőit és elősegíti az ér kifelé történő átalakulását, legalábbis részben az MMP3 termelés fokozásával.

Az IL-1R1 hiány csökkenti az ateroszklerotikus plakk méretét az aorta gyökérnél. Az IL-1 előrehaladott atherosclerosisban betöltött szerepének meghatározásához egereknek, amelyekből hiányzik az IL-1 receptor I típusa és az apoE sem (Il1r1 -/- Apoe -/-) és egyszeri kieséses vezérlők (Il1r1 +/+ Apoe -/-) magas zsírtartalmú étrendet tápláltak 27–30 hétig, előrehaladott érelmeszesedés kialakulásához. A magas zsírtartalmú étrend etetésének befejezése után, Il1r1 -/- Apoe -/- az egerek anyagcsere mértékükben, például testtömegükben, plazma koleszterinszintjükben vagy plazma triglicerid szintjükben nem különböztek szignifikánsan a kontroll egerektől (1. kiegészítő ábra; kiegészítő cikk online elérhető ezzel a cikkel; doi: 10.1172/JCI43713DS1). azonban, Il1r1 -/- Apoe -/- az egereknél az aorta gyökér 4 helyén jelentősen csökkent a lepedék mérete (1. ábra). Ezek az eredmények összhangban vannak a korábbi vizsgálatokkal, amelyek az aortagyökér ateroszklerózisában proaterogén szerepet játszanak az IL-1 szignalizációban (20, 22, 23, 25, 29).

Az IL-1R1 hiány csökkenti az aorta gyökér előrehaladott érelmeszesedését. (A) A Movat-festett aorta metszetek reprezentatív képei Il1r1 -/- Apoe -/- és Il1r1 +/+ Apoe -/- egerek 27–30 hetes, magas zsírtartalmú étrendi etetés után. Mérlegsorok: 500 μm. (B) A teljes ateroszklerotikus plakkterület mennyiségi meghatározása a Il1r1 +/+ Apoe -/- és Il1r1 -/- Apoe -/- egerek 150 μm-es időközönként az aorta szelep rögzítési helyétől. *P +/ + Apoe -/-; n = 12, Il1r1 -/- Apoe -/- . Az adatok az átlag ± SEM értéket képviselik.

Az IL-1R1 hiány csökkenti az érelmeszesedéses erek kifelé történő átalakulását. Az aorta gyökér mellett teszteltük az IL-1R1 hiány hatását az atherosclerosisra is a brachiocephalicus artérián, amely az egerekben előrehaladott plakkképződés helye (30, 31). Érdekes, hogy az atherosclerotikus lepedék mérete a brachiocephalic artériákon belül Il1r1 -/- Apoe -/- az egerek csökkent tendenciát mutattak, de nem különböztek szignifikánsan az Il1r1 +/+ Apoe -/- az artéria 5 helyét ellenőrzi (n = 12–14 egér csoportonként; P = 0,07) (2. ábra, A és B ábra). Azonban a brachiocephalic artéria területe a belső elasztikus rétegben (IEL) jelentősen csökkent Il1r1 -/- Apoe -/- egerek Il1r1 +/+ Apoe -/- kezelőszervek (2. ábra, A és C ábra). Továbbá, Il1r1 -/- Apoe -/- az egereknél az 5 brachiocephalicus artéria helyén a lumen területe több mint 50% -kal csökkent Il1r1 +/+ Apoe -/- kontroll egerek (2. ábra, A és D ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy bár az IL-1R1 hiány nem változtatja meg szignifikánsan a plakk méretét a brachiocephalicus artériánál, az IL-1 jelátviteli inaktiválása a kompenzatív kifelé tartó erek átalakulásának csökkenését eredményezi, ami a lumen méretének csökkenéséhez vezet.

Az IL-1R1-hiány csökkenti az érelmeszesedéses brachiocephalicus artériák kompenzatív kifelé történő átalakulását. (A) A reprezentatív brachiocephalicus artériák Movat-festése Il1r1 -/- Apoe -/- és Il1r1 +/+ Apoe -/- egerek. Mérlegsorok: 200 μm. (B-D) Ateroszklerotikus plakk területe (B), az IEL-en belüli hajóterület (C), és a lumen területe, P -/- Apoe -/- és Il1r1 +/+ Apoe -/- egerek, P +/ + Apoe -/-; n = 12, Il1r1 -/- Apoe -/- . Adatok B-D átlagot ± SEM jelentenek.

Noha az aorta gyökérben az ér és a lumen méretének morfometriai elemzése bonyolult lehet a szelepek jelenlétével, korábbi vizsgálatok megmérték az IEL hosszát az egyes aorta sinusokon belül, hogy kiszámítsák az ér területét, ezeknek a hosszúságoknak az összegeként kerületi kerületként. (32) Ezeknek a módszereknek az aorta gyökérnél történő alkalmazásával az eredmények kiderült Il1r1 -/- Apoe - - - az egereknek csökkent az érmérete a kontrollokhoz képest (2A. Kiegészítő ábra). Bár ez másodlagos lehet ezeknél az állatoknál a csökkent plakkméretnél (1. ábra), a lumen mérete az aorta gyökereinél Il1r1 -/- Apoe A -/- egerek szintén szignifikánsan csökkentek a kontroll egerekhez képest (2B. Kiegészítő ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy IL-1R1-hiányos egereknél hiányzik az aorta gyökér kompenzáló, kifelé irányuló érrendszere, ami összhangban áll az IL-1R1-hiányos egerekben a brachiocephalicus artériánál kialakuló kifelé irányuló erek átalakulásának megfigyelt csökkenésével. Ezek az eredmények együttesen azt sugallják, hogy az IL-1 váratlanul jótékony szerepet játszik az előrehaladott érelmeszesedésben azáltal, hogy elősegíti az ér kifelé történő átalakulását, hogy korlátozza az ér lumen szűkülését.

Az IL-1R1 hiány csökkenti az érelmeszesedéses plakk-stabilitás jellemzőit. (A-E) A brachiocephalic artéria elváltozásainak reprezentatív képei Il1r1 +/+ Apoe -/- és Il1r1 -/- Apoe -/- egerek (A) picrosirius vörös festés és polarizált fény mikroszkópia a kollagén kimutatásához, (B) SM α-aktin immunfestés SMC-k kimutatására a plakk luminalis felületén (nyílhegyek) és a teljes plakk SMC tartalom,C) Mac2 immunfestés plakk makrofágok kimutatására, (D) Movat festés intraplaque rbc-hez (nyíl), és (E) immunfestés a TER-119 rbc markerre (a dobozos területről nagyítva D). (F-J) (F) plakk-kollagéntartalom alapján picrosirius vörös festés, P +/ + Apoe -/-; n = 12, Il1r1 -/- Apoe -/- . Mérlegsorok: 200 μm (A-D); 20 μm (betét, B; E).

Az IL-1R1 hiány csökkenti az MMP3 expresszióját a brachiocephalicus artéria plakkjában és az érfalban. (A) Reprezentatív képek az MMP3 festéséről az ateroszklerotikus brachiocephalikus artériákban, közvetlenül az aortaív kereszteződésén túl Il1r1 +/+ Apoe -/- és Il1r1 -/- Apoe -/- egerek. Mérlegsorok: 200 μm. (B és C) A plaketten belüli pozitív terület százalékos arányának meghatározása (B) és az edény közegét (C) az MMP3-ra Il1r1 +/+ Apoe -/- és Il1r1 -/- Apoe -/- egerek. *P +/ + Apoe -/-; n = 10, Il1r1 -/- Apoe -/- ), és az adatok C átlag ± SEM (n = 14, Il1r1 +/+ Apoe -/-; n = 12, Il1r1 -/- Apoe -/- ).

Az IL-1β elősegíti az MMP3-függő SMC migrációt a Matrigel-gáton. A Matrigel-bevonattal ellátott Transwells alsó részén számolt SMC-szám IL-1β-val nőtt az alsó kamrában Mmp3 + /+ SMC-k, de nem Mmp3 -/- SMC-k. *P Vita

Állatok. Il1r1 -/- egereket (# 003245; Jackson Laboratory), legalább 5 nemzedéket C57BL/6J-re keresztezve (> 96% C57BL/6J), Apoe -/- egerek (# 2052; Jackson Laboratory), amelyeket 11 generációval kereszteztek C57BL/6J-re (> 99,9% C57BL/6J). Il1r1 +/+ Apoe -/- és Il1r1 +/– Apoe -/- továbbá Il1r1 -/- Apoe -/- és Il1r1 +/– Apoe -/- tenyészpárokat használtak a kísérlet nagy részének előállításához Il1r1 +/+ Apoe -/- és Il1r1 +/– Apoe -/- egerek, mindegyik genotípusból 4 kísérleti egér származik Il1r1 +/– Apoe -/- keresztbe. Az egereket PCR-rel genotipizáljuk a Jackson Laboratory protokolljai szerint és az előzőekben leírtak szerint (76), a következő primerek és körülmények alkalmazásával: 5′-GAGTTACCCGAGGTCCAGTGG; 5′-CCGAAGAAGCTCACGTTGTCAAG; 5′-GAATGGGCTGACCGCTTCCTCG; 95 ° C 30 másodpercig, 65 ° C 60 másodpercig és 72 ° C 60 másodpercig.

Állati étrend etetése és szövetek előkészítése. Női Il1r1 +/+ Apoe -/- és Il1r1 -/- Apoe -/- az egereket magas zsírtartalmú (nyugati típusú) diétával táplálták, amely 21% tejzsírt és 0,15% koleszterint (Harlan Teklad) tartalmazott, 27–30 héten át, 8 hetes kortól kezdve (átlag ± SEM 28,6 ± 0,26 hétig Il1r1 +/+ Apoe -/- egerek és 28,3 ± 0,27 hét Il1r1 -/- Apoe -/- egerek). Az egereket 4 órás éhgyomorra feláldoztuk, és a jobb pitvar levágása után vért gyűjtöttünk. Az egereket ezután a bal kamrán keresztül 5 ml PBS-sel, majd 10 ml 4% paraformaldehiddel perfundáltuk. Az aorta gyökereket tartalmazó brachiocephalikus artériákat és szíveket gondosan boncoltuk, és egy éjszakán át 4% paraformaldehidben rögzítettük, mielőtt paraffinba ágyaznánk. A teljes plazma koleszterin és triglicerid szint meghatározására szolgáló vizsgálatokat (Abbott Laboratories) a Virginia Egyetem Klinikai Kórtani Laboratóriuma végezte.

Brachiocephalicus artéria és aorta gyökér immunhisztokémiai és morfometriai elemzése. A parafinba ágyazott brachiocephalikus artériákat sorozatosan 5 μm vastagságban metszettük az aortaívtől a jobb subclavia artériáig. A morfometriai és immunhisztokémiai elemzéshez, kivéve az alábbiakban leírtakat, az egyes brachiocephalicus artériák metszeteit 120 μm-es időközönként 0 és 480 μm közötti távolságban festettük az aortaívtől távolabb. Az aorta gyökereket 5 μm vastagságban metszettük, kezdve a proximálisan, az aorta szelepek első bizonyítékánál az aortához való kapcsolódási helyükön. A metszeteket megfestettük és 150 μm-es intervallumokban elemeztük, 150-600 μm-re, disztálisan ettől a helytől.

Az összes képelemzést az egér genotípusától elvakult megfigyelők végezték. Az edény morfometriáját és a pozitív immunhisztokémiai vagy picrosirius vörös festés területeit Image-Pro Plus (Media Cybernetics) alkalmazásával számszerűsítettük. A pozitív festés kimutatásához az egyes foltok pozitív jelét képviselő színspektrum azon részét, amelyet az Image-Pro Plus színkocka alapú módszerével határoztak meg. Ezt a színdefiníciót ezután egységesen alkalmazták a festék összes digitalizált képén, hogy meghatározzák a teljes pozitív területet az érdeklődési körzeten belül, például a plakknál vagy az érfalán, majd ezt a pozitív területmérést a plakk vagy az ér teljes területére normalizálták. fal a szövegben leírtak szerint. A plakk SMC lefedettségét az SM α-aktin-pozitív sejtekkel borított plakk luminalis felületének százalékos arányában határoztuk meg, amint azt korábban leírtuk (80). Az intraplaque vérzést a plaketten belül élénkpiros festésként azonosítottuk Movat festés alapján, megerősítve az rbc jelenlétét a TER-119 immunhisztokémiai módszerrel. A csoportos átlagokkal való összehasonlítás céljából az 1–4. Ábrákon szereplő reprezentatív képek konkrét adatértékeit a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza.

Ezt a munkát az NIH RO1 HL38854, P01 HL19242 és R01 HL57353 (GK Owensnek), az American Heart Association prediktori ösztöndíja (0615326U) és az Orvosi Tudósok Képzési Programjának képzési támogatása (5T32GM007267-26) (MR Alexander részére), valamint a kardiovaszkuláris kutatások alapképzési támogatása (5T32-HL007284) (CW Moehle részére). A szerzők köszönetet mondanak Dominique Rose-nak, Rupanda Tripathinek, Melissa Bevardnak és John Sandersnek a kiváló technikai segítségért; Murgai Meera és Laura Shankman segítségért az adatok elemzésében; Paul Manser és Elizabeth Greene segítségért a statisztikai elemzésért; és Norbert Leitinger, Coleen McNamara, Amy Tucker és Brian Wamhoff hasznos beszélgetésekért. Ezúton is szeretnénk köszönetet mondani H. Roger Lijnennek a kegyes ajándékért Mmp3 + /+ és Mmp3 -/- SMC-k.

Összeférhetetlenség: Gary K. Owens a NanoMedical Systems Inc. részvényese és tudományos vezetője, amely az ezen vizsgálatokkal nem összefüggő stent technológiát fejleszt. Gary K. Owens és Christopher L. Jackson függetlenül kaptak kutatási támogatást az AstraZeneca Pharmaceutical Inc.-től az ebben a kéziratban közöltektől elkülönített vizsgálatokra. Jae K. Lee a Key Genomics Inc. tulajdonjogáról számolt be.

Hivatkozási információk: J Clin Invest. 2012; 122 (1): 70–79. doi: 10.1172/JCI43713.