Krónikus vesebetegek vesesejtes karcinómái a rákkeltő arisztolokinsav mutációs jelét hordozzák

Nefrológiai, artériás hipertónia, dialízis és transzplantáció osztály, Egyetemi Kórház Központ, Orvostudományi Kar, Zágrábi Egyetem, Zágráb, Horvátország

Levelezés a: Bojan Jelaković, Orvostudományi Kar, Zágrábi Egyetem, Kišpatićeva 12, 10000 Zágráb, Horvátország, tel .: + 385-95-9030-751, e-mail: [email protected] és Jiri Zavadil, a Nemzetközi Kutatási Ügynökség Rák, 150 kurzus Albert Thomas, 69372 Lyon cedex 08, Franciaország, Tel .: + 33‐4-72-73-83-62, FAX: + 33-44-72-73-83-22, E-mail: zavadilj @ iarc.fr A szerző további cikkeinek keresése

Molecular Mechanisms and Biomarkers Group, Nemzetközi Rákkutató Ügynökség, Lyon, Franciaország

Patológiai Osztály, Dr. Josip Benčević Általános Kórház, Slavonski Brod, Horvátország

Molecular Mechanisms and Biomarkers Group, Nemzetközi Rákkutató Ügynökség, Lyon, Franciaország

Nefrológiai, artériás hipertónia, dialízis és transzplantáció osztály, Egyetemi Kórház Központ, Orvostudományi Kar, Zágrábi Egyetem, Zágráb, Horvátország

Molecular Mechanisms and Biomarkers Group, Nemzetközi Rákkutató Ügynökség, Lyon, Franciaország

Nefrológiai, artériás hipertónia, dialízis és transzplantáció osztály, Egyetemi Kórház Központ, Orvostudományi Kar, Zágrábi Egyetem, Zágráb, Horvátország

Levelezés a: Bojan Jelaković, Orvostudományi Kar, Zágrábi Egyetem, Kišpatićeva 12, 10000 Zágráb, Horvátország, tel .: + 385-95-9030-751, E-mail: [email protected] és Jiri Zavadil, a Nemzetközi Kutatási Ügynökség Rák, 150 Cours Albert Thomas, 69372 Lyon cedex 08, Franciaország, Tel .: + 33‐4-72-73-83-62, FAX: + 33-44-72-73-83-22, E-mail: zavadilj @ iarc.fr A szerző további cikkeinek keresése

Molecular Mechanisms and Biomarkers Group, Nemzetközi Rákkutató Ügynökség, Lyon, Franciaország

Patológiai Osztály, Dr. Josip Benčević Általános Kórház, Slavonski Brod, Horvátország

Molecular Mechanisms and Biomarkers Group, Nemzetközi Rákkutató Ügynökség, Lyon, Franciaország

Nefrológiai, artériás hipertónia, dialízis és transzplantáció osztály, Egyetemi Kórház Központ, Orvostudományi Kar, Zágrábi Egyetem, Zágráb, Horvátország

Molecular Mechanisms and Biomarkers Group, Nemzetközi Rákkutató Ügynökség, Lyon, Franciaország

Absztrakt

Rövidítések

Az elmúlt évtizedben magasabb epidemiológiai és klinikai jellemzőkkel rendelkező vese sejtes karcinómák (RCC) gyakoriságát regisztrálták a horvát endémiás nephropathia központban. 17 Célunk tehát az volt, hogy megvizsgáljuk az AA lehetséges szerepét az RCC etiológiájában az EN régiókból és közelről származó CKD betegek körében, a tumor DNS genomszintű mutációs spektrumának elemzésével.

Anyagok és metódusok

Betegminták

Nyolc RCC beteget elemeztek a gazdálkodó falvakból: öt olyan EN területről, amely korábban szennyezett kenyér fogyasztása miatt társult AA-val való kitettséghez, 5, 18, három pedig az EN régióhoz közeli falvakból, korábban nem jelentettek EN eseteket. Ezenkívül Horvátország nagyvárosi területéről két RCC-esetet elemeztek, mivel a kontrollokat valószínűleg nem tették ki AA-nak. A betegek klinikai jellemzőit az 1. táblázat sorolja fel. A vizsgálati protokoll tartalmazta a betegek tájékozott beleegyezését, és etikai jóváhagyásokat a Zágrábi Egyetem Orvostudományi Karának etikai tanácsai, a Slavonski Brodi Általános Kórház és a IARC Etikai Bizottsága. A nyolc EN RCC-páciens közül négyet (EN-01, EN-02, EN-04 és EN-05) azonosítottunk, akik saját kenyeret sütöttek, közülük hárman olyan gazdálkodók voltak, akik helyben termesztett búzából szedtek gabonát; egy betegnél CTN-t (EN-01), egynél UTUC-t (EN-02) és egynél (EN-06) szenvedő beteget diagnosztizáltak UTUC-val öt évvel az RCC diagnózisa előtt (lásd 1. táblázat).

Eset azonosítója Lakhely neme A műtét kora (év) RCC altípus ICD ‐ O Tumor fokozatú tumor stádium Preoperatív s ‐ kreatinin (µmol/L) CKD stádium eGFR Egyéb vesebetegségek

HU-01	EN	M	66	Törölje a cellát	8310/3	G4	pT3NxMx	710	5.	7.0	Igen, egy a Krónikus tubulointerstitialis nephropathia (CTN).
HU-02	EN	M	65	Törölje a cellát	8310/3	G2	pT1N0Mx	162	3	39.6	UTUCb b Egyidejű tumor.
HU-03	EN közelében	M	42	Törölje a cellát	8310/3	G2	pT1N0Mx	88	1	93.0	Nem
HU-04	EN	M	78	Törölje a cellát	8310/3	G2	pT1NxMx	757	5.	6.4	Nem
HU-05	EN közelében	M	55	Törölje a cellát	8310/3	G1	pT1NxMx	100	2	72.0	Igen c Nephrolithiasis és RCC a kontralaterális vesében.
HU-06	EN	M	76	Besorolatlan	8312/3	G4	pT3N2Mx	364	4	15.1	UTUCd d Az UTUC-t az RCC előtt 5 évvel diagnosztizálták.
HU-07	EN közelében	F	64.	Chromophobe	8317/3	G3	pT2NxMx	75	2	73.0	Nem
HU-08	EN	F	47	Törölje a cellát	8310/3	G2	pT2N0Mx	95	3	58.1	Nem
Ctrl-01	Nem EN	F	56	Törölje a cellát	8310/3	G3	pT2N0Mx	62	1	91.8	Nem
Ctrl-02	Nem EN	M	74.	Törölje a cellát	8310/3	G2	pT3aN0Mx	193	3	31.5	Nem

Becsült glomeruláris szűrési sebesség a diéta módosítása vesebetegségben (MDRD) egyenlet alapján, amelyet nem izotóphígítási tömegspektrometriával (IDMS) mértek. Az utolsó oszlop a beteg vesebetegségét mutatja, kivéve az RCC-t (UTUC: felső húgyúti urothelialis carcinoma).
a Krónikus tubulointerstitialis nephropathia (CTN).
b Egyidejű tumor.
c Nephrolithiasis és RCC a kontralaterális vesében.
d Az UTUC-t az RCC előtt 5 évvel diagnosztizálták.
Rövidítések: EN: endémiás régió; EN közelében: közvetlen közelében; F: nő; M: férfi; ICD ‐ O: az Onkológiai Betegségek Nemzetközi Osztályozása; CKD: krónikus vesebetegség; eGFR: becsült glomeruláris szűrési sebesség.

DNS izolálás

A formalinban rögzített paraffinba ágyazott (FFPE) tumorblokkokból származó hematoxilin-eozin készítményeket 20x-os nagyítású digitális szkenneléssel (Leica SCN400 Scanner, Leica Biosystems) azonosítottuk nekrotikus területektől mentes daganatos szövetek azonosításához. A makro-boncolásra szánt tumorterületeket az ImageJ ingyenes szoftverrel vagy a SlidePath Gateway Client, a Leica Biosystems alkalmazásával mértük. A Leica RM 2145 mikrotómával (Leica Microsystems) előkészített tíz µm-es szakaszokat alkalmaztuk a genomi DNS izolálására (2-3 ug, 5-10 ng/mm 2 hozam). A genomiális DNS-izolálás előtt a tárgylemezeket 5 percig 100% -os xilolban, majd 5 percig abszolút etanolban, 5 percig 85% -os etanolban, 5 percig 75% -os etanolban, 5 percig 75% -os etanolban, majd 5 percig milliQ vízben tartva parafinizáltuk. A DNS-izolálást QIAamp DNS FFPE Tissue kit (Qiagen) alkalmazásával hajtottuk végre. A DNS-hozamokat és -koncentrációkat Picogreen-vizsgálattal (Life Technologies) és Fluoroskan Ascent FL mikrolemez fluorométerrel (Thermo Fisher Scientific) mértük. A tisztaságot a NanoDrop 8000 spektrofotométerrel (Thermo Fisher Scientific) értékeltük. A genomi DNS integritását 0,8% -os agarózgél-elektroforézissel értékeltük.

Könyvtár előkészítés és teljes exom szekvenálás (WES)

Az adatfeldolgozás és elemzés szekvenálása

A szekvenciás leolvasásokat a Burrows-Wheeler Aligner, a Genomelemző Eszköztár (GATK, Broad Institute) hívta variánsok igazították, az ANNOVAR jegyzetelte és szigorúan szűrte az általános populációban megfigyelt genetikai variánsok eltávolítására, a nyilvános projektek adatainak felhasználásával 1000 genom (1000g, http://www.1000genomes.org/), Exome Sequencing Project (ESP, http://exome.gs.washington.edu/) és az SNP adatbázis 137-es buildje (dbSNP, http: //www.ncbi.nlm.nih .gov/SNP /). Azok a változatok, amelyek gyakorisága nagyobb, mint 0,1%, akár 1000 esetén isg vagy a dbSNP adatbázisban feljegyzett ESP adatbázisokat, és a The Cancer Genome Atlas (TCGA, http://cancergenome.nih.gov/) 560 esetéből származó adatok felhasználásával létrehozott csíravonal-változatok házon belüli paneljét, valamint a variánsok fragmensekben, amelyek a genom ismétlődő szekvenciáira mutatnak be, 90% -nál magasabb homológiával. Kérésre megadjuk a tesztelt 4031 SBS-változat teljes listáját, valamint a kontroll RCC mintákat. A nyers szekvenálási adatokat (fastQ és alignment (.bam) fájlok) a Nemzeti Biotechnológiai Információs Központ (NCBI) Sequence Read Archive (SRA, hozzáférési azonosítója SRP049084) tárolta, és az NCBI Genotípusok és Fenotípusok (dbGaP) engedélyezett hozzáférési rendszer.

Az AA mutációs aláírás meghatározása

Eredmények

Esetazonosító: SBS SBS/Mbp A> T SBS A> T/Mbp% A> T% C A G kontextus SB A> T SB o érték SB FDR q érték Hozzájárulás a Sig 1A/1B (Age) hozzájáruláshoz a Sig 22 (AA) AA aláíráshoz

HU-01	600	9.4	224	3.5	37.3	23.0	1.6 (128/78)	0,00064	0,010	228 (38%)	372 (62%)	Igen
HU-02	375	5.9	57	0.9	15.2	11.4	2,8 (39/14)	0,00098	0,013	256 (68%)	119 (32%)	Igen, egy a Az A> T és a C A G összefüggések alacsonyabb százaléka, de az NMF támogatja.
HU-03	355	5.5	17.	0,3	4.8	7.0	2,5 (10/4)	0,181	0,746	355 (100%)	0 (0%)	-
HU-04	249	3.9	124	1.9	49.8	22.3	2,7 (82/30)	0	0	0 (0%)	249 (100%)	Igen
HU-05	286	4.5	28.	0.4	9.8	8.2	1.3 (14/11)	0,689	1	231 (81%)	55 (19%)	-
HU-06	977	15.3	201	3.1	20.6	35.0	2,6 (140/53)	0	0	623 (64%)	354 (36%)	Igen
HU-07	443	6.9	76	1.2	17.2	23.7	1,8 (46/26)	0,025	0.231	325 (73%)	118 (27%)	Igen
HU-08	159	2.5	13.	0.2	8.2	0,0	1,8 (7/4)	0,546	1	159 (100%)	0 (0%)	-
Ctrl-01	199	3.1	15	0.2	7.5	0,0	0,6 (5/8)	0,579	1	185 (93%)	14 (7%)	-
Ctrl-02	388	6.1	25	0.4	6.4	7.5	0,9 (12/13)	1	1	376 (97%)	12 (3%)	-

A> T: A: T> T: A transzverzió; SB A> T: a szál torzítása, kifejezve az A: T> T: A arányát kifejezve a nem átírva ellen átírt szál (zárójelben látható a megfelelő keresztmetszetek száma). % C A G kontextus: A százalékos aránya: T> T: A transzverziók az AA aláíráshoz leggyakrabban jelentett összefüggésben SB o érték és hamis felfedezési arány (FDR) q érték = a szál torzításának szignifikancia mértéke, lásd: Anyagok és módszerek. A Sig-hoz való hozzájárulás (Sig = nem negatív mátrixfaktorizáció által meghatározott mutációs aláírás) az SBS számaként és a mintánként az összes SBS-szám megfelelő (zárójelben lévő) százalékában jelenik meg. AA aláírás - mintapozitivitás az AA aláíráshoz, figyelembe véve ≥50 SBS és ≥15% A> T, ≥20% C A G egyidejű előfordulását és jelentőségét (SB o és/vagy q érték) és a mutációs terhelés hozzájárulása a Sig 22-hez (AA).
a Az A> T és a C A G összefüggések alacsonyabb százaléka, de az NMF támogatja.
Rövidítés: SBS: egybázisos helyettesítések.

Vita

Vizsgálatunk azonosítja a specifikus AA mutációs aláírást a Balkán EN régióból és annak közvetlen közelében fekvő betegekből származó öt RCC daganatban, molekuláris bizonyítékot szolgáltatva a vesekéregben a karcinogenezissel társuló AA által vezérelt mutagén folyamatra, és utalva az AA etiológiájára. ráktípus a CKD összefüggésében. Míg az AA aláírás-pozitív EN RCC mutációs terhelése megerősíti az AA, 9, 10 erősen mutagén hatásait, alacsonyabbnak tűnik (4–15 SBS/Mbp) RCC készletünkben, összehasonlítva a korábban bejelentett AA aláírással pozitív UTUC-val ( 2–65 9 és 8–35 10 SBS/Mbp). Ezek a különbségek további epidemiológiai és laboratóriumi vizsgálatokat tesznek szükségessé nagyobb betegkészletek alkalmazásával annak megállapítása érdekében, hogy tükrözik-e az egyes földrajzi régiókban változó AA-expozíciós módokat, a különböző célsejt-típusok metabolizálási sebességét, a vizsgált szövetek heterogenitását befolyásoló mintavételi eljárásokat vagy egyéb tényezők.

Tekintettel az AA-tartalmú gyógynövények szabályozatlan globális piacára, amely emberek millióit veszélyeztetheti, különösen Kelet-Ázsiában, 3 megállapításunknak mélyreható következményei lehetnek az AAN-hez kapcsolódó további ráktípusok fokozott ismertségére. Az AAN molekuláris epidemiológiai vizsgálatainak robusztus kialakításának mostantól tartalmaznia kell az RCC eseteket az UTUC és HCC betegek mellett, a betegség globális felügyeletének javítása érdekében. Ezenkívül egy új régióban és egy új ráktípusban dokumentáljuk, hogy az érzékeny genomszéles képernyők olyan kifinomult mutációminták lebontási módszerekkel, mint például az NMF, képesek azonosítani az AA-t környezeti rákkockázati tényezőként az AAN-ben, és megbízható bizonyítékot szolgáltatnak a diagnosztikához. és megelőző megközelítések e súlyos közegészségügyi probléma felszámolására. 3, 25

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Dr. Želimir Stipančić és Tvrtko Hudolin a klinikai minták és adatok gyűjtésében nyújtott segítségért, Dr. Stephanie Villar és Christine Carreira asszony az archivált tumorminták feldolgozásáért nyújtott segítségért, valamint Dr. Magali Olivier a szekvenálási adatok elemzésével kapcsolatos hasznos megjegyzésekért. Köszönjük a New York-i Egyetem New York-i Egyetem Genom Technológiai Központjának Laura és Isaac Perlmutter Rákközpontnak az Illumina HiSeq2500 szekvenálási kísérletekhez nyújtott szakértői segítséget.