A dimerizáció hatása egy antibakteriális lizosztafin enzim farmakokinetikájára és aktivitására

3D modell és az Lst-HDD aminosav szekvenciája. (A) Az Lst-HDD homodimer elméleti modellje. A lizosztafin katalitikus doménje zöld színű, a lizosztafin peptidoglikán-kötő doménje cián színű, a dimerizációs domén kék színű, a távtartó pedig sárga színű. A modellt a PyMOL-ban (Schrödinger LLC, USA) készítették a 4LXC PDB bejegyzés alapján. (B) Az Lst-HDD aminosavszekvenciája. A színösszeállítás (A) szerint.

SDS-PAGE és Lst-HDD méretkizárásos kromatográfia (SEC). (A) tisztított lizosztafin (1. sáv) és Lst-HDD (2. sáv) SDS-PAGE; Az M sáv molekulatömeg-standardokat tartalmaz, amelyek molekulatömege az Lst-HDD bal (B) SEC kromatogramján látható. A bemenet mutatja az oszlop molekulatömeg-kalibrálását.

A S. aureus ATCC 29 213 sejtszuszpenziójának tisztítása a lizosztafin (A) vagy az Lst-HDD (B) különböző koncentrációi miatt. A lizosztafin koncentrációja 2 ug/ml (kék), 1 ug/ml (narancssárga), 0,5 ug/ml (szürke), 0,25 ug/ml (sárga), és kontroll lizosztafin (fekete) nélkül; Az Lst-HDD koncentrációi 12 µg/ml (kék), 6 µg/ml (narancs), 3 µg/ml (szürke), 1,5 µg/ml (sárga), 0,75 µg/ml (világoskék), 0,38 µg/ml (zöld), és vezérlés Lst-HDD nélkül (fekete). Az n = 3 (lizosztafin) vagy az n = 2 (Lst-HDD) kísérletek átlagos értékeit mutatjuk be, a hibasávok a szórást jelentik.

A lizosztafin (kék, körök) és az Lst-HDD (narancssárga, háromszögek) maradék koncentrációi a patkány plazmájában. Az n = 4 patkány feletti átlagértékeket mutatjuk be, a hibasávok a szórást jelentik.

Absztrakt

1. Bemutatkozás

5 óra, illetve 11,3 óra [22]. Az antibakteriális lizinek gyors eliminációs sebessége többszöri beadás és/vagy nagyobb dózisú fehérje szükségességéhez vezet a baktériumok felszámolásához [23,24]. Ezért kívánatos lenne a szisztémás keringésben megnövelt tartózkodási idővel rendelkező lizinvariánsok létrehozása.

2. Eredmények és megbeszélés

2.1. A lizosztafin dimerizált változatának elkészítése

2.2. Az Lst-HDD túlnyomórészt dimerként létezik

16 kDa. Az első két csúcs valószínűleg az Lst-HDD dimer és monomer fajainak felel meg. Bár számított molekulatömegük

35 kDa, a különbség valószínűleg az Lst-HDD állítólag hosszúkás alakjának tulajdonítható, ami gyorsabban eluálódik, mint a megfelelő molekulatömegű globuláris fehérjék. Így az Lst-HDD valóban dimerizálni tudott, bár nem minden molekula képzett dimereket. A méretkizárásos kromatográfiás kísérletek mobil fázisa azonban 0,5 M NaCl-ot tartalmazott. A só magas koncentrációja gyengíti az elektrosztatikus kölcsönhatásokat. Mivel az elektrosztatikus interakciók jelentős szerepet játszanak a kiválasztott dimerizációs domén dimerizálásában [33], alacsony sótartalmú körülmények között várható a nagyobb arányú dimerizált Lst-HDD molekula. Alternatív megoldásként az Lst-HDD hiányos dimerizációjának oka lehet a molekulák egy részének nem megfelelő hajtogatása.

2.3. A dimerizáció a lizosztafin bakteriolitikus, de nem a katalitikus aktivitását befolyásolja

2.4. A dimerizálás javítja a lizosztafin farmakokinetikai jellemzőit

50 ug/ml. Az injekció után 25 perccel az első mintavételi időpontban azonban csak 2,8 ± 0,2 µg/ml lizosztafin és 1,6 ± 0,1 µg/ml Lst-HDD maradt. Így,

3. Anyagok és módszerek

3.1. Klónozás, kifejezés és tisztítás

3.2. Méretkizárásos kromatográfia

3.3. Katalitikus aktivitás

3.4. Minimális gátló koncentráció

3.5. Sztafilolitikus aktivitás

1,2 × 109 CFU/ml) és 180 ul szuszpenziót vittünk át egy 96 üregű lemez lyukába. A lemezt 10 percig 37 ° C-on és 400 fordulat/perc sebességgel inkubáltuk, és a lyukakba 20 ul különféle koncentrációjú lizosztafint vagy Lst-HDD-t adtunk. A szuszpenzió zavarosságát 1 órán át, 37 ° C-on, lassú rázással ellenőriztük, 1 perces időközönként 550 nm hullámhosszon végzett mérésekkel Multiscan FC mikrolemez-olvasóval (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA). A kísérlet során az egyes fehérjekoncentrációk mérését három példányban hajtottuk végre, és a kísérletet háromszor (lizosztafin) vagy kétszer (Lst-HDD) hajtottuk végre. A fehérjék közötti sztafilolitikus aktivitás összehasonlításához az adatokat az alábbiak szerint dolgoztuk fel. Minden fehérjekoncentrációnál meghatároztuk a szuszpenzió zavarosságának 50% -kal történő csökkentéséhez szükséges időt (féltisztulási idő), és a fehérje koncentráció és a féltisztulási idő közötti kapcsolatot hatványfüggvény közelítette meg. Ezt a kalibrációs görbét alkalmazták 50 nM fehérje féltisztulási idejének becsléséhez.