Redukált Gliadin búzakenyér: A gluténmentes étrend alternatívája a gluténnel kapcsolatos patológiákat szenvedő fogyasztók számára

Társulás Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba, Spanyolország

Társulás Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, CSIC, Valencia, Spanyolország

Hovatartozás Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, Sevilla, Spanyolország

Társulás Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, Sevilla, Spanyolország

Társulás Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, CSIC, Valencia, Spanyolország

Társulás Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba, Spanyolország

Javier Gil-Humanes,
Fernando Pistón,
Rossana Altamirano-Fortoul,
Ana Real,
Isabel Comino,
Carolina Sousa,
Cristina M. Rosell,
Francisco Barro

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Gil-Humanes J, Pistón F, Altamirano-Fortoul R, Real A, Comino I, Sousa C és mtsai. (2014) Redukált Gliadin búzakenyér: A gluténmentes étrend alternatívája a gluténnel kapcsolatos patológiákat szenvedő fogyasztók számára. PLoS ONE 9 (3): e90898. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0090898

Szerkesztő: Karol Sestak, Tulane Egyetem, Amerikai Egyesült Államok

Fogadott: 2013. október 20 .; Elfogadott: 2014. február 6 .; Közzétett: 2014. március 12

Finanszírozás: A spanyol gazdasági és versenyképességi minisztérium (AGL2010-19643-C02-02 projekt), az Európai Regionális Fejlesztési Alap (FEDER) és Junta de Andalucía (P09AGR-4783 projekt) támogatta ezt a munkát. A szerzők elismerik a Generalitat Valenciana pénzügyi támogatását is (Project Prometeo 2012/064). A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Anyagok és metódusok

A leírt, minden vonatkozó előírásnak megfelelő tanulmányhoz nem volt szükség engedélyre.

Növényi anyag

A Triticum aestivum cv. Négy transzgenikus redukált gliadin-vonala. Bobwhite 208 (’BW208’) és a T. aestivum cv. Három transzgenikus redukált gliadin-vonala. Bobwhite 2003 (’BW2003’) és a megfelelő vad típusú vonalaikat randomizált teljes blokktervezéssel, két ismétléssel vizsgálták. Mindkét vadfajta tavaszi búzafajta, amelyet a CIMMYT kapott a CM 33203 keresztezéssel az Aurora // Kalyan/Bluebird/3/Woodpecker törzskönyvvel. A BW2003 kultivort magas transzformációs hatékonysága miatt választották ki, és a T1BL.1RS rozokból történő transzlokációját hordozza. Másrészt a BW208 az SH 98 26 ‘Bobwhite’ vonalból származik, amelyet Pellegrineschi et al. [39], és nem tartalmazza a rozs transzlokációt. Jelen tanulmányban a BW208 és a BW2003 összes fehérjetartalma a száraz tömegre vonatkoztatva ~ 11,6% és ~ 10,5% volt. A teljes gluténfehérje-tartalom (gliadinek és gluténinek) a száraz tömeg körülbelül 8,7% -a, illetve 7,9% -a volt a BW208 és a BW2003 esetében.

Az összes transzgén redukált gliadin vonalról korábban beszámoltunk a [25] -ben, és tartalmazta a megfordított ismétlődő (IR) fragmenst ω/α (pGhp-ω/α és/vagy pDhp-ω/α vektorok), amelyek célja az összes csoport lefelé történő szabályozása. gliadinek RNAi által. A transzgénikus vonalakat 4-5 generáció alatt önbeporzás követte, és normális fenotípusokat mutattak, összehasonlítva a megfelelő vad típusokkal.

Gabona marása

Fehér lisztet nyertünk a redukált gliadin és a vad típusú vonalak két független ismétléséből. A szemcséket desztillált víz hozzáadásával 16,5% páratartalomra hidratáltuk két lépésben (24 és 20 órával az őrlés előtt), folyamatos rázással. Mindegyik vonal hidratált magjait (1 kg) külön-külön két lépésben őröltük egy CD1 Chopin (Chopin Technologies, Villeneuve-la-Garenne Cedex, Franciaország) szabványosított tesztmalomban. Az első lépésben fehér lisztet és teljes kiőrlésű lisztet kaptunk. A teljes kiőrlésű lisztet az őrlés második lépcsőjében visszatöltöttük, és a kapott fehér lisztet összekevertük a korábban kapott liszttel, amelynek össztermése körülbelül 60% volt. A lisztet egy hétig szobahőmérsékleten (RT) tároltuk. Kereskedelmi rizsliszt, amelyet a Harinera Derivats del Blat de Moro, S.L. (Parets del Vallés, Spanyolország) a gluténmentes kontroll kenyér elkészítéséhez használták.

Kenyérsütés

A tésztát liszt tömeg alapján készítettük: 300 g liszthez 180 ml vizet (225 ml vizet a rizsliszthez), 3,6 g sütőélesztőt (Saf-Instant, Lesaffre, Franciaország) és 4,8 g konyhasót adtunk. Az összetevőket Farinográfban (Brabender GmbH & Co. KG, Németország) 4 percig kevertük, és 10 percig pihentettük műanyag fóliával a száradás elkerülése érdekében. A tésztát manuálisan felosztottuk (50 g), és a tésztadarabokat mechanikusan hengereltük gömbhomogenizátorban (Brabender GmbH & Co. KG, Németország). A tésztadarabokat alumínium tálcákra helyezték, és 45 percig 30 ° C-on fermentálták. A tésztadarabokat elektromos konvekciós kemencében sütötték (Eurofours, Gommegnies, Franciaország). A sütési folyamatot 180 ° C-os rögzített kemence-hőmérsékleten 16 percig végeztük 2 kezdeti 10 másodperces gőzinjekcióval. Sütés után a kenyérkenyereket 30 percig pihentettük szobahőmérsékleten, hogy kihűljenek.

Kenyér jellemzése

A kenyér tömegét és térfogatát minden egyes mintából három cipóban határoztuk meg. A kenyér térfogatát a repce kiszorításának módszerével határoztuk meg [40]. A kenyerek nedvességtartalmát az ICC 110/1 sz. Módszerével [41] határoztuk meg, a kenyérminták előkezelésével. Minden mintából három kenyeret és mediális szeleteiket beszkenneltük (HP Scanjet 4400C, Hewlett – Packard, USA), majd meghatároztuk a magasságot és a szélességet a szélesség/magasság arány későbbi kiszámításához. A kéreg és a morzsa színét Chroma Meter CR-400 koloriméterrel (Konica Minolta Sensing Inc., Japán) határoztuk meg, és egy CIE-L * a * b * színskálán (CIE-Lab) fejeztük ki. A CIE-Lab színterét három merőleges tengely alkotja: L *, a * és b *. Ez a három koordináta jelzi a szín világosságát (L *; ahol L = 100 a fehér színt és az L = 0 fekete színt), valamint a zöld és a piros közötti pozíciót (a *; ahol a negatív értékek zöldet, a pozitív értékek pirosat jeleznek), valamint a kék és a sárga között (b *; ahol a negatív értékek kéket, a pozitívak pedig sárgát jelentenek). A három kenyér mindegyikén két független mérést végeztek a kéreg és a morzsa színének meghatározására.

Leíró szenzoros elemzés

11 képzett értékelőből álló testületet választottak ki a redukált gliadin és a vad típusú búzalisztnek és a rizslisztnek megfelelő kenyérminták (n = 20; 10 minta két ismétléssel) értékelésére. A tesztpályázók tapasztalatainak köre a kenyértermékek széles skálájának leíró elemzésében való részvételben és skála besorolásban 3 és 20 év között változott. A testületet alkotó összes személy megalapozott beleegyezését adta. A testület vakkóstolással értékelte az egyes minták megjelenését, aromáját, ízét és általános elfogadottságát. Az értékeléshez hat mintából álló szettet (1 cm vastag) szeleteken mutattunk be, véletlenszerű sorrendben kódolva és tálalva. Ezenkívül az értékelőknek ásványvizet biztosítottak a szájpadlás megtisztítása érdekében a kóstolók között. Minden értékelő megkapta a szenzoros tulajdonságok listáját és azok definícióit, amelyek útmutatásként szolgálnak a minta értékelése során.

Aminosavak profiljának jellemzése

A redukált gliadin és a vad típusú vonalak aminosav-profiljának jellemzéséhez teljes kiőrlésű lisztet használtunk. A lisztmintákat 6 N klórsav és fenol alkalmazásával hidrolizáltuk, majd derivatizáltuk és elemeztük. A derivatizáláshoz az AccQ Fluor reagens készletet (Waters) használtuk. Először 20 µl hidrolizált mintát összekevertünk 60 µl pufferoldattal (0,2 M borátpuffer), majd 20 µl derivatizáló reagenst (2 mg/ml 6-aminokinolil-N-hidroszukcinimidil-karbamát, AQC) adtunk hozzá. a gyártó utasításait. 10 perc után 50 ° C-on az oldatot közvetlenül a nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás tandem tömegspektrometriás (HPLC-MS/MS) rendszerbe (Varian 320-MS) injektáltuk. Az aminosav-elválasztást 2,5 mM ammónium-acetát (pH = 5,75) oldószerként, B oldószerként 2,5 mM ammónium-acetát (pH = 6) és acetonitril (30–70, ammónium-acetát: acetronitril) oldatával hajtottuk végre. Stacionárius fázisként a Pursuit XRs Ultra 2.8 C18 100 × 2,0 mm-es oszlopot (Agilent) használtuk, és az áramlás 200 ul/perc volt. A detektálást tömegspektrometriával (MS) végeztük elektrospray ionizációs móddal (ESI) (pozitív és negatív). Az aminosav mennyiségét a minta teljes tömegének százalékában fejezzük ki.

Pásztázó elektronmikroszkópia (SEM)

A mintákat (tésztát és kenyeret) lefagyasztották és megszárították, majd egy borotvapenge hegyével és kézzel arannyal bevonták. JEOL JSM6300 pásztázó elektronmikroszkóppal (JEOL, Tokió, Japán) alkalmaztuk a minták megfigyelését 15 kV feszültségen szobahőmérsékleten. SEM képeket 1000x és 3000x nagyítással készítettünk minden minta újonnan kitett felületére. A D894 (csökkent gliadin tartalom), az E82 (csökkent gliadin és alacsony molekulatömegű (LMW) glutenin tartalom) és a vad típusú BW208 mintákat elemeztük.

G12 Versenyképes ELISA

Statisztikai analízis

Az adatokat az R statisztikai szoftver 2.12.1 verziójával [42] elemeztük, a Graphical User Interface (GUI) R Commander segítségével. A varianciaanalízis (ANOVA) főbb feltételezéseit megerősítette Shapiro-Wilk normál eloszlásának tesztje ('shapiro.test' funkció, csomag statisztikák), a Levene homocedasticitás-tesztje ('leveneTest' funkció, csomagautó) és Ramsey's regressziós egyenlet specifikációs hibatesztje (RESET) a linearitáshoz ('resettest'; csomag lmtest), és szükség esetén a változókat transzformálták. A különböző vonalak közötti statisztikai elemzést a varianciaanalízis (ANOVA) „Variable ∼ Line + Block” („aov”, package agricolae funkció) elemzésével, majd Tukey őszintén szignifikáns különbség (HSD) post hoc all- páronkénti összehasonlítási teszt ('HSD.test' függvény, mezőgazdaság csomag). Valamennyi statisztikai elemzésben a 0,05 alatti P értékeket tekintettük szignifikánsnak.

Az aminosav-tartalom különbségeit a kontroll és az alacsony gluténszintű vonalak között az ANOVA „Variable ∼ Block + Line” modell segítségével, az „lm” (csomagstatisztika) funkcióval értékeltük. Az átlagos összehasonlításokat Dunnett post hoc többszörös összehasonlító tesztjével végeztük (‘glht’ funkció, csomag multcomp). A box-whisker diagramot a „boxplot” (csomaggrafika) funkcióval ábrázoltuk.