A fényáteresztő aggregometria harmonizálása Hollandiában az SSC-ISTH irányelv végrehajtásával

Kutatási cikk

  • Teljes cikk
  • Ábrák és adatok
  • Hivatkozások
  • Idézetek
  • Metrikák
  • Engedélyezés
  • Újranyomtatások és engedélyek
  • PDF

Absztrakt

Bevezetés

A fényáteresztő aggregometriát (LTA) arany standard módszernek tekintik azoknak a betegeknek a kivizsgálására, akiknél gyaníthatóan a primer hemosztázis rendellenességei vannak a vérlemezke működésének örökletes vagy szerzett hibái miatt [1]. Ebben a módszerben az agonistára adott válaszként a vérlemezke aggregáció mintázatát vérlemezkében gazdag plazmában (PRP) mérjük turbidometriával [2]. Különböző nemzeti és nemzetközi irányelvek szerint az LTA fontos szerepet játszik a vérzésre hajlamos betegek diagnosztikai munkájában [3–9]. Teljes vérelemzésen alapuló új technikák, pl. impedancia aggregometriát és thrombocyta funkció elemzőt (PFA) fejlesztettek ki, de ezek nem rendelkeznek érzékenységgel az enyhe thrombocytafunkciós rendellenességek kimutatására [10, 11], vagy csak kiegészítik az LTA-t, például az áramlási citometriát [12]. Így az LTA továbbra is az egyik leghasznosabb eszköz a feltételezett vérlemezke-rendellenességek értékelésében.

fényáteresztő

Ennek a tanulmánynak három célja volt:

Annak megvizsgálása, hogy egy standardizált LTA protokoll csökkentheti-e a variációt (agonista koncentrációnként) általában az egészséges önkéntesek maximális aggregációjának elemzésével.

Annak vizsgálata, hogy az LTA-ra vonatkozó szabványosított protokoll használata csökkentheti-e a variációt öt kórházban, amelyek mind a standardizáció előtt, mind után vettek részt az egészséges önkéntesek maximális aggregációjának elemzésével.

Az agonista koncentrációnkénti nemzeti referenciaértékek kiszámítása az összes egészséges önkéntes eredményének felhasználásával a standardizálás után.

Anyagok és metódusok

Résztvevő laboratóriumok

Összesen 10 laboratórium (együttesen 129 egészséges alany) vett részt a felmérésben 2013-ban (a szabványosítás előtt), és 11 laboratórium (134 egészséges alany) 2016-ban (a szabványosítás után). Öt laboratórium vett részt a szabványosítás előtt és után. A résztvevők részleteit az I. táblázat foglalja össze.

Online közzététel:

I. táblázat: A holland laboratóriumok száma, akik részt vettek ebben a felmérésben a standardizált LTA protokoll bevezetése előtt és után, beleértve az aggregometriához használt műszereket.

Egészséges alanyok

Egészséges önkénteseket név nélkül (életkor vagy nem nyilvántartásba vétele nélkül) vontak be, a gyógyszerek szedésének egyetlen kizárási kritériuma, amelyekről ismert, hogy zavarják a vérlemezkék működését. A mintavétel előtt információkat rögzítettek a böjtről, az étrendről és egy könnyű étkezésről. Citrált vért vettünk egészséges önkéntesektől a helyi venepunkciós eljárás, a CCKL/ISO-15189 irányelvek és a WMA Helsinki Nyilatkozat szerint.

Hangszerek

A legtöbb laboratórium egy típusú műszert használt az LTA-hoz, vagy a Chrono-Log Corporation (Haverston, PA, USA), az APACT (LABiTec, Ahrensburg, Németország), a PAP-8 (Biodata Corporation, Horsham, PA, USA) vagy az Aggram (Helena) eszközökkel. BioSciences, Európa).

A résztvevőnkénti eszköz típusát az I. táblázat mutatja.

A 2013-as szabványosítás előtt minden részt vevő laboratórium a helyi protokollját használta az LTA számára, amelyet itt nem határozunk meg. Összességében 10 különböző eljárást alkalmaztak az LTA-ra a hollandiai 10 laboratóriumban a szabványosítás előtt.

A reagenskoncentrációk változatosságát 2013-ban (a standardizálás előtt) és a rögzített koncentrációkat a 2016-os standardizálás után a II. Táblázat foglalja össze.

Online közzététel:

II. Táblázat Agonisták koncentrációi a (2013) és a (2016) standardizálás előtt.

2016-ban jóváhagyták a Cattaneo és munkatársai szerint az SSC-ISTH protokollon alapuló nemzeti VHL-protokollt [18]. A protokoll a vérvétel és a minta előkészítés, a centrifuga beállítások, az aggregometriás eszközök és a beállítások előtti analitikai változókat írja le, amelyeket az S1 és S2 kiegészítő táblázat foglal össze.

A használt reagens márkákat 2013-ban nem rögzítették, és a 2016-ban használt reagenseket az S3 kiegészítő táblázat foglalja össze.

Statisztika

Az adatokat anonimizáltuk, mielőtt az adatbázisba importálták volna, és a GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software) segítségével elemezték őket. Az egészséges (nem normálisan elosztott) alanyok LTA-eredményeinek 2013 és 2016 közötti különbségeit szignifikancia szempontjából teszteltük nem-parametrikus Mann – Whitney U-próbával. A referencia intervallumokat (95% -os intervallum, normál eloszlás) paraméter-analízissel határoztuk meg EP-kiértékelő (Data Innovations LLC) alkalmazásával.

Eredmények

Az egészséges önkéntesek maximális összesítésének általános változása a standardizált LTA protokoll bevezetése előtt és után

Az 1a-i. Ábra az ADP, a kollagén, a ristocetin, az epinefrin és az arachidonsav különböző koncentrációjú maximális vérlemezke-aggregációjának változásának megfigyelését mutatja be egészséges önkéntesekben a különböző analizátorok alkalmazásával végzett standardizálás előtt és után. A 0,5–2,5 μM ADP-koncentrációk (1a. Ábra) az összes műszerrel mérve általában magas variációs koefficienseket (CV) mutatnak a maximális összesítésben, 5% és 107% között. Szabványosított protokoll (2 μM ADP) használata nem csökkenti a CV-t. A legkisebb eltérés a standardizálás előtt figyelhető meg, ha valamivel magasabb, 2,5 μM ADP-koncentrációt alkalmazunk. Az 1b, c ábra azt mutatja, hogy az emelkedő ADP-koncentrációk (5 vagy 10 µM) a standardizálás előtt vagy után minden különbség nélkül csökkentik a CV-t. A közbenső vagy magas ADP-koncentrációk alig mutatnak változékonyságot a különböző elemzők között a maximális aggregációs tartományok tekintetében.

Online közzététel:

1.ábra. Változások az egészséges önkéntesek különböző analizátorokon végzett LTA eredményeiben a standardizálás előtt és után. A grafikonok a műszer típusát (a: Chronolog, b: PAP8, c: APACT, d: AggRAM), a laboratórium számát és a variációs együtthatót (CV,%) mutatják maximális összesítésben az egészséges alanyok PRP stimulálása után: a) 0,5 –2,5 µM ADP alacsony tartomány, b) 4–5 µM ADP közbenső tartomány, c) 10–20 µM ADP magas tartomány, d) 0,2–2 µg/ml kollagén alacsony tartomány, e) 4–10 µg/ml kollagén magas tartomány, f) 0,25–0,6 mg/ml ristocetin alacsony tartomány, g) 1,0–1,5 mg/ml ristocetin magas tartomány, h) 5 µM epinefrin, i) 0,5–1,6 mM arachidonsav. Az eredményeket a maximális összesítés% -ában fejezzük ki.

1.ábra. Változások az egészséges önkéntesek különböző analizátorokon végzett LTA eredményeiben a standardizálás előtt és után. A grafikonok a műszer típusát (a: Chronolog, b: PAP8, c: APACT, d: AggRAM), a laboratórium számát és a variációs együtthatót (CV,%) mutatják maximális összesítésben az egészséges alanyok PRP stimulálása után: a) 0,5 –2,5 µM ADP alacsony tartomány, b) 4–5 µM ADP közbenső tartomány, c) 10–20 µM ADP magas tartomány, d) 0,2–2 µg/ml kollagén alacsony tartomány, e) 4–10 µg/ml kollagén magas tartomány, f) 0,25–0,6 mg/ml ristocetin alacsony tartomány, g) 1,0–1,5 mg/ml ristocetin magas tartomány, h) 5 µM epinefrin, i) 0,5–1,6 mM arachidonsav. Az eredményeket a maximális összesítés% -ában fejezzük ki.

Online közzététel:

1. ábra folytatódott

1. ábra folytatódott

Nagyjából azonos hatás figyelhető meg a kollagén esetében. A 2013-as standardizálás előtt az alacsony kollagénkoncentrációk (0,2–2 μg/ml) nagyobb eltérést mutatnak az egészséges önkéntesek maximális aggregációs eredményeiben, összehasonlítva a magas kollagénkoncentrációval (4–10 μg/ml) mind a Chronolog, mind az APACT eszközökön (1d. Ábra, e). A 2016-os standardizálást követően az alacsony kollagénkoncentrációk (1-2 μg/ml) az összes eszköz maximális aggregációjában kevésbé változékonyak, mint a 2013-as LTA-eredmények (1d. Ábra). A rögzített, magas, 5 μg/ml kollagén koncentráció nagyjából ugyanazt a változást mutatja a standardizálás előtt és után (1e. Ábra). Ahogy az várható volt, a ristocetin alacsony koncentrációja nagyon alacsony maximális aggregációs válaszokat eredményezett néhány kiugró értékkel (1F ábra). A szabványosítási eljárás nem befolyásolja ezeket az eredményeket. A magasabb ristocetin-koncentrációk 3 és 19% közötti CV-tartományt mutatnak a standardizálás előtt és 3–22% után a standardizálás után (1g. Ábra). 5 µM epinefrin esetében a CV a standardizálás előtt alacsonyabb (1h ábra). Végül az arachidonsav LTA eredményei viszonylag stabilak a különböző műszerek között a standardizálás előtt és után (1i. Ábra).

Megfigyelési változások az LTA eredményekben öt olyan kórházi laboratóriumban, amelyek a szabványosítás előtt és után egyaránt részt vettek

A 2a. Ábra szemlélteti az ADA közbenső adagokkal történő LTA-standardizálásának következményeit öt olyan kórházi laboratóriumban, amelyek mindkét felmérésben részt vettek. A 2. és 6. kórházi laboratórium maximális aggregációjának változása nem mutat nyilvánvaló változást 2013 és 2016 között. A standardizálás egyértelműen növeli a maximális aggregáció variációját az ADP közbenső koncentrációival a 7. kórházban. Ezzel szemben a variabilitás mind a 8., mind a 9. kórházban csökken. A 2b. ábra az alacsony kolagénkoncentrációjú LTA-standardizálás eredményeit mutatja be ugyanazon öt kórház esetében. A standardizálás nyilvánvalóan csökkenti a maximális aggregáció variációját alacsony kollagén dózisokkal az 5 kórházi laboratóriumban 4-ben.

Online közzététel:

2. ábra. A szabványosítás következménye öt olyan kórházban, akik részt vettek a szabványosítás előtt és után. A diagramok a maximális aggregáció változását mutatják az egészséges alanyok PRP-jének stimulálása után a) 4-5 µM ADP-vel vagy b) 1-2 µg/ml kollagénnel. Az eredményeket a maximális összesítés% -ában fejezzük ki.

2. ábra. A szabványosítás következménye öt olyan kórházban, akik részt vettek a szabványosítás előtt és után. A diagramok a maximális aggregáció változását mutatják az egészséges alanyok PRP-jének stimulálása után a) 4-5 µM ADP-vel vagy b) 1-2 µg/ml kollagénnel. Az eredményeket a maximális összesítés% -ában fejezzük ki.

Az általános referencia tartományok meghatározása

Minden agonista esetében a maximális aggregáció százalékában kifejezett referencia intervallumokat (95% konfidencia intervallum, normál eloszlás) becsültük meg az összes egészséges kontroll LTA adatainak felhasználásával (III. Táblázat). Az egyes agonista válaszok esetében a vizsgált minták száma 42 és 107 között változott.

Online közzététel:

III. Táblázat LTA referencia intervallumok (95% konfidencia intervallum, normálisan elosztva) az agonista koncentrációnkénti maximális aggregáció% -ának standardizálása után.

Az ADP alacsony koncentrációira (2 μM) adott maximális aggregációs válasz egészséges önkéntesekben az eredmények nagyon széles skáláját mutatja (III. Táblázat). Az ADP közepes (5 μM) és magas (10 μM) koncentrációja esetén azonban kisebb változékonyságot tapasztaltunk. Ez a kollagén és a ristocetin, az epinefrin és az arachidonsav alacsony és nagy dózisainak is köszönhető (III. Táblázat).

Vita

Napjainkban az LTA továbbra is a klinikai laboratóriumokban alkalmazott leggyakoribb módszer a vérlemezkék működésének felmérésére, és a thrombocytopathia kimutatásának arany standard módszerének számít [23 - 26]. Ennek a módszernek (pre) analitikai vonatkozásait azonban még nem szabványosították világszerte [15–17], annak ellenére, hogy a nemzeti vagy nemzetközi irányelvek kidolgozásában részt vevő szakértők különféle erőfeszítéseket tettek [18–22]. Új technikákat fejlesztenek ki, pl. teljes vér áramlási citometria [12, 27]. Továbbá ígéretes eredményeket érnek el vérlemezke-aggregációs vizsgálatokkal áramlási körülmények között [28]. Ezen új módszerek előnyei a teljes vér alkalmazása és az alacsony minta-előkészítés, de ehhez képzett technikusokra és speciális felszerelésekre is szükség van [29–34]. Hasonlóképpen, itt is elengedhetetlen a hagyományos LTA módszer szabványosítása.

Az ADP-vel ellentétben az alacsony kollagén dózisok az LTA eredmények variációjának javulását mutatták a standardizálás után. Feltehetően ennek az az oka, hogy nem minden laboratórium használta ugyanazt a kollagénkészítményt a 2013-as standardizálás előtt. A szarvasmarha és a ló kollagénkészítményei közötti különbségeket az LTA-ban már korábban leírták, és ez varianciaforrás lehet [37]. Hasonlóképpen, az arachidonsav kisebb variációt mutatott a maximális aggregációs eredményekben a standardizálás után. Ez nem magyarázható. Az adrenalin esetében nem figyeltek meg szignifikáns standardizációs hatást.

A standardizálás előnyei az egyes laboratóriumok számára jelen voltak, de változóak. Az ADP fix koncentrációjának alkalmazása többnyire nem volt hatással, és a kórházak többségében nem csökkent a variáció. Általában a standardizálást követően kisebb volt az LTA-eredmények változása fix kollagénkoncentráció mellett. Összefoglalva, a variáció nem csökkent egyértelműen a standardizálás után, feltételezve, hogy a protokoll betartása fennáll.

Egy lehetséges magyarázat arra a tényre, hogy általában alacsony a variáció csökkenése a szabványosítás után, a nem kiigazított PRP bevezetésének lehet a hatása, ami a laboratóriumok számára a standardizálást követően jelentős változás volt. A PRP hígítása a vérlemezkék gyenge plazmájával a vérlemezkeszám beállításához artefaktumokat hoz létre, amint azt Cattaneo és mtsai javasolják. és kerülni kell, mert artefaktikusan gátolja a vérlemezke aggregációt [18, 38]. Ezenkívül nagyobb eltérésekhez is vezethet, mivel a vérlemezkeszám különböző a PRP-ben [39, 40]. A nem korrigált PRP-vel való munkavégzés azonban eltérést eredményezhet az egészséges önkéntesek között is. Egy másik tanulmány azt mutatja, hogy a vérlemezkeszám-korrigált PRP-vel rendelkező LTA a vérzéses rendellenességek kimutatásában felülmúlja a natív PRP-t, bár az előny kicsi, és nem biztos, hogy klinikailag szignifikáns [41]. Másrészt Althaus et al. [36] nem korrigált PRP-t is használt, és alacsonyabb CV-t tett közzé egészséges PRP-kben eredményeinkhez képest.

Vizsgálatunk korlátja, hogy az egészséges kontroll alanyok eltérnek 2013-ban (a standardizálás előtt) és 2016-ban (a standardizálás után). Továbbá korlátozott adatok állnak rendelkezésre egyes agonistákról, pl. kórházanként kevesebb mint 10 donor. Ez kutatásunkat nagyrészt megfigyeléssé teszi. Csak egészséges önkénteseket vizsgáltunk, és nem trombocitopátiás betegeket. A szabványosítás előnyei ennél a célcsoportnál nagyobbak lehetnek; vérzési rendellenességgel gyanús beteg.

A CLSI irányelv legalább 120 normál alanyra vonatkozik a referencia intervallumok megállapításához. Egy olyan technika esetében, mint az LTA, ez drága, munkaigényes és nem kivitelezhető az egyes laboratóriumok számára. A III. Táblázatban javasolt tartományok útmutatást adhatnak a laboratóriumok számára és irányítói. Minden laboratóriumnak el kell döntenie és igazolnia kell, hogy felhasználhatja-e ezeket az értékeket a napi betegellátásban.

Összességében megállapításaink azt illusztrálják, hogy az LTA eljárások szabványosítása nem szükségszerűen vezet kisebb eltérésekhez, különösen alacsony agonista koncentrációk esetén. A legtöbb agonista koncentráció (közepes és magas ADP, alacsony és magas kollagén, alacsony és magas ristocetin, epinefrin és arachidonsav) változékonysága egészséges egyénekben csökkent. A VHL továbbra is arra ösztönzi az összes LTA-felhasználót, hogy tartsa be az új irányelvet.

I. táblázat: A holland laboratóriumok száma, akik részt vettek ebben a felmérésben a standardizált LTA protokoll bevezetése előtt és után, beleértve az aggregometriához használt műszereket.