Azonosítás Mycobacterium tuberculosis leucil-tRNS-szintetáz (LeuRS) inhibitorok az 5-fenilamino-2H- [1,2,4] triazin-3-on származékai között

Rövid kommunikáció

  • Teljes cikk
  • Ábrák és adatok
  • Hivatkozások
  • Idézetek
  • Metrikák
  • Újranyomtatások és engedélyek
  • PDF

Absztrakt

Az antibiotikum-rezisztencia növekedése Mycobacterium tuberculosis törzsek váltak a modern orvoslás egyik legsürgetőbb problémájává. Ezért az antibiotikumok keresése az ellen M. tuberculosis újszerű hatásmechanizmusokkal nagyon fontos. Meghatároztuk a M. tuberculosis leucil-tRNS-szintetáz (LeuRS) az 5-fenilamino-2H- [1,2,4] triazin-3-on származékai között. A legaktívabb vegyületek: 5- (5-klór-2-hidroxi-fenilamino) -6-metil-2H- [1,2,4] triazin-3-on és 5- (5-klór-2-hidroxi-fenilamino) -2H- [1,2,4] triazin-3-on gátolja M. tuberculosis LeuRS IC50-értékével 7,6 μМ, illetve 7,2 μМ-rel. Megállapítást nyert, hogy a vegyületek gátló aktivitása a patogén LeuRS ellen tízszer jobb, mint az emberi enzim esetében.

tuberculosis

Bevezetés

Mycobacterium tuberculosis a fertőzés továbbra is a globális halálozás és morbiditás egyik fő oka. A hatékony kezelés rendelkezésre állása ellenére a tuberkulózis elleni gyógyszerek egyre kevésbé hatékonyak, és mellékhatásokkal társulnak, amelyek korlátozzák használatukat, különösen multirezisztens (MDR) és kiterjedt gyógyszerrezisztens (XDR) betegeknél. A rifampicinnel és izoniaziddal szembeni rezisztenciát MDR tuberkulózisnak nevezik. A fluorokinolonok kulcsfontosságú másodvonalas tuberkulózisellenes gyógyszerek, amelyeket általában az MDR tuberkulózis kezelésében alkalmaznak. Ezért a fluorokinolonokkal szembeni rezisztencia M. tuberculosis növeli az XDR tuberkulózis kialakulásának esélyét. Ez a helyzet ösztönzi a különböző hatásmódú új antibiotikumok kifejlesztését. Az amino-acil-tRNS-szintetázok (aaRS-ek) ígéretes fertőzésellenes gyógyszer-célpontok. Ezek az enzimek kulcsfontosságú szerepet játszanak a fehérjeszintézisben, és nagy evolúciós divergenciával rendelkeznek a prokariótákban és az eukariótákban, amelyek lehetővé teszik az 1–6. Szelektív aaRS-inhibitorok kifejlesztését. .

Például a leucil-tRNS-szintetázt (LeuRS) vonzó terápiás célpontként validálták. Korábban kimutatták, hogy a gombaellenes 5-fluor-1,3-dihidro-1-hidroxi-2,1-benzoxaborol (AN2690, amely 2014 júliusában FDA jóváhagyást kapott az onychomycosis helyi kezelésére) gátolja az élesztő citoplazmatikus LeuRS 7-et. A ZCL039 vegyületről, az AN2690 benzoxaborol-alapú származékáról számoltak be, mint erős antipneumococcus szerről, amely gátolja Streptococcus tüdőgyulladás LeuRS-tevékenység 8. Ding és mtsai. hatékonynak fedezték fel Trypanosoma brucei LeuRS-gátlók 9. Nemrégiben találtuk a Mycobacterium tuberculosis LeuRS az N-benzilidén-N'-tiazol-2-il-hidrazin 10 származékai között. A kutatás fő célja a kismolekulák új gátlóinak azonosítása M. tuberculosis LeuRS.

Mód

Receptor előkészítés a rugalmas dokkoláshoz

Homológiai modellje Mycobacterium tuberculosis A LeuRS a SWISS-MODEL 11 munkaterület felhasználásával készült. A kristályszerkezet Thermus thermophilus LeuRS-t (PDB ID: 2V0C) 7 alkalmaztunk sablonként a homológiai modellezéshez.

A receptormolekulát a vízben minimalizálták GROMACS molekuladinamikai szimulációs csomaggal (GROMACS erőtér, legmeredekebb leereszkedési algoritmus, 1000 lépés, em_tolerancia = 100, em_step = 0,001). A receptor molekula parciális atomtöltéseit az Amber erőtérből vettük. Az aktív helyszférákat a DOCK segítségével számoltuk ki sphgen szoftver. A LeuRS aktív webhelyén kívüli pozícióval rendelkező gömböket manuálisan törölték. A Connolly MS és Grid programokat a DOCK csomagból használtuk fel a Connolly receptor felszíni és energiahálózatok előállításához. A felületi és rácsszámításokat a 12. referenciában részletezett paraméterbeállításokkal végeztük. A rács távolságát 0,3-ra állítottuk.

Ligand adatbázis feldolgozás

A ligandum geometriájának kiszámítását a 13. referenciában leírt YFF erőtér alkalmazásával végeztük. A ligandumok részleges atomtöltetét Kirchhoff 14. módszerrel számoltuk .

Rugalmas dokkolás

Megtisztítása Mycobacterium tuberculosis LeuRS

A gént kódoló pET28a plazmid M. tuberculosis LeuRS-t (a plazmidot Stephen Cusack és Andres Palencia kedves ajándéka volt) alkalmaztuk a fehérje E. coli Rosetta törzs (DE3). Egyetlen telepet alkalmaztunk 50 mg/l kanamicint és 36 mg/l kloramfenikolt tartalmazó LB táptalaj beoltására, amelyet éjszakán át 37 ° C-on inkubáltunk. A tenyészetet 1 mM IPTG végkoncentrációra indukáltuk, és 7 órán át 23 ° C-on inkubáltuk. A sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze.

A sejtek üledékét 20-25 ml pufferban szuszpendáltuk, amely 20 mM Tris-HCl-ot (pH 8,0), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM β-merkaptoetanolt és 1 tabletta komplett EDTA-mentes proteáz koktél inhibitorokat tartalmazott. 10 percig ultrahanggal kezeltük (összesen) 30 s aktív ciklus és 60 s lehűlés közben. A lizátumot centrifugálással tisztítottuk 30 percig 16 000 fordulat/perc sebességgel. Az imidazolt a felülúszóhoz adtuk, hogy végül 15 mM legyen, és 5 ml Ni-NTA-val összekevertük A kötőpufferben (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 15 mM imidazol, 1 m mM β-merkaptoetanol, 0,1 mM PMSF). Az elegyet 1 órán át 4 ° C-on kevertük, és az üres oszlopba helyeztük. Az oszlopot 15 ml B pufferrel (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,3 M NaCl, 5 mM MgCl2, 15 mM imidazol, 1 mM P-merkaptoetanol, 0,1 mM PMSF) mostuk. A fehérje eluálását E pufferrel (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,3 M NaCl, 5 mM MgCl2, 0,2 M imidazol, 5 mM P-merkaptoetanol, 0,1 mM PMSF) végeztük. A fehérje homogenitását 12,5% SDS-PAGE alkalmazásával teszteltük. A frakciókat egyesítjük és 2 órán át dializáljuk 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 és 5 mM merkaptoetanol elegyével, és egy éjszakán át 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaCl oldattal tartjuk., 5 mM MgCl2 és 5 mM merkaptoetanol. A tisztított fehérjét Centricon-30 (Amicon, Miami, FL) alkalmazásával betöményítettük.

Az emberi citoplazmatikus LeuRS tisztítása

Aminoacilációs vizsgálat

A standard aminoacilezési vizsgálatokat 100 mM Tris-HCl-ban (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 5 mM ATP, 10 mM KCl, 90 μM [14C] -L-leucin (238 mCi/mmol), 4 mólos oldatban végeztük. mg/ml E. coli tRNS és 25 nM M. tuberculosis LeuRS. A reakcióelegyet 37 ° C-on inkubáltuk; az alikvot részeket 10% -os triklór-ecetsavval leállítottuk; és a tRNS aminoacilezésének szintjét szcintillációs számlálással határoztuk meg.

Az aminoacilezési reakció gátló vizsgálataihoz 20 μl oldat, amely 25 nM-ot tartalmaz M. tuberculosis LeuRS, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 90 μM [14C] -L-leucin (238 mCi/mmol), 2 mM DTT, 4 mg/ml E. coli A tRNS-t és az inhibitor megfelelő koncentrációit (DMSO-ban oldva) 5 percig inkubáltuk 37 ° C-on. A reakciókat ATP hozzáadásával indítottuk 2 mM végkoncentrációig. Legalább három példányt átlagoltunk IC50-érték előállítására az Origin 7.0 alkalmazásával.

Eredmények és vita

Az új LeuRS-gátlókat a kereskedelemben kapható, több mint 100 000 különféle kicsi szerves vegyületet tartalmazó vegyületkönyvtár receptor-alapú virtuális szűrésével azonosították 16. A legjobban elért vegyületek közül a fenilamino-triazin egy származékát választotta ki a dokkoló motor. In vitro tesztek azt mutatták, hogy az 5- (2-hidroxi-5-metil-fenilamino) -6-metil-2H- [1,2,4] triazin-3-on vegyület csökkenti a vegyületek aminoacilezési aktivitását. M. tuberculosis LeuRS. A reziduális aktivitás M. tuberculosis A LeuRS vegyület jelenlétében 100 μM-nál 46% volt.

A számítógépes szimulációnak megfelelően ez a vegyület kölcsönhatásba lép a Gly108, His109, Leu111, Gly112, Tyr113, Gln714, Gly715, Tyr716 és Ile717 aminosavmaradékokkal a LeuRS aktív helyének leucilkötő régiójában, és hidrogénkötést képez a Gln714 aminocsoportjával (ábra 1).