Kínai gyógynövények potenciális lipáz inhibitorai

Kutatási cikk

Teljes cikk
Ábrák és adatok
Hivatkozások
Idézetek
Metrikák
Újranyomtatások és engedélyek
PDF

Absztrakt

Kontextus: Az elhízás komoly egészségügyi problémává vált, és mind a személyes, mind a gazdasági terheket rója a világ lakosságára. A hagyományos kínai gyógynövények gazdag ólomvegyületek, és lehetséges gyógyszerjelöltek, amelyek felhasználhatók ennek az állapotnak a kezelésére.

Célkitűzés: Ez a tanulmány a hagyományos kínai gyógynövényekben megtalálható erős hasnyálmirigy-lipáz-inhibitorokat vizsgálta az elhízás kezelésére.

Anyagok és metódusok: Sertés hasnyálmirigy-lipáz gátlási vizsgálatot hoztak létre, és 35 hagyományos kínai gyógynövény gátló aktivitását 200 μg/ml koncentrációban értékelték. Az erős lipázgátló aktivitású gyógynövénykivonatok két elúcióját preparatív nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával tovább frakcionáltuk, mindegyik 22 részfrakcióvá, és ezeket az alfrakciókat teszteltük anti-lipáz aktivitás szempontjából. Azokat a részfrakciókat, amelyek erős lipáz-gátló aktivitást mutattak, folyamatosan frakcionáltak egyedi vegyületekké. Végül két, aktív anti-lipáz aktivitással rendelkező hatóanyagot izoláltunk, és két hagyományos kínai gyógynövényből azonosítottunk.

Eredmények: 35 hagyományos kínai gyógynövény közül a 95% -os etanol-eluálás Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (Araliaceae) és Magnolia officinalis Rehd. et Wils (Magnoliaceae) erős anti-lipáz aktivitást mutatott. Két vegyület, köztük 20 (S) -ginsenozid Rg3-at és honokiolt azonosítottunk bioaktivitás-vezérelt izolációval, IC50 = 33,7, illetve 59,4 μg/ml.

Következtetés: 20 (S) -ginsenozid Rg3 és honokiol alkalmas lehet az elhízás kezelésére.

Bevezetés

Az elhízás világszerte komoly közegészségügyi problémává vált (Stevens et al. 2012). Az elhízás nemcsak betegségeket és más fájdalmas állapotokat okoz, például hiperlipidémiát, magas vérnyomást, arterioszklerózist, nem inzulinfüggő cukorbetegséget és szívkoszorúér betegségeket (Jung 1997; Kopelman 2000), hanem óriási gazdasági terhet ró az egyénekre és a társadalomra is. 2005-ben csak az Egyesült Államokban mintegy 190 milliárdot költöttek az elhízással kapcsolatos egészségügyi ellátásokra (Lehnert et al. 2013). Az orvosi költségek drámaian megnőttek, és tovább növekedhetnek (Wang et al. 2008; Mora et al. 2015). Ezen közvetlen kiadások mellett az elhízás a termelékenység csökkenését is okozza (Trogdon et al. 2008). Az elhízás elleni új gyógyszerek kutatása és fejlesztése nemrégiben felhívta a figyelmet mind a gyógyszeripar, mind az akadémiai kutatóközpontok részéről.

Az elhízás magában foglalja a túlzott testzsír felhalmozódását (Hill és mtsai 2000). Az alanyokat magas zsírtartalmú étrenddel etették, és ezekből a zsírokból triacilglicerineket bontottak le, amelyeket a lipáz lebontott és a bélsejtek felszívtak (Shi & Burn 2004). Az emésztési folyamatban a hasnyálmirigy-lipáz kulcsfontosságú lipideket emésztő enzim (Hadvary et al. 1988). A hasnyálmirigy-lipáz gátlása az elhízás megelőzésének és kezelésének egyik módszere (Birari & Bhutani 2007). Például egy hasnyálmirigy-lipáz gátlót, az orlisztát, engedélyezte az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatala 1999-ben az elhízás kezelésére (Leung és mtsai. Bár a gyógyszer jelentős elhízás elleni hatással bír, nem elhanyagolható emésztőrendszeri mellékhatásokat is okoz (Cheung et al. 2013). Fontos több olyan hasnyálmirigy-lipáz-gátlót találni és kifejleszteni, amelyek biztonságosak és hatékonyak, és amelyek nem osztják az orlisztát hátrányait.

A hagyományos gyógynövényekből származó természetes termékeket és mikrobiális forrásokat az új kábítószer-ólom fontos forrásaként ismerik el (Molinari 2009). Az engedélyezett gyógyszerek körülbelül 50% -a természetes termékekből származik (Newman & Cragg 2007). Az elmúlt években kiderült, hogy a természetes termékek ígéretes aktivitást mutatnak a hasnyálmirigy lipáz gátlásával szemben (Birari & Bhutani 2007; de la Garza et al. 2011). Ez számos kutató érdeklődését felkeltette (Kim & Kang 2005; Sharma és mtsai 2005; Slanc és mtsai 2009; Zheng és mtsai 2010; Ramirez és mtsai 2012; Roh és Jung 2012). Erőfeszítéseik valószínűleg a hagyományos kínai gyógynövényekből származó erős hasnyálmirigy-lipáz inhibitorok azonosítását és kifejlesztését teszik életképes alternatív stratégiává az elhízás elleni biztonságos és hatékony gyógyszerek felfedezéséhez (de la Garza et al. 2011).

Ebben a tanulmányban 35 hagyományos kínai gyógynövényt választottak ki, amelyek ígéretes gátló hatást mutattak az elhízás, a hiperlipidémia vagy mind a molekuláris dokkoló elemzés, mind az irodalmi bányászat során, új ólomvegyületek és hasnyálmirigy-lipáz-gátlók felfedezéséhez biológiai vizsgálattal irányított izolációval.

Anyagok és metódusok

Növényi anyagok és vegyszerek

Az összes gyógynövényt egy Kangji gyógyszertár szállította 2013. május és június között, és azokat Dr. Zhenzhong Wang (Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd.) azonosította. Az utalványminták gyűjteménye megerősítésre rendelkezésre áll a Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd. (Lianyungang, PR Kína) kutatóközpontjában. Sertés hasnyálmirigy-lipáz (PPL) VI-S típusú és o-nitrofenilpalmitátot (PNP) a Sigma Chemicaltól (Sanghaj, Kína) szereztük be. 20 (S) -Ginsenoside Rg3-at és honokiolt a National Institute of Food and Drug Control-tól (Peking, Kína) szereztük be. A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás minőségű (HPLC) acetonitrilt a Tedia (Anhui, Kína) biztosította. Az összes többi vegyszer és oldószer analitikai minőségű volt.

Minták előkészítése

Az összes gyógynövényt levegőn szárítottuk és finom porrá őröltük. Az 50 g porokat kétszer, 2 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk desztillált vízzel (térfogat 10-szerese). Szűrés után a vizes kivonatot HP-20 makropórusos gyantára (100 ml) adszorbeáltuk (Diaion HP-20, Mitsubishi Chemical Ind. Ltd., Tokió, Japán). Ezután a HP-20 oszlopot vízzel (400 ml), 20% etanollal (400 ml), 40% etanollal (400 ml), 95% etanollal (400 ml) mostuk egymás után. Ezután az oldatokat rotációs vákuum-bepárlón szárítottuk 50 ° C-on. A mintákat a további vizsgálatokhoz száraz körülmények között tároltuk.

Az etanol 95% -os eluálása Magnolia officinalis Rehd. et Wils (Magnoliaceae) és Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen-t (Araliaceae) preparatív HPLC-vel frakcionáltuk (több hullámhosszú detektorral és Fuji-C-18 oszloppal felszerelt Agilent 1260). A mozgófázis 30 ml/perc áramlási sebességű vízből (A) és acetonitrilből (B) állt: 20-30% B 0–20 percnél; 30–45% B 20–40 percnél; 45–90% B 40–55 percnél; 90–100% B 55–60 percnél; 100% B 60–70 percnél. A detektálási hullámhosszt 210 nm-en állítottuk be. Az alfrakciókat 3 percenként összegyűjtjük és csökkentett nyomáson végzett desztillációval bepároljuk. Ezután az alfrakciókat liofilizáltuk és szobahőmérsékleten tároltuk.

PPL gátlási teszt

A lipáz aktivitást PNP-vel szubsztrátként mértük (Winkler & Stuckmann 1979; Lee és mtsai 1993). PPL törzsoldatot (1,2 mg/ml) készítettünk 50 mM Tris-HCl pufferben (pH = 8,0) (0,2% nátrium-deoxi-koláttal és 0,1% gumiarábikummal kombinálva). Ezt a keveréket alikvotizáltuk és -70 ° C-on tároltuk. A PNP-t izopropanolban oldjuk 25 mM törzsoldatban, és 4 ° C-on tároljuk. A lipáz elleni gátló aktivitás meghatározásához a mintákat és a vegyületeket az enzimmel (5 μg/ml) 10 percig inkubáltuk Tris-HCl pufferben, 37 ° C-on. A reakciót ezután 0,1 ml PNP (0,5 mM) hozzáadásával indítottuk el. A végső térfogat 0,2 ml volt. 60 percig 37 ° C-on végzett inkubálás után az abszorbanciát 405 nm-en mértük mikrolemez-olvasóval (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

A gátlási arányt a következő képlet segítségével számítottuk ki (Zheng et al. 2010):

Itt A az aktivitás az inhibitor hiányában; a a negatív kontroll inhibitor hiányában; B az aktivitás az inhibitor jelenlétében; és b a negatív kontroll az inhibitor jelenlétében.

HPLC (LC-DAD/Q-TOF/MS) elemzés

Diódasoros detektorral és minőségi Time-of-Flight 6538 tömegspektrométerrel felszerelt Agilent 1290 HPLC-t (Santa Clara, Kalifornia) alkalmaztunk. A kromatográfiás elválasztást Phenomenex Luna C18 oszlopon (Torrance, Kalifornia) végeztük a Magnolia officinalis (MO-19) és a 17. részrésze Panax notoginseng (PN-17). A mozgófázist víz (A) és acetonitril (B) alkotta. A gradiens eluálást a következőképpen hajtottuk végre: 0–25 perc, 30–35% B; 25–55 perc, B 35–50%; 55–80 perc, 50–90% B 1 ml/perc áramlási sebességgel a MO-19 esetében; 0–30 perc, 35–50% B; 30–35 perc, 50% B; és 35–50 perc, 50–90% B 1 ml/perc áramlási sebességgel a PN-17 esetében. A detektálási hullámhosszakat 230, illetve 210 nm-en állítottuk be MO-19, illetve PN-17 esetében. Az MS kimutatásához a paramétereket a következőképpen állítottuk be: oszlop kemence hőmérséklete, 30 ° C; ütközésgáz, rendkívül nagy tisztaságú hélium; porlasztó gáz, nagy tisztaságú nitrogén; kapilláris feszültség, 4000 V; szárítógáz áramlási sebessége, 10 l/perc; a gáz hőmérséklete 350 ° C; a porlasztó nyomása, 50 psi; skimmer feszültség, 65 V; és fragmensfeszültség, 100 V. A tömegtartományt beállítottuk m/z 100–3200 Da. Minden mintát pozitív módokban elemeztünk annak szerkezetének meghatározásához.

Statisztikai analízis

Valamennyi eredményt átlag ± szórásként fejezzük ki (n = 3). A kontrolltól való eltérések jelentőségét Duncan-teszt és Kruskal – Wallis-teszt, valamint o Kínai gyógynövények potenciális lipáz inhibitorai

Online közzététel:

1. táblázat: Különböző kínai gyógynövények PPL-gátló aktivitása.

Alcsoportjainak anti-lipáz aktivitása Panax notoginseng és Magnolia officinalis

Mindkét Panax notoginseng és Magnolia officinalis erős anti-lipáz aktivitást mutatott. 22% alfrakció a 95% etanol elúciójából Panax notoginseng és Magnolia officinalis Ezután preparatív HPLC-vel készítettük. Az alfrakciók gátló aktivitását hasnyálmirigy lipázon vizsgáltuk. Amint az az 1. ábrán látható, a PN-17 Panax notoginseng ezen 22 alfrakció közül a legerősebb anti-lipáz aktivitást mutatta, és ennek MO-19-ét Magnolia officinalis a 22 alfrakció közül a legerősebb anti-lipáz aktivitást mutatta.

Online közzététel:

1. ábra 22-ből származó alfrakció PPL-gátló aktivitása Panax notoginseng és Magnolia officinalis. Három mérést hajtottunk végre frakciónként. Az adatokat átlag ± szórásként fejeztük ki (n = 3). Az alfrakciók végső koncentrációja 200 μg/ml volt.

1. ábra 22-ből származó alfrakciók PPL-gátló aktivitása Panax notoginseng és Magnolia officinalis. Három mérést hajtottunk végre frakciónként. Az adatokat átlag ± szórásként fejeztük ki (n = 3). Az alfrakciók végső koncentrációja 200 μg/ml volt.

A hatóanyagok azonosítása

A PN-17-et és az MO-19-et LC-DAD/Q-TOF/MS elválasztotta (2. (a) és 3. (a) ábra). Összehasonlítottuk a referenciaanyagok retenciós idejét, a PN-17 három csúcsát a ginsenozid Rh4, 20 (S) -ginsenozid Rg3 és 20 (R) -ginsenozid Rg3 (Yao és mtsai 2011; Kim és mtsai 2013), és az MO-19 egyetlen csúcsát a honokiolnak tulajdonították (Lee és mtsai 2011). Identitásukat ezután tömegspektrometriával igazolták (2. táblázat). A vegyületaktivitások elemzésének eredménye azt is sugallta, hogy a PN-17 három csúcsa közül a második csúcsnak volt a legerősebb anti-lipáz hatása (2. ábra (b)). A dózis-válasz görbe 20 (S) -ginsenozid Rg3 és honokiol kimutatta, hogy a két vegyület erős hasnyálmirigy-lipáz inhibitor (2. (c) és 3. (c) ábra).

Online közzététel:

2. ábra: 20 (S) -ginsenozid Rg3 PPL-gátló aktivitása. (a) Az (A) referenciaanyag (S) -ginsenozid Rg3, (B) PN-17 keverékrész frakcióinak kromatogramjai, beleértve (1) Rh4 ginsenozidot, (2) 20 (S) -ginsenozid Rg3, (3) 20 (R) -ginsenozid Rg3 210 nm-en. (b) A PN-17 három vegyületének PPL-gátló aktivitása. Három vegyületkomponens végső koncentrációja 50 μg/ml volt. (c) A PPL koncentrációfüggő gátlása 20 (S) -ginsenozid Rg3 által. A gátlási sebességet a 20 (S) -ginsenozid Rg3 (átlag ± SD, n = 3).

Online közzététel:

3. ábra: A honokiol PPL-gátló aktivitása. a) Honokiol (A) referenciaanyag (B) MO-19 részfrakció kromatogramjai 230 nm-en. b) A honokiol szerkezete. (c) A PPL koncentrációtól függő gátlása honokiollal. A gátlási sebességet a honokiol kumulatív dózisainak logaritmusához viszonyítottuk (átlag ± SD, n = 3).

3. ábra: A honokiol PPL-gátló aktivitása. a) Honokiol (A) referenciaanyag, (B) MO-19 részfrakció kromatogramjai 230 nm-en. b) A honokiol szerkezete. (c) A PPL koncentrációtól függő gátlása honokiollal. A gátlási sebességet a honokiol kumulatív dózisainak logaritmusához viszonyítottuk (átlag ± SD, n = 3).

Online közzététel:

2. táblázat: PN-17-2 és MO-19 ESI tömegelemzése.

Vita

A természetes termékek kémiai szerkezete és biológiai aktivitása rendkívül változatos. Fontos ólomvegyületek voltak a gyógyszer felfedezésében (Xie és mtsai 2012; Tsai és mtsai 2013; Deng és mtsai 2014; Zhou és mtsai 2014). A vizsgálat célja a hagyományos kínai gyógynövényekből származó potenciális hasnyálmirigy-lipáz-gátlók szűrése volt az elhízás elleni kezelésben. Ebben a vizsgálatban 35 gyógynövényt extraháltunk, és eluáltuk 20%, 40% és 95% etanollal. Ezután anti-lipáz aktivitásukat értékelték in vitro. Az etanol 95% -os eluálása Panax notoginseng és Magnolia officinalis erős anti-lipáz aktivitást mutatott, ezért ezeket tovább frakcionáltuk, 22-ből egyenként. Megállapították, hogy a PN-17 és MO-19 rendelkeznek a legerősebb anti-lipáz hatással. Aztán 20 (S) -ginsenozid Rg3-at és honokiolt találtak a PN-17-ben, illetve a MO-19-ben.

Magnolia officinalis beszámoltak arról, hogy számos bioaktív komponenst tartalmaz, köztük magnololt, honokiolt, 4-O-metilhonokiol és obovatol (Lee és mtsai 2011). Egy nemrégiben készült tanulmány azt jelezte Magnolia officinalis kivonat és aktív komponense, 4-O-A metil-honokiol megvédheti az egereket a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízástól a lipidanyagcsere javításával (Zhang és mtsai 2014). A jelenlegi vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy ésszerű, hogy a honokiol, egy lipáz inhibitor, lehet az elhízás elleni összetevő. Magnolia officinalis.

A jelentések kimutatták, hogy a Platycodi radix, Acanthopanax senticosus és Panax japonicus gátolhatja a hasnyálmirigy-lipázt és javíthatja a zsírtartalmú étrend okozta testtömeg-növekedést egerekben (Han és mtsai 2002; Han és mtsai 2005; Li és mtsai 2007). Egy korábbi tanulmány szerint 20 (S) -ginsenozid Rg3 gátolhatja a lipidfelhalmozódást a 3T3-L1 adipocita differenciálódása során AMPK és PPAR-γ jelátviteli utakon keresztül (Hwang et al. 2009). A jelenlegi tanulmány 20 (S) -ginsenozid Rg3 az aktív komponense Panax notoginseng hasnyálmirigy lipáz ellen. 20 együttvéve (S) -ginsenozid Rg3 alkalmas ólomvegyület lehet az elhízás kezelésére, és a lipid felszívódás és felhalmozódás csökkentésével hat (Cicero et al. 2003; Kim & Park 2003).

Két fő, értékes vegyület, 20 (S) -ginsenozid Rg3-ról és honokiolról megállapították, hogy biológiai vizsgálattal irányított izolációval anti-lipáz hatásúak. Ebben a vizsgálatban azonban más, erős anti-lipáz aktivitással rendelkező vegyületek is jelen lehetnek és észrevétlenek maradhatnak. Vizsgálatunk egyik korlátja, hogy a növényi elúcióban néhány erős vegyület túl alacsony koncentrációban lehetett jelen, hogy el lehessen őket különíteni és azonosítani. Ennek a problémának a kezeléséhez szükség lehet a növényi gyógyszer összetett könyvtárának és a nagy áteresztőképességű szűrésnek a kombinálására.

Itt harmincöt hagyományos kínai gyógynövényt vizsgáltak meg az anti-lipáz aktivitás szempontjából. Ez az első jelentés, amely 20-at mutat (Sginsenozid Rg3 izolálva Panax notoginseng és honokiol elszigetelt Magnolia officinalis anti-lipáz aktivitással bír. Ennek és a korábbi vizsgálatoknak a megállapításai szerint 20 (S) -ginsenozid Rg3 és honokiol olyan vegyületek lehetnek, amelyek elhízásellenes tulajdonságokkal rendelkeznek. További vizsgálatok folynak a honokiol és a 20 (S) -ginsenozid Rg3 állatmodellekben.

1. táblázat: Különböző kínai gyógynövények PPL-gátló aktivitása.

Három mérést végeztünk elúciónként. Az adatokat átlag ± szórásként fejeztük ki (n = 3). A szűrés során alkalmazott elúciók végső koncentrációja 200 μg/ml volt.

2. táblázat: A PN-17-2 és az MO-19 ESI tömegelemzése.

Közzétételi nyilatkozat

A szerzőknek nem jelentenek összeférhetetlenséget. A szerzők felelősséget vállalnak a cikk tartalmáért és összetételéért.

Finanszírozási információk

A szerzők köszönetet mondanak a Nemzeti Tudományos és Technológiai Főprojekt-Kulcsfontosságú Új Gyógyszer-létrehozó és Gyártó Programnak (2013ZX09402203) a pénzügyi támogatásért.