A flavintartalmú monooxigenáz 3 genetikai változata megváltoztatja a lipidanyagcserét tojótyúkokban étrend-specifikus módon

Jing Wang, Cheng Long, Haijun Zhang, Yanan Zhang, Hao Wang, Hongyuan Yue, Xiaocui Wang, Shugeng Wu, Guanghai Qi

lipidanyagcserét

A Földművelésügyi Minisztérium Takarmánybiotechnológiájának fő laboratóriuma, Kínai Agrártudományi Akadémia Takarmánykutató Intézete, Peking 100081, Kína.

Idézet:
Wang J, Long C, Zhang H, Zhang Y, Wang H, Yue H, Wang X, Wu S, Qi G. Flavintartalmú monooxigenáz 3 genetikai variánsa megváltoztatja a tojótyúkok lipidmetabolizmusát étrend-specifikus módon. Int J Biol Sci 2016; 12 (11): 1382-1393. doi: 10,7150/ijbs.16472. Elérhető a https://www.ijbs.com/v12p1382.htm oldalon

Kulcsszavak: flavintartalmú monooxigenáz 3, trimetilamin, lipid metabolizmus, tojótyúk, genetikai variáns, diétás TMA prekurzor

A tojótyúkok ígéretes állatmodellt nyújthatnak a TMA anyagcsere útjának és annak változatos genetikai és környezeti tényezőkre adott válaszának tanulmányozására [19-21]. Csak a nem szinonim mutáció FMO3 c.984 A> T, amely a treonin szerinszubsztitúcióját okozza a csirke FMO3 329. aminosavánál (T329S), erősen összefügg a halszag szindrómával [19]. A repcemag (RM) a madarak gyakori takarmány-összetevője, de gazdag szinapinban, a TMA prekurzorában. A tojótyúkok TMA metabolizmusának terhelését és a halszag szindrómáját gyakran RM táplálása indukálja [21]. Itt nem célzott, magmágneses rezonancia (NMR) alapú metabolitprofilokat használtunk, hogy feltárjuk a genetikai variánsokkal összefüggő anyagcsere-mintákat két meghatározott táplálékkal etetett madarakban, amelyek különböző mennyiségű TMA-prekurzort tartalmaztak. Ezután RNS-szekvenálási (RNS-Seq) elemzést végeztünk, hogy azonosítsuk azokat a géneket vagy génutakat, amelyek a genetikai faktor által kiváltott metabolikus változás mögött állnak.

Genetikai variáns in FMO3 megváltoztatja a trimetilamin metabolizmusát a madaraknál

Kezdetben a T329S genetikai variáns hatását vizsgáltuk FMO3 a madarak TMA-metabolizmusáról. Tyúkokat használtunk FMO3 c.984 A> T (TT), valamint a homozigóta normális (AA) genotípusúak. Tekintettel arra, hogy mind a genetikai, mind az étrendi tényezők fontos szerepet játszanak a TMA anyagcserében, a tyúkoknak vagy kukorica-szójabab liszt-étrendet (SM) biztosítottunk, amely alacsonyabb TMA-prekurzort tartalmaz (25% (P = 0,023), míg az FMO aktivitás csökkenésének tendenciája (15%) TT tyúkokban nem volt statisztikailag szignifikáns (1d. Ábra).

Úgy tűnt, hogy a T329S mutáció a triglicerid és koleszterin szintézisének gátlását és a lipidek lebomlásának nagyobb stimulációját indukálja. A triglicerid és koleszterin szintézisében vagy szabályozásában részt vevő gének mRNS szintje, például a szterin szabályozó elemet megkötő fehérje 1 (SREBP1), acetil-CoA-karboxiláz-alfa (ACACA), acetil-CoA karboxiláz béta (ACACB) és 3-hidroxi-3-metil-glutaril-koenzim A-reduktáz (HMGCR) nem különböztek AA és TT tyúkok között. Az inzulin által indukált 2-es gén megemelkedett expressziója (INSIG2) az SREBP érésének csökkenésére és a HMGCR stabilizálására utal [29,30]. A mRNS szintje TRC8 és MC5R SM diétás körülmények között a T239S növelte. A TRC8 részt vesz a HMGCR szterinnel gyorsított ubikvitinálásában, az MC5R pedig közvetlen szerepet játszik a lipolízis elősegítésében és az újraészterezés visszaszorításában [31,32]. Ezzel párhuzamosan az intracelluláris koleszteril-észter (semleges koleszterin-észter-hidroláz 1) hidrolízisében részt vevő gének mRNS-szintje, NCEH1) és a zsírsav-β-oxidáció a peroxiszómában, például a hidroxi-szteroid (17-béta) dehidrogenáz 4 (HSD17B4), acil-CoA-oxidáz 2 (ACOX2) és 2,4-dienoil-CoA-reduktáz 1 (DECR1), magasabbak voltak a TT tyúkoknál.

A T329S fokozta a koleszterin és a triglicerid eliminálását a májból a sárgája vagy az epesav képződésén keresztül. A mRNS szintje ApoVLDL-II, ABCG5 és ABCG8, szignifikánsan magasabb expressziót mutatott a TT tyúkoknál, mint az AA tyúkoknál, amikor SM diétával etették. ApoVLDL-II, ABCG5 és ABCG8 részt vesznek a koleszterin és a triglicerid májból a petefészkekbe és az epe csatornába történő szállításában. De a T329S csökkentette a foszfolipid transzfer fehérje mRNS szintjét (PLTP), amelyek szerepet játszanak a foszfolipidek és a szabad koleszterin lipoproteinek közötti átadásában, és szorosan összefüggenek az érelmeszesedéssel [33]. Ezenkívül megnövekedett primer epesav-bioszintézist figyeltünk meg a TT tyúkok májában, amit az epesav-CoA: aminosav-N-aciltranszferáz megnövekedett mRNS-szintje bizonyít (BAAT), alfa-metilacil-CoA racemáz (AMACR), hidroxi-delta-5-szteroid-dehidrogenáz, 3 béta- és szteroid-delta-izomeráz 7 (HSD3B7), a szterin-hordozó fehérje 2 (SCP2) és az oldott anyag hordozóanyag-család 51, alfa-alegység (SLC51a).

Az FMO3 új közvetítője lehet a máj lipid anyagcseréjének. Az FMO3 lebontása csökkenti a máj és a plazma lipidszintjét az LDL receptor knockout egerekben [8], csökkenti a VLDL- és LDL-asszociált koleszterinszintet a máj inzulinreceptor-knockout egerekben [42], és korlátozza a máj oxiszterolok és koleszteril-észterek termelését a koleszterin- táplált egerek [9]. Ezzel szemben az FMO3 túlzott expressziója transzgénikus egerekben fokozta a máj és a plazma lipidszintjét [8,9]. Úgy tűnik, hogy az FMO3 lipid metabolizmusban betöltött szabályozó szerepe az étrendektől függ, különös tekintettel a TMA prekurzor elérhetőségének különböző szintjeire. Azoknál a madaraknál, akiket alacsonyabb TMA-prekurzor-szinttel tápláltak, a T329S a plazma TMA, a máj FMO3 mRNS, a máj koleszterin és a triglicerid szintjének emelkedését okozta. Ezzel szemben azoknál a madaraknál, amelyek magasabb TMA-prekurzor-szinttel táplálták és fokozott vakbél-TMA-termelést mutattak, a T329S mutáció elnyomást okozott az LXR út csökkenésében, de nem befolyásolta a plazma TMA tartalmát vagy az FMO3 mRNS szintjét. Feltételezzük, hogy a TMA szintek proximális jelként működhetnek az FMO3 expresszió modulációjában.

Az itt leírt vizsgálatok a T329S genetikai variánsát mutatták be FMO3 megváltozott TMA és lipid metabolikus válasz két meghatározott étrendre, különböző TMA prekurzor tartalommal. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az FMO az étrendtől függően működik a TMA metabolizmusban és a lipid homeosztázisban, továbbá azt is feltárja, hogy az LXR út és a PUFA metabolizmus részt vehet ebben a modulációban. Adataink azt is kimutatták, hogy a madarakban a genetikai és táplálkozási tényezők megváltoztatták a TMA metabolizmusának zavarait. Ez a megállapítás viszont összefüggést tár fel a xenobiotikus TMA metabolizmus és a lipid homeosztázis között, és azt is alátámasztja, hogy az FMO3 központi szabályozó csomópontot jelenthet a xenobiotikus anyagcsere és a lipidanyagcsere közötti esetleges áthalláshoz. Ezért ezeket az étrendi tényezőket és újszerű metabolikus hatásokat figyelembe kell venni, amikor a farmakológiai beavatkozást olyan eszköznek tekintik, amely a TMA-anyagcserét általában, vagy közvetlenül az FMO3-ot célozza meg. Ezek a megállapítások hozzájárulnak az FMO3 szabályozó szerepének szélesebb körű felismeréséhez, és támpontokat adhatnak a TMA prekurzorokban gazdag étrend és a genetikai variáns komplex kölcsönhatásának megértéséhez is. FMO3 más baromfifajoknál és emlősöknél.

Etikai nyilatkozat

A vizsgálat módszereit a Tudományos és Technológiai Minisztérium (Peking, Kína) által létrehozott, a kísérleti állatokra vonatkozó irányelveknek, valamint a Kínai Takarmánykutató Intézet laboratóriumi állatainak gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatóban ismertetett kritériumoknak megfelelően végezték el. Agrártudományi Akadémia (FRICAAS). Valamennyi állatkísérleti protokollt a FRICAAS Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá.

Madarak, étrendek és mintagyűjtés

Transzkriptikus profilalkotás

A 24 tyúk (csoportonként hat minta) mindegyikéből származó májmintákból Trizollal (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia) teljes RNS-t izoláltunk. A teljes RNS minőségét és koncentrációját 1,0% -os agarózgél-elektroforézissel és spektrofotometriás analízissel (NanoDrop 8000 spektrofotométer, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) mértük. Az RNS könyvtár építését és szekvenálását a Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd.-nél (Sanghaj, Kína) végeztük. A cDNS könyvtárakat a TruSeq RNS minta előkészítési útmutató (Illumina, San Diego, Kalifornia) nyomán készítettük el. A poli (A) mRNS-t tisztított teljes RNS-ből izoláltuk biotin-oligo (dT) mágneses gyöngyök felhasználásával, és fragmentáltuk a kapott

350 bp-t a cDNS-könyvtárak létrehozása előtt. A minőségellenőrzést Pico zöld fluoreszcencia spektrofotometriával és Agilent 2100 bioanalizátorral (Agilent Technologies, Palo Alto, Kalifornia) végeztük. Fürt keletkezett, 4-5 pM-re hígítottuk, és az Illumina NextSeq 500 rendszer segítségével párosított 2 × 150 bp-os leolvasással szekvenáltuk.

Kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR) elemzés

A csirkemáj könyvtárakból nyert RNS-Seq génexpressziós adatok reprodukálhatóságának és pontosságának igazolásához qRT-PCR-t hajtottunk végre a hat kiválasztott génen (S2. Ábra). A. Kifejezési szintjei FMO3 qRT-PCR-rel is meghatároztuk. Az ebben a vizsgálatban használt PCR-primereket az S4 táblázat tartalmazza. A valós idejű PCR-t az ABI Step-One Plus Real-Time PCR rendszer (ABI 2700, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia) alkalmazásával hajtottuk végre. A relatív génexpressziós szinteket normalizáltuk az endogén RNS kontroll glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenázhoz (GAPDH) a 2 -ΔΔ-valCT módszer [47].

Statisztikai analízis

Megfelelő szerzők: Shugeng Wu (wushugengcn) vagy Guanghai Qi (qiguanghaicn), Takarmánykutató Intézet, Kínai Agrártudományi Akadémia, 12 Zhongguancun Nandajie, Haidian, Peking 100081, Kína. Tel .: 86-10-82107317, Fax: 86-10-82106054.

Beérkezett 2016-6-14
Elfogadva 2016-9-4
Megjelent 2016-10-25