A hajdina levél- és virágkivonatok hatása az egérszervek antioxidáns állapotára

1 Idegtudományi Intézet, Litván Egészségtudományi Egyetem, Kaunas, Litvánia

2 Biokémiai Tanszék, Orvosi Akadémia, Litván Egészségtudományi Egyetem, Kaunas, Litvánia

3 Fogpótlási Tanszék, Orvostudományi Akadémia, Litván Egészségtudományi Egyetem, Kaunas, Litvánia

Absztrakt

Ezt a vizsgálatot a hajdina levél- és virágkivonatoknak az agy és a májszövet antioxidáns állapotára gyakorolt hatásainak vizsgálatára végezték. A hajdina kivonatok (mindkét koncentráció 10% volt) egereknek (10 ml/testtömeg-kg dózisban) 21 napig szignifikánsan csökkentette a szuperoxid-diszmutáz (SOD) aktivitását, és csökkentette a glutation (GSH) és a malondialdehid (MDA) mennyiségét ) az egér agyában, míg a kataláz (CAT) aktivitása jelentősen megnőtt. Az egér májában a GSH mennyisége és az SOD aktivitása nőtt, míg a hajdina levél és virág kivonatok beadása után a CAT aktivitás alacsonyabb volt a kísérleti egerekben, mint a kontroll csoportban. Azonban a 10% -os etanol (21 napig) beadása kontroll állatoknak szintén jelentős hatással volt az agy és a máj sejtjeinek antioxidáns rendszerére. A kísérleti állatok meglehetősen markáns változásokat mutattak ki a máj és az agy sejtjeiben a SOD és CAT antioxidáns enzimek aktivitásában, és a GSH és az MDA szintjének változását figyelték meg a kontroll csoporthoz képest.

1. Bemutatkozás

Hajdina (Fagopyrum esculentum Moench) a Polygonaceae családba tartozó lágyszárú növény. Ez a növény étrendi fehérjeforrásként ismert, aminosav-összetétele kedvező, rostjai, vitaminjai (B1 és B2), keményítő, esszenciális ásványi anyagok és nyomelemek találhatók [1–3]. A hajdina szemek és héjak biológiailag aktív komponenseket tartalmaznak, például flavonoidokat és flavonokat, tanninokat, fitoszterolokat és fagopirineket. A flavonoidok antioxidánsokként gátolják a lipidperoxidációt és csillapítják a reaktív oxigénfajok által okozott károsodásokat [4, 5]. Számos tanulmány kimutatta, hogy a hajdina erős antioxidáns aktivitással rendelkezik, főleg a magas rutintartalom miatt [6, 7]. A hajdina flavonoidjai csökkentik a vér koleszterinszintjét, segítenek megelőzni a magas vérnyomást. A flavonol-kvercetinből és diszacharid-rutinózból álló rutin gyulladáscsökkentő és vérnyomáscsökkentő hatású. Ezenkívül a rutin/kvercetin gátolja a lipoproteinek oxidációját, ami arra utal, hogy a rutin csökkenti az arteriosclerosis kockázatát [8]. Meg kell jegyezni, hogy a virágrész rutintartalma magasabb, mint a hajdina többi része - levél, mag vagy gyökér. A rutin (száraz tömegre számítva) körülbelül 10% -a található a hajdina virágában és a levelében [5].

Jelen tanulmányt a hajdina virág- és levélkivonatok, valamint a kivonatok előállításához használt etanol hatásának értékelésére tervezték a máj és az agy sejtjeinek antioxidáns rendszerére.

2. Anyagok és módszerek

2.1. A kutatás tárgya

2.2. Növényminták előkészítése

Hajdina Fagopyrum esculentum A kísérleteink során használt Moench („VB Noja”, Litvánia származású) levél- és virágkivonatokat a Litván Egészségtudományi Egyetem Analitikai és Toxikológiai Kémiai Tanszékétől szereztük be. A légrészek szárított hajdina mintáit GM 300 laboratóriumi malomban (Retsch, Németország) őröltük. Ezt követően 1 g kapott port optimalizált extrakciós körülmények között 10 ml 96% -os etanollal extraháltunk ultrahangos fürdőben 15 percig 45 ° C-on. Az extraktumot ezután 10 percig 6000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk, amelyet felülúszó gyűjtése követett. A mintákat membránszűrőn (0,22 pórusméret) szűrjük μm).

Hajdina levél és virág kivonat beszállítóink adatai [10] és az irodalom [6, 11–14] alapján biológiailag aktív vegyületeket azonosítottak a hajdina levél és virág kivonatokban. A vegyületek és koncentrációik felsorolását az 1. táblázat tartalmazza.

2.3. A GSH mennyiségének mérése egérszervekben

A GSH-tartalmat Bernotiene és munkatársai által leírt módszerrel értékeltük. [15]. Az eltávolított egér agyat/májat lemértük és 6 térfogatban (a szövetek tömegéhez viszonyítva) 5% triklór-ecetsav-oldattal homogenizáltuk. A homogenizátumot 10 000 x g sebességgel 7 percig centrifugáltuk, hogy megkapjuk a GSH-tartalmú felülúszót. A GSH-t a reakcióval mértük DTNB (más néven Ellman reagensnek vagy 5,5

-ditiobisz (2-nitrobenzoesav)) vegyületet képez, amely 412 nm hullámhosszúságú fényt nyel el. Minden mintaküvetta 2 ml 0,6 mM DTNB-t tartalmazott 0,2 M nátrium-foszfátban, pH 8,0; 0,2 ml felülúszó frakció; és 0,8 ml 0,2 M foszfátpuffer 3 ml végtérfogatig. A GSH-tartalmat μmol/g a szövet nedves tömegének.

2.4. Az MDA mennyiségének mérése egérszervekben

A lipidperoxidáció végterméke, az MDA, komplexet képez a TBA-val (tiobarbitursav), és annak tartalma spektrofotometriásan meghatározható; az eredményeket a szövet nedves tömegének nmol/g-ban fejezzük ki [15]. Az agyat/májat eltávolítottuk, és 9 térfogat (a szövetek tömegéhez viszonyítva) hideg, 1,15% KCl-val homogenizáltuk, így 10% homogenizátumot kaptunk. Ezt követően 3 ml 1% H3P04-et és 1 ml 0,6% TBA vizes oldatot adtunk 0,5 ml e homogenizátumhoz. Az elegyet 45 percig forraljuk forrásban lévő vízfürdőben. Lehűlés után 4 ml n-butanolt adunk hozzá, és a kapott elegyet erőteljesen keverjük. A butanol fázist centrifugálással elválasztottuk, és a felülúszó abszorbanciáját 535 és 520 nm hullámhosszon határoztuk meg.

2.5. CAT tevékenységvizsgálat

A CAT aktivitást az agy és a máj homogenizátumaiban Sadauskiene és munkatársai által leírt módszerrel határoztuk meg. [16]. A módszer a hidrogén-peroxid (H2O2) CAT általi lebontásán alapul. A reakcióelegy 50 mM Tris-HCl-puffer (pH 7,4), 18 mM H2O2 (puffer-szubsztrát keverék) és 100 m μL szervhomogenátum. A reakcióelegyet 37 ° C-on inkubáltuk 180 másodpercig. Az enzimatikus reakciót 2,0 ml 4,5% -os ammónium-molibdát-oldattal leállítottuk, és a sárga molibdát- és hidrogén-peroxid-komplex abszorbanciáját 410 nm hullámhosszon mértük vakon (puffer-szubsztrát keveréket 180 s-ig inkubáltuk, majd hozzáadtunk ammónium-molibdátot és 100 ml-t). μL a homogenátumból). Az eredményeket U/mg fehérjében fejeztük ki. A kataláz (U) egy egysége elbontja 1-et μmol hidrogén-peroxid/1 perc ilyen körülmények között.

2.6. SOD aktivitásvizsgálat

A szuperoxid-diszmutáz aktivitását az agy homogenátumában Rachmanova és munkatársai által leírt módszerrel értékeltük. [17]. A SOD aktivitás spektrofotometriai értékelése a nitroblue tetrazolium (4-nitroblue tetrazolium chloride, NBT) redukciós sebességének gátlásán alapul a nonenzimatikus fenazin-metoszulfát-nikotinamid-adenin-dinukleotid rendszerben. Először 0,1 M foszfátpuffert (pH 7,8), 0,41 mM NBT-t, 0,33 mM EDTA-t (etilén-diamin-tetraecetsav), 0,01 mM PMS-t (fenazin-metoszulfát) és 0,8 mM NADH-t tartalmazó reakcióelegyet készítettünk. A reakció megindításához kiválasztott mennyiségű agyi homogenizátumot adunk ehhez a keverékhez. Spektrofotométerrel mértük az optikai sűrűséget 540 nm-en -

(kezdeti kihalás). 5 perc elteltével ismét megmértük az optikai sűrűséget - ECB (kihalás 5 perc után). A SOD-aktivitást U/mg fehérjében fejeztük ki, ahol U relatív aktivitási egység volt, amelyet az NBT-csökkentés 50% -os gátlásához szükséges SOD mennyiségeként határoztak meg, és aktivitásegységként fejezték ki 1 mg fehérjemintában.

2.7. Fehérjekoncentrációs vizsgálat

Az agy és a máj homogenizált mintáinak fehérjekoncentrációját Warburg-Christian módszerrel mértük.

2.8. Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM-ben fejeztük ki (az átlag standard hibája). A statisztikai szignifikanciát egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) és a párosítatlan Student alkalmazásával értékeltük

-teszt. Az értéke

statisztikailag szignifikánsnak tekintették (SPSS 19.0 verzió, SPSS).

3. Eredmények

A CAT és SOD aktivitásának adatait a kontroll és a kísérleti állatok szöveteiben az 1–4. A CAT aktivitás az egerek agyában etanol kiegészítéssel (2. kontroll) szignifikánsan nagyobb volt, mint a kontroll egereké (1. kontroll). A hajdina levél- és virágkivonatokkal kezelt állatokban a CAT aktivitása az agyban is magasabb volt, mint az 1. kontrollcsoportban (1. ábra). Eközben az etanolt (2. kontroll) és a hajdina virág kivonatot kapott egerek májának CAT aktivitása szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az 1. kontroll állatoké (2. ábra). Csak a hajdina levélkivonat nem okozott változásokat a máj aktivitásában a májban az 1. kontrollcsoporthoz képest.

, összehasonlítva az 1. kontrollcsoporttal.

Az etanolt (2. kontroll), valamint a hajdina levél- és virágkivonatokat kapott egerek agyában a SOD aktivitása szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az 1. kontrollcsoportban (3. ábra). Eközben ez a aktivitás a vizsgált kivonatokkal kezelt egerek májában jelentősen megnőtt (4. ábra). Ebben az esetben azonban a 2. kontrollcsoport SOD aktivitása megegyezett az 1. kontrollcsoportéval.

További kísérletekben értékeltük a hajdina levél- és virágkivonatok hatásait a kísérleti egerek agyában és májában a GSH és az MDA koncentrációjának csökkenésére. A szöveti GSH és MDA koncentrációit a kontroll és kísérleti állatokban a 2. táblázat tartalmazza.

GSH (μmol/g szövet)		MDA (nmol/g szövet)
Csoportok	Agy	Máj	Agy	Máj
1. vezérlés	2,4 ± 0,06	4,5 ± 0,35	106 ± 2,35	71 ± 2,98
2. vezérlés	1,18 ± 0,02

, összehasonlítva az 1. kontrollcsoporttal.

A kapott eredmények azt mutatták, hogy a hajdina kivonatot kapott egerek agyában a GSH koncentrációja szignifikánsan alacsonyabb volt. Az agyban a GSH koncentráció alacsonyabb volt azoknál az egereknél is, akiknek csak etanolos oldatot adtak be (2. kontroll). A kísérleti egerek májának GSH-koncentrációja azonban magasabb volt, mint az 1. kontroll egereké. A kísérleti állatok agyában az MDA szint alacsonyabb volt, mint az 1. kontrollcsoporté. A máj MDA szintje azonban nem változott a hajdina levél- és virágkivonatokkal kezelt egerekben a kontrollokkal összehasonlítva (1. kontroll). Eközben azoknak az egereknek a májában, amelyek csak etanolt kaptak (2. kontroll), az MDA szintje szignifikánsan magasabb volt, mint az 1. kontroll csoportban.

4. Megbeszélés

4.1. A hajdina virág- és levélkivonatok hatása az egér agy és máj SOD és CAT aktivitására

A SOD-t és a CAT-t „az első védelmi vonalnak” nevezik az antioxidáns rendszerben. Ezek az enzimek szinte minden oxigénnek kitett élő szervezetben megtalálhatók. A SOD egy olyan enzim, amely felváltva katalizálja a szuperoxid gyök (O - 2) molekuláris oxigénné vagy hidrogén-peroxiddá (H2O2) történő diszmutációját, míg a CAT a hidrogén-peroxid vízben és oxigénben történő bomlását katalizálja [24]. Mindkét enzim nagyon releváns a test sejtjeinek megvédésében a reaktív oxigénfajok által okozott oxidatív károsodásoktól [25]. Másrészt a sejtes antioxidáns rendszer mindkét enzime az oxidatív stressz legfontosabb biomarkerei közé tartozik. Emiatt annak érdekében, hogy meghatározzuk az agy és a máj sejtjeinek antioxidáns rendszerét az egerek hajdina virág- és levélkivonatokkal történő kezelését követően, úgy döntöttünk, hogy értékeljük a SOD és CAT aktivitást az egér agy és máj homogenátumaiban.

Kiértékeltük az antioxidáns rendszer egy másik enzimének, a CAT-nak a változásait ugyanezen kísérleti körülmények között. Az értékelés eredményei azt mutatták, hogy minden esetben a CAT aktivitás az egér agyában szignifikánsan megnőtt a kontroll 1 egerekhez képest (22,88 ± 1,98 U/mg fehérje). Tehát a CAT-aktivitás az egerek agyában, akiknek BL-t adtak, akár 201% -ra (68,97 ± 12,32 U/mg fehérje) és BF-et kapott egerekben 126% -ra (51,77 ± 7,90 U/mg fehérje) növekedett. A CAT-aktivitás nagyon hasonló növekedését (186%, 65,51 ± 10,58 U/mg fehérje) figyelték meg azoknak az egereknek az agyában is, amelyek csak etanol-oldatot kaptak. Eközben a kísérleti egerek májában teljesen más változásokat figyeltek meg a CAT aktivitásában. Itt egyes esetekben a CAT aktivitás tendenciája csökkent (statisztikailag megbízhatóan). Így a BF-et kapott egerek májának CAT-aktivitása 669,50 ± 36,95 U/mg fehérje volt, azaz alacsonyabb (−21%), mint a normál (851,08 ± 5,74), míg az etanolos oldatot kapott egereknél a csökkenés az enzim aktivitásában 28% volt (613,59 ± 41,33 U/mg fehérje). Vizsgálatunkban csak a BL nem volt hatással a CAT aktivitásra, amely 811,77 ± 17,95 U/mg fehérje volt.

Megjegyezzük azt a tényt, hogy a hajdina levél kivonat és az etanol oldat hatása alatt bekövetkező CAT aktivitás változásai gyökeresen különböztek a különböző szervekben (ebben az esetben az agyban és a májban). Ezenkívül különös jelentőséggel bír az a tény, hogy ugyanazon szervek sejtjeiben a gyakorlatilag azonos vonalú enzimek, a SOD és a CAT teljesen más trendeket mutatnak be az aktivitásban. Például, míg a SOD aktivitás az egér agyában egyértelműen csökkent a kísérleti készítmények hatására (beleértve az etanolos oldatot a 2. kontroll egerekben), addig a CAT aktivitás nőtt. Ugyanez a kép volt megfigyelhető a kísérleti egerek májában is, csak ebben az esetben a helyzet ellentétes volt: míg a SOD aktivitás nőtt, a CAT aktivitás csökkent. A máj esetében két kivételt kell megemlíteni: az etanolos oldat beadása nem volt hatással a SOD aktivitására, míg a CAT aktivitását a hajdina virág kivonat beadása szinte nem befolyásolta.

4.2. A hajdina virág- és levélkivonatok hatása az egerek agyában és májában a GSH és az MDA mennyiségére

A GSH szintek kiértékelésével együtt értékeltük a kísérleti egerek agy és máj MDA szintjének változását. Az MDA a lipidperoxidáció végtermékeként ismert, és a testsejtekben az oxidációs folyamat jelentős markerének számít. Eredményeink azt mutatták, hogy a 21 napig BL-t és BF-et kapott egerek agyában az MDA-szint statisztikailag megbízhatóan csökkent, összehasonlítva az 1. kontrollcsoport egereivel. A BL-t kapott egerek agyában az MDA szint 32% -kal csökkent, míg a BF-et kapott egerek agyában 50% -kal csökkent. Figyelemre méltó, hogy az MDA szintje egyértelműen (–52%) csökkent a 2. kontrollcsoport egereinek agyában, vagyis azokban, amelyek csak etanolos oldatot kaptak. Eközben a BL-t és BF-et kapott egerek MDA-szintje gyakorlatilag változatlan maradt, összehasonlítva az 1. kontroll egerekkel. Azonban a kontroll 2 egerek (azok, akik csak alkoholos oldatot kaptak) májának MDA-szintje statisztikailag megbízhatóan, 22% -kal nőtt a kísérlet megkezdése óta eltelt 21 nap után.

Így általánosságban a kísérletünk során kapott eredmények azt mutatták, hogy a BL és BF készítmények befolyásolták az egér szerv (agy és máj) sejtek redox állapotát. A kísérlet 21 napja után egyértelmű tendenciát figyeltünk meg, jelezve, hogy a vizsgált készítmények gátolták az SOD enzim aktivitását, és csökkentették a GSH és az MDA mennyiségét az egér agysejtjeiben. A hajdina készítmények ezen hatását az irodalom is említi [27]. Vizsgálatunk eredményei azonban azt mutatták, hogy az etanol-oldat (a kivonatok alapja) beadása egereknek gyakorlatilag azonos hatást fejtett ki. Míg az SOD-aktivitás gátlására és a GSH-szint csökkenésére alkohol hatása alatt található adatok megtalálhatók az irodalomban [28, 29], a kísérletünk során megfigyelt MDA-szint csökkenés ellentmondani látszik az irodalmi adatokkal. Ezenkívül a CAT aktivitásának változásai az egér agyában szintén ellentmondottak az általános trendnek. Ennek az enzimnek az aktivitása az összes kísérleti csoportban szignifikánsan megnőtt.

A kísérleti állatok májában ellentétes változásokat figyeltek meg. Itt a SOD aktivitás és a GSH szint emelkedett, míg az MDA szintek gyakorlatilag változatlanok maradtak (kivéve a 2. kontroll csoportot, ahol 22% -kal nőttek az 1. kontroll csoporthoz képest). A májban, mint az agyban, a CAT enzim ellentétes tendenciákat mutatott - aktivitása csökkent (kivéve a BL-t kapott állatok csoportját): a BF csoportban 21% -kal, a 2. kontrollcsoportban 28% -kal esett vissza.

Figyelembe kell azonban venni a kizárólag etanolos oldattal (2. kontrollcsoport) kapott eredményeket. Gyakorlatilag minden esetben ez a megoldás befolyásolta a vizsgált enzimek aktivitását (SOD és CAT), valamint a GSH és az MDA koncentrációját mind a kísérleti egerek agy-, mind májsejtjeiben; az esetek többségében ennek a reagensnek a hatása hasonló volt a BL és a BF hatásához. Ez azt jelzi, hogy a botanikai kivonatok hatásmechanizmusa a szervsejtek oxidációs rendszerén nemcsak az extraktumokban található biológiailag aktív anyagok (jelen esetben BL és BF), hanem az extraktum alapja, az etanol is lehet. Így ezen a területen további vizsgálatoknak figyelembe kell venniük az extraktum egyes komponenseinek, különösen az etanolnak a szervsejtekben létfontosságú folyamatokra gyakorolt hatását.

5. Következtetések

Vizsgálatunkból kiderült, hogy a hajdina virág- és levélkivonatok ismételt beadása hatással volt a szuperoxid-diszmutáz és a kataláz enzimatikus aktivitására az egerek agyában és májában. Kimutatták az etanol stimuláló hatását mindkét enzim aktivitására a kísérleti egerek szerveiben is.

Adatok elérhetősége

A vizsgálat eredményeinek alátámasztására használt adatok kérésre a megfelelő szerzőtől állnak rendelkezésre.

Összeférhetetlenség

A tanulmány szerzői kijelentik, hogy nincsenek összeférhetetlenségük.

Köszönetnyilvánítás

A cikk szerzői köszönetet mondanak a Litván Egészségtudományi Egyetem Analitikai és Toxikológiai Kémia Tanszékének vezetőjének, Liudas Ivanauskas professzornak a tanulmányban használt hajdina virág és levél kivonatok biztosításáért.