A hőkezelt, magas zsírtartalmú étrend módosítja a bél mikrobiotáját és az anyagcsere markereit az apoe -/- egerekben

Absztrakt

Háttér

A magas zsírtartalmú étrendről ismert, hogy káros hatással van az anyagcsere markerekre, valamint a bél mikrobiotájára. A magas zsírtartalmú étrend hőkezelésének hatását, amely fejlett glikációs végtermékek (AGE) képződéséhez vezet, azonban nem különítették el egyértelműen a fűtetlen zsírok hatásától. Ez a tanulmány összehasonlította a magas zsírtartalmú étrend és a hőkezelt magas zsírtartalmú étrend hatását a zsírégetés, az érelmeszesedés és a bél mikrobiota összetételére a apoe -/- egerek.

Módszer

Férfi apoe -/- az egereket alacsony zsírtartalmú (LF) kontroll diétával, magas zsírtartalmú (40 E% telített zsír, HF) kontroll diétával vagy hőkezelt magas zsírtartalmú (200 ° C-on 10 percig, HT) táplálékkal etették 8 hétig . A plazmamintákat az Nε-karboxi-metil-lizin (CML) és az Nε-karboxi-etil-lizin (CEL) elemzéséhez használtuk. A szívmintákból ateroszklerotikus plakkokat elemeztünk, és a vakbélből származó DNS-t kivontuk, és Miseq eszközön 16S rRNS génszekvenálást használva elemeztük mikrobiota összetételét. Ezenkívül a mikrobaközösségek funkcióit a baktériumok 16S rRNS génszekvenciája alapján is megjósolták, felhasználva a közösségek filogenetikai vizsgálatát megfigyeletlen állapotok rekonstrukciójával (PICRUSt).

Eredmények

Itt azt tapasztaltuk, hogy a HT módosítja a bél mikrobiota összetételét és a gazda zsírosságát. A bakteriális génfunkciók 16S rRNS génszekvencia alapján történő megjósolása azt mutatta, hogy a HF megnövelte a lipid metabolizmus génjeiben gazdag baktérium nemzetségeket, míg a HT nem. A plazma CML és a CEL 1,7, illetve 2,5-szeresére nőtt a HT-vel táplált egerekben a HF-et tápláló egerekhez képest. Az alacsony zsírtartalom ellenére a HT-vel táplált egereknél fennmaradt az érelmeszesedés és megnagyobbodott lépek voltak.

Következtetések

Az eredmények arra utalnak, hogy a magas zsírtartalmú étrend hőkezelése módosítja a szubsztrátumokat, amelyek eljutnak a bél alsó részébe apoe -/- egerek, amelyek eltérő hatással vannak a bél mikrobiota összetételére. Úgy tűnik, hogy az AGE-k az alacsony zsírtartalom ellenére fenntartják az érelmeszesedésre gyakorolt hatást, és megnagyobbodott lépeket okoznak, amelyek valószínűleg a szervezet gyulladásának magas szintjét tükrözik.

Háttér

A modern étrend magában foglalja az ételek hőfeldolgozását, ami Maillard reakciótermékek (MRP) képződéséhez vezet. Ezek a termékek felelősek a feldolgozott élelmiszerek aromájáért, színéért, ízéért és állagáért, valamint a tápérték romlásáért és az egészségre gyakorolt káros hatásokért [1, 2]. A közelmúltban nagyobb figyelmet fordítottak a Maillard-reakciótermékek egészségre gyakorolt hatására, különösen azokra, amelyek az aminosavak, peptidek és fehérjék visszafordíthatatlan módosulásához vezetnek; fejlett glikációs végtermékek (AGE) [3–6]. Az AGE-ket javasoljuk társítani a gyulladás által közvetített kóros állapotok kockázati markereihez; mint például a szív- és érrendszeri betegségek, az Alzheimer-kór és a cukorbetegséghez kapcsolódó szövődmények [5, 7–12]. Az AGE-k által kiváltott toxicitás mechanizmusa közvetíthető az AGE-receptorokhoz való kötődés (RAGE) és a gyulladásgátló kaszkád indukálása révén [8, 13, 14], és ebből következően a kapcsolódó kóros állapotok. A fehérje szerkezetét befolyásoló keresztkötések képződése szintén befolyásolhatja az emészthetőséget, és így a módosított fehérjék eljuthatnak az alsó bélbe, ahol a bél mikrobiotája fermentálhatja őket [15].

A bél mikrobiota szorosan részt vesz a gazdaélettan számos aspektusában. A bél mikrobiota összetételének általános egyensúlya fontos kulcsfontosságú tényező a gazda normális működésének biztosításában [16]. Számos tanulmány kimutatta, hogy a bél mikrobiota vagy bizonyos baktériumcsoportok jelenléte vagy hiánya számos betegség kialakulásához járul hozzá, például a 2-es típusú cukorbetegséghez [17, 18], az artherosclerosishoz [19, 20] és a szisztémás gyulladásos válasz szindrómához. [21]. A bél mikrobiota összetételéről köztudottan az alsó bélbe jutó étrendi összetevők befolyásolják. Eddig a fehérjék folyamatok által kiváltott szerkezetváltozásának szerepe az emészthetőségen és a bél mikrobiota általi lehetséges metabolizmusán olyan terület, amelyet nagyrészt nem fedeztek fel.

Mód

Kísérleti terv

Férfi apoe -/- a hetes korú egereket (Scanbur AB, Karlslunde, Dánia) a kísérlet megkezdése előtt 2 hétig adaptáltuk a környezethez az állattartó létesítményben. 8 hetes korban az egereket véletlenszerűen három súly-egyeztetett csoportra osztották (n = 10, öt egér/ketrec). Az egereket alacsony zsírtartalmú (LF) kontroll diétával, magas zsírtartalmú (HF) kontroll étrenddel vagy hőkezelt magas zsírtartalmú (HT) táplálékkal etették. A HF és a HT képe az 1. kiegészítő fájlként érhető el: S1 ábra. Az egereket hetente lemértük. 8 hét elteltével az egereket izofluoránnal altattuk (Abbott Scandinavia AB, Solna, Svédország), és ezeket szívszúrással állítottuk le. A májat, a lépet és az epididymális zsírpárnákat lemértük. A vérplazmát, a szívet és a vakbélet összegyűjtöttük és -40 ° C-on lefagyasztottuk a további elemzésekig. A plazmamintákat használtuk a CML és a CEL elemzéséhez. A szívmintákból ateroszklerotikus plakkokat vizsgáltunk, majd a vakbélből származó DNS-t kivontuk és mikrobiota-összetételre elemeztük 16S rRNS-gén szekvenálással Miseq eszközön.

Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia tandem tömegspektrometriával összekapcsolva a CML és a CEL meghatározásához

A plazmamintákat (50 μL) 12 órán át 110 ° C-on hidrolizáltuk 6 M HCl alkalmazásával, belső standardként d4-CML és d4-CEL izotóppal (Larodan Fine Chemicals AB, Malmö Svédország) együtt, és nagynyomású elemzéssel elemeztük. folyadékkromatográfia tömegspektrometria (HPLC-MS/MS). A CML és a CEL kromatográfiás elválasztását a hidrolizált mintákban Accela UHPLC szivattyúval, automatikus injektorral hajtottuk végre. A detektálást LTQ VelosPro Orbitrap tömegspektrométerrel (Thermo Scientific, Waltham, USA) végeztük, pozitív elektrospray ionizációs ioncsapda tandem tömegspektrometriás (MS/MS) módban, két szelektív reakciómonitoros (SRM) átmenetet detektálva minden elemzőnél, és belső alapértelmezett. Az Xcalibur szoftvert (Thermo Scientific) mind az adatgyűjtéshez, mind az értékeléshez használták. A szilárd fázisú extrakció, a kromatográfiai paraméterek, az ionforrás paraméterei és az SRM átmenetek megegyeznek Tareke E. és mtsai. [25].

Az érelmeszesedés számszerűsítése

A szív aortagyökér-régiójának fagyasztott 10 μm-es szakaszait készítettük kriosztát segítségével (Leica CM 1950, Leica Biosystems, Nusslock, Németország), és olajvörös O-val (Histolab, Göteborg, Svédország) és haematoxilinnel (Mayer's HTX, Histolab, Göteborg, Svédország). Az érterületet borító ateroszklerotikus plakkok mennyiségét egy elvakult megfigyelő számszerűsítette BioPixQ 2.0 (Biopix szoftver, Göteborg, Svédország) alkalmazásával. Három szekciót/egér, jól orientált gyökérterületekkel és mindhárom szelepcsúcs jelenlétével értékeltünk.

A vakbél mikrobiota összetétele

Összesen 22 vakbélminta (LF (n = 4), HF (n = 8), HT (n = 9)) használtuk a mikrobiota analízis során. A vakbélszövetet és annak tartalmát jégen felolvasztjuk, és a DNS-t QIAamp DNS Stool Mini Kit (Qiagen) alkalmazásával extraháljuk egy gyöngyverési lépés hozzáadásával. Steril üveggyöngyöket (1 mm) adtunk a széklet lízis pufferjével kombinálva, és a sejtek lebontását 2 × 2 percig 25 Hz-en hajtottuk végre TissueLyser (Qiagen) alkalmazásával, majd 95 ° C-on 5 percig tartó melegítési lépést. Lízis után a DNS-károsító anyagokat és a PCR-inhibitorokat eltávolítottuk InhibitEX tabletta segítségével (a készlethez mellékelve), és a DNS-t QIAamp Mini centrifugális oszlopokon tisztítottuk. 5 ng/μl DNS normalizált bemenetét használtuk PCR reakciókban, ahol a szekvenálás előtt 16S rRNS géneket amplifikáltunk.

Bakteriális metagenómák előrejelzése a PICRUSt segítségével

A bakteriális metagenómákat a bakteriális 16S rRNS génszekvencia alapján rekonstruáltuk a nyílt forráskódú szoftver, a PICRUSt segítségével [24]. A 16S szekvenálási adatokból QIIME-ben előállított OTU táblázatot mintánként 67 817 ritkított szekvenciával alkalmaztuk. Az OTU-ként elért példányszám normalizálódott, mielőtt a metagenómot megjósolták volna a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) adatbázis felhasználásával [29]. A metagenóma-előrejelzés eredménye az egyes minták előrejelzett géncsaládszámának kommentált táblázata volt, ahol a géncsaládokat KEGG Orthology (KO) azonosítókkal csoportosították.

statisztikai elemzések

Az egyirányú varianciaanalízist (ANOVA) alkalmazták a metabolikus markerek különbségének kiszámításához a különböző egércsoportokban, a Graphpad Prism 6 alkalmazásával. A közösségen belüli gazdagság (α-diverzitás) különbségeit QIIME-ban számítottuk nem-parametrikus t-teszt és a P-az értékeket több összehasonlításra korrigáltuk a False Discovery Rate (FDR) korrekcióval [30]. A mintacsoportok közötti közösségi összetételbeli különbségeket (β-diverzitás) a nem-parametrikus hasonlóság-analízis (ANOSIM) [31] statisztikai teszttel elemeztük QIIME-ban mind súlyozatlan, mind pedig súlyozott Unifrac filogenetikai mutatókon. A Graphpad Prism 6-ot szintén alkalmazták az egerek csoportjai közötti taxonómiai eloszlások szignifikáns különbségeinek azonosítására a menedék és a nemzetség szintjén, kétirányú ANOVA és Holm-Sidak korrekciós módszerrel, több összehasonlítás céljából. Az összes különbséget jelentősnek ítélték meg a P

Eredmények

Biomarkerek

Figyelembe véve, hogy nincs különbség az egerek táplálékfogyasztásában a különböző csoportokban (1a. Ábra), a HF-vel táplált egerek testtömege szignifikánsan magasabb volt a végpontban, mint az LF-et tápláló egerekben (P 1. ábra

Mikrobiális diverzitás indexek

A bakteriális 16S rRNS gén α-sokféleségének megbecsülése 67 817 szekvencia/minta szekvenciaszámmal (2a. Ábra) azt mutatta, hogy a HF-nek az LF-hez képest tendenciája volt az α-diverzitás csökkenésére. Sőt, a HT még jobban csökkentette az α-diverzitást, mivel a megfigyelt OTU-k és a filogenetikai sokféleség egész fa (PD teljes fa) indexei szignifikáns különbségeket mutattak a HT és az LF között (P 2. ábra

LF, HF és HT táplált egerek sokféleségi mutatói és eloszlása a bél mikrobiota törzs- és nemzetségszintjén. a Alfa ritkasággörbe (egész fa PD) a közösségen belüli gazdagságban (α-diverzitás) mutat különbségeket. b Súlyozatlan és c Súlyozott UniFrac PCoA diagramok mutatják a közösség összetételének különbségeit az egércsoportok között (β-diverzitás). d A bélmikrobiota viszonylagos bősége a menedékhelyen. e A legtöbb bőségű nemzetségek relatív bősége (> 5% relatív bőség). 67 817 szekvenciára/mintára normalizált olvasmányok

Menekültügyi szintű taxonómiai elosztások

A viszonylagos bőség a menekültügyi szinten (2d. Ábra) feltárta, hogy a Firmicutes-t találták a legdominánsabb törzsnek az összes csoportban, és a Bacteroidetes követte őket. A Firmicutes szintje szignifikánsan magasabb volt HT-ben, mint az LF és a HF (mindkettő P 3. ábra

A baktérium taxonok LDA pontszámdiagramja (a) és gének (b), amelynek LDA pontszáma magasabb, mint 2. A baktérium taxonok és az LF-ben dúsított gének vannak sárga, HF be kék és HT be piros

A gének funkcionális szerkezetének előrejelzése a 16S géninformációk alapján PICRUSt alkalmazásával

Ezenkívül az LF-ben dúsított gének részt vettek a genetikai információkban, különösen a kromoszóma replikációjában és helyreállításában, a riboszóma biogenezisében és egy osztályozatlan transzlációs fehérjében. A HF-ben dúsított gén részt vett a sejtes folyamatokban, különösen a sejtek növekedése és pusztulása szempontjából, a HT-ben dúsított gén pedig egy osztályozatlan funkcióban vett részt (3b. Ábra).

Bél mikrobiota és metabolikus biomarkerek

Betöltés és pontszóródás (4. ábra) A PLS-ábrák a bél mikrobiota és a különböző biomarkerek közötti összefüggéseket illusztrálták, valamint különféle kezelésekkel különálló egércsoportokat tártak fel (4. ábra, kis panel). Az eredmények alátámasztották azokat az LEfSe eredményeket (3a. Ábra és 2. kiegészítő fájl: S2. Ábra), ahol a különböző kezelési csoportokban dúsított baktériumok a PLS-diagram megfelelő területén helyezkedtek el (4. ábra). Sutterella, Anaeroplasma, Adlercreutzia és Lactobacillus amelyekről kiderült, hogy LF-ben dúsítottak, a PLS-telek alsó komponensében helyezkedtek el. Mucispirillum és Lactococcus HF-ben dúsítva a jobb felső komponensben helyezkedtek el, míg Allobaculum a PLS-telek bal felső elemében található. A bél mikrobiota és a különböző biomarkerek közötti összefüggéseket is elemeztük. Megállapították, hogy a relatív léptömeg pozitív összefüggésben van a lépvel Dehalobacterium (P 4. ábra

Betöltés (nagy panel) és pontszám szórás (kis panel) PLS-ábrák, amelyek összefüggéseket mutatnak a bél mikrobiotája és a különböző biomarkerek között. A baktérium nemzetségeket kis körökben mutatjuk be, és az általuk képviselt állomány (zöld, Actinobaktériumok; sötétkék, Bacteroidetes; piros, Cianobaktériumok; sárga, Deferribacteres; világoskék, Firmicutes, lila, Proteobaktériumok; narancssárga, Tenericutes; rózsaszín, Verrucomicrobia). Az anyagcsere biomarkereit fekete csillagok mutatják. A pontszám-szórási diagramban (kis panel) minden kör az egeret ábrázolja, és az a csoport színezi, amelyhez tartozik (sárga, LF; kék, HF; piros, HT)

Vita

Következtetések

Összegzésképpen elmondható, hogy a magas zsírtartalmú étrend bevitele fokozott zsírbetegséghez, csökkent mikrobiota sokféleséghez és megváltozott bél mikrobiota összetételhez vezetett. Úgy tűnt, hogy a magas zsírtartalmú étrend hőkezeléssel végzett kémiai módosítása csökkenti a lipid metabolizmus génjeivel rendelkező bél mikrobiota tagjai számára rendelkezésre álló szubsztrátumokat, ami alacsonyabb zsírtartalmat eredményez. A bél mikrobiota általános változásai azonban továbbra is az elhízás kockázati tényezőihez kapcsolódó változások felé mutatnak. Ezenkívül a HT-ben képződött AGE-k a lép megnagyobbodásának egyik lehetséges okát jelenthetik, amely valószínűleg a gyulladás megemelkedett szintjét tükrözi a szervezetben. A metabolikus szindróma diétás megelőző megközelítésének kidolgozása során figyelembe kell venni a hőkezelt élelmiszerek alacsonyabb bevitelét.

Etikai jóváhagyás

A vizsgálatot a svédországi Lundban, az állatkísérletekkel foglalkozó helyi etikai felülvizsgálati bizottság hagyta jóvá (jóváhagyási szám: M-295-12).